酶法製備d－酪氨酸的方法

2023-07-31 07:25:16 2

專利名稱：酶法製備d－酪氨酸的方法
技術領域：
本發明是一種手性有機化合物的製備方法，尤其是一種由DL-酪氨酸製備D-酪氨酸的方法。
背景技術：
酪氨酸，化學名稱α-氨基-β對羥苯基丙酸，又名對羥基苯丙氨酸。英文名稱為Tyrosine，具有特殊的生理學性質，在食品、飼料工業以及農業中均有重要的用途。酪氨酸是一種典型的中性胺基酸，其結構中有一個手性碳原子，即氨基所在位置的碳原子，因此酪氨酸具有光學異構體，即L-酪氨酸和D-酪氨酸，對映體結構如下 L(-)-酪氨酸 D(+)-酪氨酸L-酪氨酸是一種天然胺基酸，其性能早已被人們認識，並被廣泛應用於醫藥、食品、飼料、化工等領域。如L-酪氨酸可以作為食品、飼料的添加劑，在醫藥行業可以作為複合胺基酸輸液的原料。D-酪氨酸是一種非天然胺基酸，過去一直被人們認為是無用的，所以對其性能和作用研究只是近年才開始，尤其是隨著科學研究的不斷深入，人們發現D-酪氨酸具有獨特的生理性能，在生命活動和藥物製備中具有L-酪氨酸所不能替代的作用。目前，D-酪氨酸已經發展成為一種具有廣泛應用前景的手性源，即可以作為手性前體合成一系列手性藥物，而且這些手性藥物具有一些特殊的功效。例如，以D-酪氨酸為前體，合成的阿託西班是重要的保胎藥；合成的多肽在治療惡性腫瘤方面有特殊療效；合成的茴香酶素具有抗原蟲、抗變形蟲、抗真菌、抗腫瘤和防治植物真菌等作用；D-酪氨酸還可以用於合成治療黴菌、酶紅菌、酵母菌、寄生蟲感染的抗菌藥；另外，D-酪氨酸在合成對肺部、中樞神經系統、肝臟、關節、心內膜、眼、耳、皮膚、腸胃、泌尿系統炎症等療效極好的消炎藥物方面也有廣泛的用途。目前，這些藥物大多仍處於藥理藥效的臨床實驗階段，若以上藥物全面上市，必將促使D-酪氨酸的需求量急劇上升。統計資料顯示，目前國內外還沒有大規模生產D-酪氨酸的企業，主要制約因素是目前尚沒有可以應用於規模化、低成本生產D-酪氨酸的技術。由此可見，研究開發D-酪氨酸製備技術是十分必要的。
D-酪氨酸是一種非天然胺基酸，和L-酪氨酸不同，D-酪氨酸不能從自然界的物質中提取，只能通過手性合成或者拆分的方法得到。手性合成是製備手性化合物的重要方法之一，但是目前來說，大部分手性化合物仍然沒有尋找到合適的合成方法和試劑，所以拆分法是當前最經濟可行的手性化合物製備方法。
由於人們對D-酪氨酸的認識較晚，對D-酪氨酸的拆分製備技術的研究也是近年才引起人們的重視。因此，迄今國外都鮮有關於D-酪氨酸的拆分製備技術的報導，國內更是少見。
據調查，在已有的D-醯化水解酶中，從A.dentrifians DA181和A.faecalis微生物中提取並純化的D-醯化水解酶，具有更高的立體選擇性和光學活性，而且酶的穩定性良好、易於純化，目前已有商品出售，因此考慮外購D-醯化水解酶拆分混旋酪氨酸製備D-酪氨酸。

發明內容
本發明的目的是提供一種效率高、成本低、可工業化的利用酶法製備D-酪氨酸的方法。
本發明公開的酶法製備D-酪氨酸的方法包括以下步驟a、首先將DL-酪氨酸與醯化試劑在有機酸條件下按重量比1∶1～3∶1(W)投料進行醯化反應製備N-乙醯-DL-酪氨酸；b、純化D-醯化水解酶，用酶柱固定醯化水解酶；c、將N-乙醯-DL-酪氨酸和去離子水配製成0.5-1.0mol/L的溶液，用鹼調節PH值7-8，過濾後得到N-乙醯-DL-酪氨酸溶液；d、N-乙醯-DL-酪氨酸溶液在40-60℃通過固定有D-醯化水解酶的酶柱，反應時間5-8小時；e、洗脫，反應液用脫色劑於80-90℃脫色，過濾，濃縮，冷卻，結晶，並用少量去離子水漂洗，經乾燥得到D-酪氨酸。結晶母液可製備L-酪氨酸。
純化的醯化水解酶是一種在工業有效的基質濃度下具有活性高、立體選擇性強、抗抑制性強，只對N-乙醯-DL-酪氨酸中的N-乙醯-D-酪氨酸脫醯基合成D-酪氨酸的新型D-醯化水解酶；在醯化過程中所用的醯化試劑為醋酸酐；所用的有機酸為醋酸；調節N-乙醯-DL-酪氨酸溶液PH值所用的鹼為氫氧化鈉溶液或氨水；脫色過程中所用的脫色劑為吸附性的脫色劑，如活性炭或者硅藻土或者白土。
