一種提高古柯鹼檢測靈敏度的方法

2023-07-31 12:04:31 2

專利名稱：一種提高古柯鹼檢測靈敏度的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用三段核酸探針提高古柯鹼檢測靈敏度的方法，屬於納米生物 技術領域。
背景技術：
以古柯鹼為代表的毒品檢測技術近些年來取得了很大的進展，尤其是利用核酸 適配體進行檢測的技術引起了極大的關注。核酸適配體是從 1014的隨機序列的DNA 或RNA庫中通過指數富集的系統分子進化方法(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment,簡稱SELEX)篩選出來的，能夠特異性地與靶標分子結合，從而特 異性地識別靴標分子(Ellington AD, Szostak Jff (1990)Nature 346 :818_822. Tuerk C, Gold L(1990) Science 249:505-510.)。核酸適配體可以用於包括蛋白質、小分子、重金屬 離子、細胞和病毒等的各種各樣的生物分子的檢測，具有極大的應用前景。目前利用核酸適配體進行古柯鹼檢測的方法，主要是使用一段核酸適配體 (M. N. Stojanovic, et. al, J. Am. Chem. Soc. 2001,123, 4928-4931. ；B. R. Baker, et. al, J. Am. Chem. Soc. 2006，128，3138-3139)，或使用將一段分開成兩段的核酸適配體進行可 卡因的檢測(Stojanovic, M. N. ；de Prada, P. ；Landry, D. ff. J. Am. Chem. Soc. 2000，122， 11547-11548. ;J. Zhang, et.al, small 2008,4, No. 8，1196-1200 ；R. Freeman, et.al, J. Am. Chem. Soc. 2009，131,5028-5029 ；Analyst,2009,134,653-656 ；X. Zhou, et. al.， J. Am. Chem. Soc. 2009，131，6944-6945)。在具體的檢測方法上主要是利用螢光淬滅、酶催 化的顏色反應、電化學或納米金顏色反應進行古柯鹼的檢測。這些方法的檢測靈敏度在 0. liiM-500iiM 的範圍內。以納米金顏色檢測為例，在現有利用納米金的檢測技術中，應用最多的是利用納 米金表面等離子共振的光學性能，獨立存在的納米金是紅色的，而聚集在一起的納米金是 藍灰色或紫色的。也就是說，現有技術在進行生物檢測和環境檢測時必須直接或間接地引 起納米金聚集，或者將聚集的納米金重新分散，從而引起納米金顏色的變化，可見光的吸收 波長產生高達300nm的移動。這種顏色變化可以直接用肉眼觀察，無需任何複雜設備，也可 以使用光譜儀進行定量檢測。現有的引起納米金的聚集的方法可以分為兩大類。第一類方法是檢測物作為交聯 劑將納米顆粒聯結在一起，從而引起聚集。比如DNA誘導的通過顆粒間交聯造成的聚集方 法。這類方法需要將單鏈DNA，DNA酶，RNA酶或核酸適配體連接到納米材料的表面。實驗 步驟相對繁瑣，DNA, DNA酶，RNA酶或核酸適配體的用量大。第二類方法是非交聯的納米顆 粒聚集方法，這種方法利用納米顆粒在加入檢測物後穩定性的降低。這種穩定性的降低是 由於納米顆粒表面用於提高納米金穩定性的DNA分子或ATP的破壞，取代或消耗；或者由於 與未修飾納米顆粒相互作用的溶液中可以穩定納米顆粒的ATP或單鏈DNA的減少。這類方 法大多使用未修飾的納米金顆粒。使用未修飾納米金進行檢測的方法是目前所有檢測技術中最為簡單、便宜和快速的檢測技術，目前該方法已經用於包括對DNA、小分子和重金屬離子在內的多類生物分子的 檢測。