組織等效物的冷凍保存方法和冷凍保存的組織等效物的製作方法
2023-08-01 16:34:51
專利名稱：組織等效物的冷凍保存方法和冷凍保存的組織等效物的製作方法
技術領域：
本發明涉及組織等效物的冷凍保存方法和冷凍保存的組織等效物。進一步詳細地說是涉及由在冷凍保存液中懸浮細胞工序、在基材上接種該細胞工序、以及由此得到的組織等效物在細胞和基材粘附前使其冷凍的工序構成的組織等效物的冷凍保存方法以及利用該方法得到的冷凍保存的組織等效物。
但是，現有方法存在細胞生存率非常低之外，為調節下降一定的溫度又必需精密而且昂貴的程序冷凍儀等冷凍裝置的問題。另外還存在為和基材粘附，需要細胞經預培養工序(數小時到過夜)或在冷凍前用冷凍保存液洗細胞的工序，進一步往細胞內浸透冷凍保存液以及達到平衡都需要時間的問題。
特別是在人造皮膚，特許公報第2722134號公開了片狀上皮細胞在冷凍狀態保存的方法，另外在特開平第8-23968號公報中還公開了利用溶膠—凝膠法固定培養皮膚，以及保存·運輸的方法。
還有在特表平第9-505032號公報中記載了通過在冷凍保護劑溶液中浸泡攪拌組織等效物，使冷凍保護劑溶液充分浸透組織等效物時、冷凍組織等效物的冷凍保存方法。這種方法即使在組織等效物比較厚且不均勻的情況下，也能無損地保全結構、保持著細胞生命力而使組織等效物的冷凍保存成為可能，但在冷凍保護劑溶液浸透時需要時間這一點上，還是不能充分滿足冷凍保存工序的簡單化。
還有，植物細胞的冷凍保存方法以及解凍方法在特開平第9-87102號公報中、人造肝臟的冷凍保存方法在特開昭第53-56897號公報、特開平2-71755號公報以及特表平11-506687號公報中、角膜組織等效物的冷凍保存方法在美國專利5374515號公報中分別有記載。但是，這些方法並不能充分滿足冷凍細胞的高存活率、融解後的高生物活性(例如細胞的增殖活性(率)、物質生產能力等)以及冷凍保存工序的簡單化。
因此，本發明的目的是提高冷凍細胞的存活率和融解細胞的生物活性，並且提供工序簡化的組織等效物的冷凍方法。進一步本發明的目的是還提供由該方法得到的冷凍保存的組織等效物。
即，本發明涉及一種組織等效物的冷凍保存方法，由在冷凍保存液中懸浮細胞的工序、在基材上接種該細胞的工序、以及將得到的組織等效物在細胞和基材粘附前使其冷凍的工序構成；細胞是選自來自哺乳動物的成纖維細胞、表皮細胞、血管內皮細胞、朗格爾漢斯細胞、黑素細胞、脂肪細胞、毛母細胞、毛乳頭細胞、平滑肌細胞、肝細胞、角膜實質細胞、角膜上皮細胞以及角膜內皮細胞中1種以上的上述冷凍保存方法；以及由在冷凍保存液中懸浮細胞工序、在基材上接種該細胞工序、以及得到的組織等效物在細胞和基材粘附前使其冷凍的工序構成的方法得到的冷凍保存的組織等效物。
本發明的「懸浮」是指在溶液中將細胞分散的操作。
還有，本發明的「接種」是指將懸浮在培養基等中的細胞植入培養容器的培養基中或者基材中的過程。
進一步，本發明的「冷凍」是指在基材上接種細胞而製得的組織等效物不經培養，就立即冷凍保存的工序。由於經過預培養使細胞粘附到基材上之後冷凍，細胞存活率非常低，所以優選在細胞接種後，細胞和基材粘附前將細胞冷凍。此時，細胞和基材不粘附，融解後的清洗幾乎不造成細胞損失。這裡所說的粘附是指在加了物理學上的力時，也不能使細胞從基材上容易地脫離的狀態。還有，細胞接種後，優選在細胞容易從基材脫離的時間內，將細胞冷凍。在此脫離是指細胞從基材容易脫離而在溶液中浮遊的狀態。因此具體地說必須以使細胞和基材不發生粘附的速度冷卻到4～10℃。冷卻速度慢時，細胞和基材就發生粘附，這種狀態下冷凍組織等效物會使細胞的存活率下降。這時的冷卻速度根據使用的細胞以及冷凍保存液的種類、冷卻開始時組織等效物的溫度等而變。例如在厚2-3mm的膠原蛋白海綿上接種成纖維細胞的人造皮膚情況下，在4℃～常溫接種細胞時，優選在3小時內冷卻至4℃。