本發明提出了由DL-酪氨酸製備D-酪氨酸的酶法新工藝，由於純化的D-醯化水解酶在工業有效的基質濃度下具有活性高、立體選擇性強、抗抑制性強的特點，使得D-酪氨酸的收率達到88％以上，D-酪氨酸產品的光學純度大大提高，達到99.5％ee以上，降低了生產成本。在醯化過程中所用的醯化試劑和有機酸、調節醯化DL-酪氨酸溶液PH值所用的鹼以及脫色過程中所用的脫色劑均為工業生產常用化工原料。
綜上所述，本發明提出的由DL-酪氨酸製備D-酪氨酸的酶法新工藝可用於工業化生產D-酪氨酸。
具體實施方案DL-胺基酸在一定的條件下經醯化試劑作用進行醯化反應生成N-乙醯-DL-胺基酸，N-乙醯-DL-胺基酸在專一性醯化水解酶的作用下選擇性地對其中的D-醯化胺基酸脫乙醯水解得到D-胺基酸。本發明中，純化了一種活性高、抗抑制性強、對N-乙醯-D-酪氨酸具有高立體選擇性的D-酪氨酸醯化水解酶，通過N-乙醯-DL-酪氨酸中的N-乙醯-D-酪氨酸脫乙醯得D-酪氨酸。
實施例1步驟1製備N-乙醯-DL-酪氨酸將36.2gDL-酪氨酸(0.2mol)、24.0g醋酸(0.4mol)溶於200ml去離子水中，加入24.0g醋酸酐(0.2mol)，在40-60℃下攪拌反應3-6小時，蒸餾回收未反應的醋酸，冷卻至室溫後再用冰水浴冷卻1小時，然後過濾、離心、洗滌、乾燥得到42.6g產品，收率為95.5％。得到的N-乙醯-DL-酪氨酸備用。
步驟2 D-醯化水解酶的純化和固定化市售D-醯化水解酶菌體投加至溶解罐中(PH7.8)，用二乙氨基乙基色譜柱進行部分純化，然後用酶柱進行固定化，在低溫下貯存備用。
經測試，每克溼菌體可分別產生2245活力單位的D-醯化水解酶和852活力單位的L-醯化水解酶。每毫升凝膠的固定化D-醯化水解酶含有13500酶活力單位。用N-乙醯基甲硫氨酸作底物測試時，游離酶和固定化酶的米氏常數分別為1.0和0.22。固定化酶拆分反應中PH為7.5，溫度為45℃。游離酶在PH5.0-11.0範圍內都比較穩定，而固定化酶在PH9.0以上易發生溶解。兩種酶在40℃時都很穩定。固定化酶在45℃連續拆分20天後酶活力仍保持90％。
步驟3 D-醯化水解酶拆分混旋酪氨酸製備D-酪氨酸將上述步驟1製得的42.6g N-乙醯-DL-酪氨酸溶解於300ml去離子水中，用氫氧化鈉溶液調節PH值8.0。在45℃將反應液過固定化酶柱，然後用適量乙醇洗脫。洗脫液轉移到三口燒瓶中，加入2g活性炭，在85℃保溫攪拌40分鐘，趁熱過濾。濾液於60℃真空濃縮原體積的1/3，此時有大量晶體析出。於5℃-10℃冷卻結晶3-6小時，離心分離母液，濾餅乾燥，得D-酪氨酸產品32.5g。經檢測，產品旋光度為[α]D20＝+11.7°，光學純度99.7％ee，酶拆分收率為94.0％。產品總收率89.8％。
實施例2步驟1製備N-乙醯-DL-酪氨酸將54.3gDL-酪氨酸(0.3mol)、36.0g醋酸(0.6mol)溶於200ml去離子水中，加入24.0g醋酸酐(0.2mol)，在50-65℃下攪拌反應4-6小時，蒸餾回收未反應的醋酸，冷卻至室溫後再用冰水浴冷卻45分鐘，然後過濾、離心、洗滌、乾燥得到64.2g產品，收率為96.0％。得到的製備N-乙醯-DL-酪氨酸備用。
步驟2D-醯化水解酶的純化和固定化採用實例1中步驟2所製備的酶柱。
步驟3D-醯化水解酶拆分混旋酪氨酸製備D-酪氨酸將上述步驟1製得的64.2gN-乙醯-DL-酪氨酸溶解於300ml去離子水中，用氨水調節PH值7.5。在50℃將反應液過固定化酶柱，然後用適量乙醇洗脫。洗脫液轉移到三口燒瓶中，加入5g脫色用白土，在90℃保溫攪拌1小時，趁熱過濾。濾液於60℃真空濃縮至原體積的1/3，此時有大量晶體析出。於2℃-5℃冷卻結晶4-5小時，離心分離母液，濾餅乾燥，得D-酪氨酸產品49.9g。經檢測，產品旋光度為[α]D20＝+12.0°，光學純度99.9％ee，酶拆分收率為95.8％。產品總收率92.0％。