這類方法多是基於雙鏈DNA結構比單鏈DNA穩定納米金差這一現象。所報導的使用 未修飾納米金對古柯鹼進行檢測的方法就是利用兩段核酸適配體探針，在古柯鹼存在的時 候與古柯鹼一起形成具有雙鏈DNA結構的超分子結構，該結構比單鏈的核酸探針穩定納米 金的能力差，因此可以用於古柯鹼的檢測。以上所述各種採用一段或兩段核酸適配體進行古柯鹼檢測的方法存在著以下不 足1)使用一段核酸適配體檢測古柯鹼的檢測方法是利用適配體與古柯鹼結合引起 適配體的構相變化，首先通過SELEX技術所篩選出來的適配體大約只有能夠在與靶標 結合的時候有構相變化，這就極大地限制了上述方法對其它靶標檢測的通用性；適配體的 長度通常30個鹼基左右(比如古柯鹼的適配體和Adenosine的適配體)，甚至更長，這樣自 身形成二級結構形成二倍體、多倍體的機會就會大幅增加，從而減低檢測靈敏度，尤其在結 合酶反應進行的古柯鹼檢測，會造成很高的背景信號。2)使用兩段核酸適配體檢測古柯鹼的檢測方法將較長的核酸適配體分成了兩段， 檢測不再需要適配體發生構相變化，這就擴大了方法的普遍適用性，也將自身形成二級結 構形成二倍體、多倍體的機會降低了一些，從而提高了檢測靈敏度。然而兩段核酸探針中較 長一段的長度仍然有25個鹼基左右，而且這段核酸探針獨自也具有結合古柯鹼的能力(見 實施例)，這樣還會造成背景信號，使檢測的靈敏度降低。3)使用未修飾納米金進行古柯鹼的檢測時(J.Zhang，et.al，small 2008,4, No. 8，1196-1200)，當使用兩段核酸適配體探針檢測時，該方法在檢測靈敏度，按照空白樣 品標準偏差的一倍計算，是 7 μ M(J. Zhang，et.al，small 2008，4，No. 8，1196-1200)。檢測 的靈敏度還不夠高，納米金的顏色隨古柯鹼濃度變化的梯度還不夠大，而且檢測的標準偏 差比較大。這些不足主要是由於相對長的單鏈核酸適配體穩定未修飾納米金的能力不強， 與核酸適配體和古柯鹼形成雙鏈DNA結構穩定納米金的能力差別不是很大。在特定鹽濃度 下產生聚集的程度較大，從而造成實驗誤差大的缺點，這就直接影響到檢測的靈敏度。

發明內容
本發明針對現有技術中的問題，其目的在於提供一種利用三段核酸探針提高可卡 因檢測靈敏度的方法。本發明所述的一種提高古柯鹼檢測靈敏度的方法，其特徵在於用於古柯鹼檢測 的核酸適配體探針被斷裂成三段。本發明也即利用三段核酸探針提高古柯鹼檢測靈敏度的方法，其特徵在於利用 使用三段的核酸適配體探針來檢測古柯鹼。本發明的古柯鹼檢測方法，其特徵在於該方法包括如下步驟(1)將古柯鹼與三段核酸適配體探針(無標記、螢光標記、 電化學反應氧化還原基團標記或其它標記)混合，被測定的古柯鹼與適配體探針形成復 合物；其中三段核酸適配體按照等摩爾比混合，與古柯鹼溶液及緩衝溶液混合後的濃度在 0.5μΜ-50μΜ的範圍內；(2)進行螢光檢測、電化學檢測或顏色檢測。具體是使用未修飾納 米金的古柯鹼顏色檢測方法，其特徵在於該方法包括如下步驟(1)將古柯鹼與三段核酸適配體探針混合，古柯鹼與適配體探針形成複合物；(2)將反應溶液與納米金溶液混合；反 應溶液中核酸探針與納米金的摩爾比一般應大於100 1 ； (3)加入適量的鹽溶液(比如含 氯化鈉的磷酸鹽溶液)，通過溶液顏色變化來半定量判定古柯鹼的存在。鹽溶液的加入量以 可以區分含空白樣品與含被測樣品納米金的吸光度(在520nm與650nm處吸光度的比)來 滴定確定，逐漸增大鹽溶液的用量，確定最佳值。古柯鹼的存在於否可以由紫外可見吸收定 量分析。本發明利用三段核酸探針來檢測古柯鹼，具有如下的技術效果1、三段核酸探針與單段或兩段核酸探針相比長度大幅減小，比如在實施例中的三 段核酸探針的長度最長為13個鹼基；而兩段核酸探針的最長的是24個鹼基；單段核酸探 針的長度是30個鹼基。