本發明的冷凍方法沒有特別的限制，優選緩冷凍法、快速冷凍法以及玻璃化冷凍法等。
在此，「緩冷凍法」是指用添加了冷凍保護劑的溶液、使人造在細胞外形成的冰晶，通過緩慢而且適當的冷卻速度冷卻而漸漸地增長，以緩慢的速度使細胞內脫水濃縮、隨後通過快速冷卻、防止細胞胞內冷凍而保存，得到融解後高存活率的方法(日本胚移植學雜誌第18卷1期、「由體外受精的牛胚的玻璃化保存」、家畜改良事業團·家畜生命科技中心)。冷卻速度，以上述的那樣使細胞和基材不發生粘附的溫度冷卻到4℃，之後優選以-0.1℃/分～-10℃/分，更優選-0.2℃/分～-5℃/分的速度降到至少達-20℃或者更低的溫度。
「快速冷凍法」是指用添加了冷凍保護劑的溶液、在超低溫冰箱等中快速使組織等效物(或者細胞)冷卻冷凍至冰點以下的方法。冷卻至4速度以上述的那樣使細胞和基材不發生粘附的溫度冷卻到4℃，之後優選-10℃/分～-30℃/分，更優選-10℃/分～-20℃/分。如果快於-30℃/分，細胞內發生結凍，有細胞破碎的危險。
「玻璃化冷凍法」是指在添加了高濃度冷凍保護劑的溶液(稱為玻璃化溶液，通常是細胞滲透性溶液和非細胞滲透性溶液合用)中使細胞浮遊後，通過投入液氮等使其快速冷卻冷凍的方法。這是應用高濃度水溶液在快速冷卻時，成為不存在冰晶核的玻璃化(Vitrification)狀態的現象(生殖細胞培養法，學術出版中心，1983年；研究期刊21(9)，志水學著，1998年)。本方法可使組織等效物在數秒內冷凍。
本發明的方法中組織等效物的保存溫度，為了長時間維持高的生物活性，無論上述三種冷凍方法的哪一種都優選-20℃～-196℃，更優選-80℃～-196℃。在比-20℃高的溫度下長期保存(數月以上)，可使細胞的存活率下降。因此，短期保存時，-20℃完全可以，但長期保存時，就需要在較低溫度下保存。在-80℃時，可以保存1-2年，在-120℃以下(氮蒸汽)或者-196℃(液氮)時，可以半永久地保存。
本發明中使用的「冷凍保存液」是指含有選自具有細胞防凍傷效果的冷凍保護劑中至少一種的溶液。
在緩冷冷凍法和快速冷凍法中，作為冷凍保護劑，優選選自甘油、二甲亞碸(DMSO)、丙二醇、乙二醇、蔗糖、羥甲基纖維素鹽、羥甲基纖維素、單糖類和二糖類(海藻糖等)中的至少一種。溶劑使用水系溶液。特別優選生理鹽類溶液。生理鹽類溶液是指具有適合細胞生存的pH和滲透壓的鹽水溶液，可以舉生理鹽水(0.9％水溶液)、在生理鹽水中補充了K+、Ca2+等數種主要離子的鹽類溶液或者各種細胞培養液等。具體地可以舉DMEM(Dulbeco改良Eagles培養基)、磷酸緩衝液、Ringer氏液、Ringer-Locke氏液、Tyrode氏液、Earle氏液、HanK氏液、Locke氏液、Eagle最小必須培養液、Ham合成培養液F12、Green培養液、Leibovitz的L-15培養液、Cheese必須培養液、改良Eagle氏培養液、Waymouth培養液、Kreb氏培養液以及無血清培養液MCDB153、MCDB151、MCDB104、MCDB131、MCDB402、MCDB201、MCDB302、MCDB105和MCDB110等。