實施例3步驟1製備N-乙醯-DL-酪氨酸將72.4gDL-酪氨酸(0.4mol)、42.0g醋酸(0.7mol)溶於350ml去離子水中，加入24.0g醋酸酐(0.2mol)，在50-60℃下攪拌反應4-5小時，蒸餾回收未反應的醋酸，冷卻至室溫後再用冰水浴冷卻1.5小時，然後過濾、離心、洗滌、乾燥得到84.4g產品，收率為94.6％。得到的N-乙醯-DL-酪氨酸備用。
步驟2D型氨基醯化水解酶的純化和固定化採用實例1中步驟2所製備的酶柱。
步驟3D-醯化水解酶拆分混旋酪氨酸製備D-酪氨酸將上述步驟1製得的84.4gN-乙醯-DL-酪氨酸溶解於500ml去離子水中，用氫氧化鈉溶液調節PH值7.5。在45℃將反應液過固定化酶柱，然後用適量乙醇洗脫。洗脫液轉移到三口燒瓶中，加入5g活性炭，在80℃保溫攪拌40分鐘，趁熱過濾。濾液於60℃真空濃縮至原體積的1/3，此時有大量晶體析出。於2℃-8℃冷卻結晶5-6小時，離心分離母液，濾餅乾燥，得D-酪氨酸產品63.4g。經檢測，產品旋光度為[α]D20＝+11.2°，光學純度99.5％ee，酶拆分收率93.1％。產品總收率88.1％。
權利要求
1.一種酶法製備D-酪氨酸的方法，包括以下步驟a、首先將DL-酪氨酸與醯化試劑在有機酸條件下按重量比1∶1～3∶1(W)投料進行醯化反應製備N-乙醯-DL-酪氨酸；b、純化D-醯化水解酶，用酶柱固定醯化水解酶；c、將N-乙醯-DL-酪氨酸和去離子水配製成0.5-1.0mol/L的溶液，用鹼調節PH值7-8，過濾後得到N-乙醯-DL-酪氨酸溶液；d、N-乙醯-DL-酪氨酸溶液在40-60℃通過固定有D-醯化水解酶的酶柱，反應時間5-8小時；e、洗脫，反應液用脫色劑於80-90℃脫色，過濾，濃縮，冷卻，結晶，並用少量去離子水漂洗，經乾燥得到D-酪氨酸。結晶母液可製備L-酪氨酸。
2.根據權利要求1所述的酶法製備D-酪氨酸的方法，其特徵在於純化的D-醯化水解酶是一種在工業有效的基質濃度下具有活性高、立體選擇性強、抗抑制性強，只對N-乙醯-DL-酪氨酸溶液中的N-乙醯-D-酪氨酸脫乙醯基合成D-酪氨酸的新型D-醯化水解酶。
3.根據權利要求1所述的酶法製備D-酪氨酸的方法，其特徵在於醯化過程中所用的醯化試劑為醋酸酐，DL-酪氨酸與醋酸酐在有機酸條件下按重量比1∶1～3∶1(W)投料進行醯化反應。
4.根據權利要求1所述的酶法製備D-酪氨酸的方法，其特徵在於醯化過程中所用的有機酸為醋酸，DL-酪氨酸與醋酸的重量比1∶1.5～1∶1.7。
5.根據權利要求1所述的酶法製備D-酪氨酸的方法，其特徵在於調節N-乙醯-DL-酪氨酸溶液PH值所用的鹼為氫氧化鈉溶液或氨水。
6.根據權利要求1所述的酶法製備D-酪氨酸的方法，其特徵在於脫色過程中所用的脫色劑為吸附性的脫色劑，如活性炭或者硅藻土或者白土，其用量按DL-酪氨酸重量比0.005％投料。
全文摘要
本發明公開一種手性有機化合物的製備方法，尤其是一種由DL－酪氨酸製備D－酪氨酸的方法，首先將DL－酪氨酸與醯化試劑在有機酸條件下醯化反應製備N－乙醯－DL－酪氨酸，將N－乙醯－DL－酪氨酸和去離子水配製成0.5－1.0mol/L的溶液，用鹼調節pH值，過濾後得到N－乙醯－DL－酪氨酸溶液，該溶液通過固定有D－醯化水解酶的酶柱，反應後洗脫，反應液用脫色劑脫色，過濾，濃縮，冷卻，結晶，並用少量去離子水漂洗，經乾燥得到D－酪氨酸，結晶母液可製備L－酪氨酸。由DL－酪氨酸酶法製備D－酪氨酸的工藝可用於大批量工業生產。
文檔編號C12P13/22GK1900298SQ20061008201
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月17日 優先權日2006年7月17日
發明者馬雲峰, 柴多裡, 王組元 申請人:安徽省恆銳新技術開發有限責任公司