鏈長度的顯著減少，可以大幅減小體系中形成所不期望的分子結構 的機會，比如二聚體或多聚體。尤其是在基於酶放大的檢測體系中，減少探針與信號放大探 針非專一性雜交的機會(B. Shlyahovsky, et al. J. AM. CHEM. S0C. 2007，129，3814-3815)，減 少探針與檢測體系中其它組分造成的背景噪音的相互作用，從而可以顯著地提高檢測的靈 敏度。2、三段核酸探針比相同濃度的單段或兩段核酸探針能夠更好地穩定未修飾納米 金，從而可以提高古柯鹼顏色檢測的顏色梯度，而且可以減小實驗的誤差，進而提高檢測的 靈敏度。3、現有技術中所採用的兩段核酸探針中較長的一段具有獨自與古柯鹼結合的能 力，這樣會造成體系檢測靈敏度的降低。而三段核酸探針中的任何一段或兩段都不能與可 卡因結合，這就消除了上述缺點。在本發明涉及一種利用三段核酸探針提高古柯鹼檢測靈敏度的方法中，當古柯鹼 存在的時候，三段核酸探針與古柯鹼自組裝形成具有雙鏈DNA結構的複合物。該複合物比 單鏈DNA的探針穩定未修飾的納米金的能力差，從而實現對古柯鹼進行無需任何設備的顏 色檢測。如果採用螢光分子、氧化還原基團或其它信號輸出基團進行標記的核酸探針，該方 法還可以進行古柯鹼的螢光檢測、電化學檢測或其它信號輸出形式的檢測。本發明方法可 以用來檢測蛋白質，酶，DNA，小分子，金屬離子和細菌等。本發明的特點和優點可以通過下 面的實施例來體現。需要指出的是，以下實施例僅用來舉例說明，在本發明的範圍內可以進 行各種各樣的變化和修改。


圖1為本發明所使用的未修飾13nm金顆粒的透射電鏡(TEM)圖像(圖Ia和b) 和紫外可見吸收譜(圖Ic)。樣品在測量紫外可見吸收前稀釋10倍，特徵吸收峰在519nm。圖2.是使用一段式核酸探針(探針1或探針2)、兩段式核酸探針(探針2和探針 3)和本發明的三段式核酸探針(探針3、探針4和探針5)進行古柯鹼納米金顏色檢測的原理圖。圖3.是納米金溶液與等摩爾濃度的用於古柯鹼檢測的一段式核酸探針(探針1)、 兩段式核酸探針(探針2和探針3)和本發明的三段式核酸探針(探針3、探針4和探針5) 混合及加入鹽溶液後的紫外可見吸收光譜。插圖是所觀察到的不同混合物的顏色。圖4(A)-圖4(C)分別是本發明一個實施例中使用三段式核酸探針(探針3、4和5)進行古柯鹼納米金顏色檢測的紫外可見吸收譜圖、標準曲線和納米金顏色反應的照片。圖5(A) -圖5(C)分別是本發明一個實施例中使用一段式核酸探針(探針1)進行 古柯鹼納米金顏色檢測的紫外可見吸收譜圖、標準曲線和納米金顏色反應的照片。圖6(A)-圖6(C)分別是本發明一個實施例中使用兩段式核酸探針(探針2和3) 進行古柯鹼納米金顏色檢測的紫外可見吸收譜圖、標準曲線和納米金顏色反應的照片。圖7(A)-圖7(C)分別是本發明一個實施例中使用兩段式核酸探針中的一段核酸 探針(探針2)進行古柯鹼納米金顏色檢測的紫外可見吸收譜圖、標準曲線和納米金顏色反 應的照片。圖8(A)-圖8(B)是本發明一個實施例中證實兩段式核酸探針中的一段核酸探針 (探針2)的結合古柯鹼的能力，可以降低使用兩段核酸探針(探針2和3)進行古柯鹼納米 金顏色檢測的靈敏度的納米金顏色反應的照片(A)和紫外可見吸收譜圖(B)。詳細說明〃 AuNP" or" AuNPs「指金納米顆粒，通常是球形的，典型的尺寸為直 徑 I-IOOnm0適配體指能夠專一性地與靶標分子結合的DNA(或者RNA)分子，靶標可以是蛋白 質、DNA、小分子或金屬離子等等。
具體實施例方式
所述實施例使用的材料和方法HAuCl4從ACROS ORGANIC購買。檸檬酸三鈉從國藥集團化學試劑公司購買。所有 核酸探針從TaKaRa(大連)購買(核酸序列見表一)。13納米的金顆粒(AuNP)按照經典 的檸檬酸鈉還原法制，最終的濃度大約是12士 InM。古柯鹼樣品由中科院上海應用物理研究 所樊春海教授贈送。表一本發明中使用的核酸探針序列。