在玻璃化冷凍法中，作為冷凍保護劑可以使用非細胞浸透性玻璃化劑和/或細胞浸透性玻璃化劑。作為非細胞浸透性玻璃化劑優選聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll(Amersham Pharmacia Biotech公司制)以及葡聚糖等多糖類，以及蔗糖等；作為細胞浸透性玻璃化劑優選甘油、丙二醇、乙二醇以及DMSO等。還有作為溶劑，緩冷冷凍法和快速冷凍法同樣優選生理鹽類溶液，具體可以舉DMEM、磷酸緩衝液、Ringer氏液、Ringer-Locke氏液、Tyrode氏液、Earle氏液、HanK氏液、Locke氏液、Eagle氏最小必須培養液、Ham合成培養液F12、Green氏培養液、Leibovitz的L-15培養液、Cheese必須培養液、改良Eagle氏培養液、Waymouth培養液、Kreb氏培養液以及無血清培養液MCDB153、MCDB151、MCDB104、MCDB131、MCDB402、MCDB201、MCDB302、MCDB105和MCDB110等。
本發明使用的「基材」必須是給患者使用(貼附)組織等效物後不被患者的免疫機能排斥的、有優良的機體適應性的材料。還有優選用後不需要去除的、具有生物降解性的材料。具體地說是來自生物體的材料，優選膠原蛋白、明膠、甲殼素、殼聚糖、纖維蛋白，以及軟骨素、硫酸軟骨素以及透明質酸等粘多糖類；生物降解性高分子的聚乙醇酸、聚乳酸以及這些的混合物；非生物降解性的合成高分子中細胞粘附性優良的聚氨酯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯等；以及由這些組成的混合物。進一步，更優選具有優良的生物體適應性、基材內適宜細胞存留那樣的多孔質、具有海綿狀形態的不全膠原蛋白(atelocollagen)、膠原蛋白、明膠、硫酸軟骨素、透明質酸。細胞接種時，為使細胞容易浸透海綿，孔是和細胞接種面垂直的縱向孔，希望在表面和/或和表面相對的面形成一定大小的孔。孔徑為利於接種時細胞浸透並且不利於氣泡進入，所以優選20μm-1000μm的範圍。但是，只要能實現本發明的目的，並不是非要限定在這個範圍。
本發明的「組織等效物」是指由基材和來自哺乳動物的細胞一起組合形成的、至少與哺乳動物組織具有一部分同等機能的構成物。因此，本發明的組織等效物含有基材和該組織有代表性的細胞。因為這些有代表性的細胞在基材或者內部具有和該組織細胞同等的活性，因此該組織等效物是以①組織損傷、切除等造成患者的組織或臟器機能不全，為此為全部或部分取代該組織或臟器而通過各種方法進行移植或者植入為目的，或者以②調查各種製品·原材料和組織的相互作用，或者這些對組織影響為目的而使用。
本發明的「人造皮膚」是指由基材和來自哺乳類皮膚的細胞(成纖維細胞、表皮細胞、朗格爾漢斯細胞、黑素細胞、脂肪細胞、毛母細胞、毛乳頭細胞等)組成而製成的哺乳類(特別是人類)的皮膚組織等效物。本發明的人造皮膚，以促進創傷癒合為目的，適用於由熱致傷的部位、潰瘍部位、褥瘡部位、採皮部位等各種皮膚的缺損部位。構成人造皮膚的各種細胞可以在創傷面增殖的同時，合成·分泌對創傷癒合有效的物質(通過促進各種細胞增殖·移動以及增殖因子的分泌而促進創傷癒合的細胞因子，周圍細胞移動成為再形成組織時的基礎的細胞外基質等)。