權利要求
一種提高古柯鹼檢測靈敏度的方法，其特徵在於用於古柯鹼檢測的核酸適配體被斷裂成三段，所述的方法包括如下步驟(1)將古柯鹼與三段核酸適配體探針混合，使被測定的古柯鹼與適配體探針形成複合物；(2)進行螢光檢測、電化學檢測或顏色檢測；所述的適配體為與靶標分子結合的DNA或RNA分子；靶標分子為蛋白質、DNA、小分子或金屬離子。
2.按權利要求1所述的提高古柯鹼檢測靈敏度的方法，其特徵在於顏色檢測時包括的 步驟為(1)將古柯鹼與三段核酸適配體探針混合，使被測定的古柯鹼與適配體探針形成復 合物；(2)將反應溶液與納米金溶液混合；反應溶液中核酸探針與納米金的摩爾比大於 100 1; (3)加入含氯化鈉的磷酸鹽溶液，通過溶液顏色變化半定量判定古柯鹼的存在；鹽 溶液的加入量以區分含空白樣品與含被測樣品的納米金在520nm與650nm處吸光度的比來 滴定確定，逐漸增大鹽溶液的用量，確定最佳值；古柯鹼的存在於否由紫外可見吸收定量分 析。
3.按權利要求1或2所述的提高古柯鹼檢測靈敏度的方法，其特徵在於被測定的可卡 因與適配體探針形成的複合物具有雙鍵DNA結構或雙鍵RNA結構；三段適配體按等摩爾比混合ο
4.按權利要求1或2所述的所述的提高古柯鹼檢測靈敏度的方法，其特徵在於所述的 三段核酸適配體的序列為 5，-GGG AGT CAA GAA C、5，-GTT CTT CAA T 和 5，-AGT GGG ACG ACA。
5.按權利要求2所述的所述的提高古柯鹼檢測靈敏度的方法，其特徵在於檢測包括步 驟為(1)古柯鹼標準樣品的製備在0.15M NaCl, 25mM Tris-HCl，pH 8. 0緩衝溶液中配置 500 μ Μ、200 μ Μ、100 μ Μ、50 μ Μ、20 μ Μ、0 μ M 濃度的古柯鹼溶液；(2)200 μ M核酸探針3、200 μ M探針4、200 μ M探針5各0. 5微升，與1. 5微升含0. 3Μ NaCl的50mM Tris-HCl緩衝液，混勻；(3)取0.5微升步驟2混合溶液，加入不同濃度的古柯鹼溶液4. 5微升，在常溫下保存 30min。從上述樣品中各取2微升，分別加入100微升12士 InM的納米金溶液，室溫下保存 5min,然後加入15微升含0. 2M NaCl的IOmM磷酸鹽緩衝溶液，進行UV-vis吸收測量和拍眧./、、、 (4)根據520nm和650nm處的吸光度繪製古柯鹼檢測的標準曲線。
6.按權利要求2所述的所述的提高古柯鹼檢測靈敏度的方法，其特徵在於所述的納米 金為球形。
7.按權利要求6所述的提高古柯鹼檢測靈敏度的方法，其特徵在於所述的球形直徑為 1 lOOnm。
8.按權利要求1 5中任一項所述的所述的提高古柯鹼檢測靈敏度的方法，其特徵在 於在古柯鹼檢測靈敏度為0. 5 μ M。
全文摘要
本發明涉及一種提高古柯鹼檢測靈敏度的方法，其特徵在於用於古柯鹼檢測的核酸適配體被斷裂成三段，所述的方法包括如下步驟(1)將古柯鹼與三段核酸適配體探針混合，使被測定的古柯鹼與適配體探針形成複合物；(2)進行螢光檢測、電化學檢測或顏色檢測。由於三段核酸探針的長度比一段或兩段的核酸探針顯著減小，探針間，以及探針與檢測體系中其它組分能夠造成背景噪音的相互作用大為減少。從而顯著提高古柯鹼的檢測靈敏度。以古柯鹼的納米金顏色檢測為例，通過使用三段核酸探針將古柯鹼顏色檢測的靈敏度提高了一個數量級。該方法可以推廣到包括小分子和重金屬離子在內的各種不同種類的物質的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101948907SQ20091019807
公開日2011年1月19日 申請日期2009年10月30日 優先權日2009年10月30日
發明者婁新徽, 袁敏, 趙建龍 申請人:中國科學院上海微系統與信息技術研究所