本發明的「人造肝臟」是指由基材和來自哺乳動物的肝細胞組合而製成的哺乳動物肝臟等效物。該人造肝臟是以代行肝臟擔負的機能；生命必需物的代謝或合成、有害物質的異化作用、除去代謝產物中的部分功能為目的而開發的，並有望作為治療末期急性和慢性肝衰竭患者而應用於臨床。
作為人造皮膚的一般製作方法，首先利用來自皮膚細胞調製細胞懸浮液後，在基材上接種該細胞懸浮液而製得。以下例示從成纖維細胞製作人造皮膚。
首先在清潔的環境下對採取的皮膚(含有表皮以及真皮的一部分或者全部)進行消毒、用含有抗生素的生理鹽水或者Hanks』液等緩衝液浸泡。這些皮膚在分散酶(disperse)濃度調至1000IU/ml的DMEM中浸泡後，真皮與表皮分離。將得到的真皮用剪子仔細剪碎，再用均化器等粉碎，在0.5％膠原酶溶液(含有0.5％(w/v)膠原酶的DMEM)中浸泡，在37℃振蕩使結締組織溶解。其次在約200～1000×g下離心分離，回收真皮成纖維細胞。得到的成纖維細胞在添加了FBS(胎牛血清)達到10％(v/v)等的DMEM(以下稱DMEM+10％FBS)等作為培養液，在37℃進行培養。根據情況，可進行傳代培養。培養的成纖維細胞用0.25％胰蛋白酶溶液(含有0.25％(w/v)胰蛋白酶以及0.005mM乙二胺四乙酸鈉(EDTA)的磷酸緩衝液)使其從培養瓶剝離，經離心分離回收。將得到的成纖維細胞的沉澱在DMEM等中進行懸浮調製成纖維細胞懸浮液。得到的成纖維細胞懸浮液的細胞濃度用血細胞計數板等進行測定。再其次是再次離心分離回收成纖維細胞，使用含有甘油等冷凍保護劑的冷凍保存液，調製密度為1×104～5×106細胞/ml，優選5×105～2×106細胞/ml的懸浮液。在來自豬或者牛的不全膠原蛋白溶液膠化以及冷凍乾燥得來的、具有縱向空孔的膠原蛋白海綿中，以1×102～1×106細胞/cm2，優選1×104～2×105細胞/cm2的細胞密度接種上述成纖維細胞懸浮液。等細胞懸浮浸透海綿並靜置後，得到組織等效物。
人造肝臟的情況下，作為細胞的分離法舉例可以用膠原酶溶液灌流肝組織，使細胞分散的膠原酶灌流法，但是本發明並不依賴這些分離技術。還有，使用的培養基可舉在DMEM、Cheese必需培養基、改良Eagle氏培養基、Leibovitz氏培養基、Waymouth氏培養基、Kreb氏培養基、Green氏培養基、L-15培養基等中添加了10％(v/v)FBS的培養基等，具體地優選在Green氏培養基中添加了10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素鈉的培養基。
人造角膜的情況下，作為角膜上皮、角膜實質、角膜內皮細胞從組織分離方法例，首先在分散酶溶液中浸泡、通過加溫·振蕩使角膜內皮細胞剝離，其次用剪刀或者剃刀在顯微鏡下從角膜上剝離角膜上皮，仔細切碎分離使角膜上皮細胞、得到除去角膜內皮以及角膜上皮細胞的角膜在盤子上進行培養，回收從組織上脫離的細胞而分離角膜實質細胞的方法(Adclheid I.Schneider等，In Vitro Cell.Dev.Biol-Animal，Vol.35.515-526(1999)和Yoichi Minami等，InvestigativeOphthalmology Visual Science，Vol.34.2316-2324(1993))雖然以上方法是為人所知的，但本發明並不依賴於這些分離技術。還有，使用的培養基在角膜實質細胞的情況下，可舉在DMEM，改良Eagle氏培養基、Eagle氏最小必須培養基、以及改良Eagle氏培養基等中添加了10％(v/v)FBS的培養基等，優選DMEM+10％FBS。還有，角膜上皮細胞的情況下，優選在Green氏培養基等中添加了10％(v/v)FBS的培養基。
以下，通過實施例說明本發明，但本發明不限於這些實施例。
實施例1-1來自人成纖維細胞的人造皮膚的緩冷冷凍保存A按照本發明的方法進行人造皮膚的冷凍保存使用培養瓶(培養面積80cm2)，在DMEM+10％FBS中培養人成纖維細胞。對數增殖期中的成纖維細胞用0.25％胰蛋白酶處理並回收。分別在FBScryo(含有20％(v/v)FBS和10％(v/v)甘油的DMEM)、Cell Banker-II(日本全藥工業(株)制)、Cellvation(ICN生物醫學公司制)三種類的冷凍保存液中將細胞懸浮，製成9.0×105細胞/ml的細胞懸浮液。事先在12孔板放入直徑22mm的圓形膠原蛋白海綿，各接種0.5ml細胞懸浮液(1.2×105細胞/cm2)。靜置至細胞懸浮液浸透海綿後，將12孔板以-0.5～-2℃/分的速度冷卻冷凍。A-1)人造皮膚的融解以及存活率測定在-80℃保存一定期間後的人造皮膚，用5％二氧化碳、37℃的條件下靜置10～15分鐘使其融解。吸取除去培養基後，用2ml DMEM+10％FBS或者DMEM洗2次。添加2ml DMEM+10％FBS或者DMEM後，在5％二氧化碳、37℃條件下進行15小時以上培養。其次將得到的人造皮膚浸泡在5.0ml的0.5％膠原蛋白酶溶液中，37℃的水浴中振蕩5-10分鐘使該人造皮膚溶解。在約400×g、4℃的條件下，進行5分鐘離心操作回收細胞、測定存活率。細胞的存活率在表1中表示。不管使用哪種冷凍保存液，在冷凍時存活率急劇下降，之後1個月左右存活率幾乎不變、或者呈緩慢下降。還有，1個月以上仍得到了50％以上的存活率。
表1
A-2)人造皮膚的融解以及生物活性的測定A-2-1細胞增殖率在-80℃保存的人造皮膚用5％二氧化碳、37℃條件下靜置10～15分鐘使其融解。吸取除去培養基後，用2ml DMEM+10％FBS或者DMEM洗2次。添加2ml DMEM+10％FBS或者DMEM後，在5％二氧化碳、37℃條件下進行3日或7日培養。其次將得到的人造皮膚浸泡在5.0ml的0.5％膠原蛋白酶溶液中，37℃的水浴中振蕩5-10分鐘使該組織等效物溶解。在約400×g、4℃的條件下，進行5分鐘離心操作回收細胞、用臺盼藍色素排除法對總細胞數、活細胞數以及細胞存活率進行計數。特別是在DMEM+10％FBS培養情況下，培養3日後-7日後活細胞數增加到1.4倍。表2中表示融解後人造皮膚中的活細胞數。
表2
A-2-2血管內皮細胞增殖因子(VEGF)產生能力在-80℃保存的人造皮膚用5％二氧化碳、37℃條件下靜置10～15分鐘使其融解。吸取除去培養基後，用2ml DMEM+10％FBS或者DMEM洗2次。分別添加各培養液2ml後，在5％二氧化碳、37℃的條件下培養。培養3日後回收培養上清液，用酶聯免疫分析(ELISA)法測定上清液中的VEGF量。做為對照，對沒有進行冷凍的人造皮膚進行同樣的測定。在活細胞的VEGF產生量方面，冷凍的人造皮膚(表3中的①和②)和不冷凍的人造皮膚(表3的③和④)之間幾乎沒有差異。表3表示培養3日後人造皮膚的VEGF產生量(pg/ml/105活細胞)。
表3
A-2-3膠原蛋白型I產生能力在-80℃保存的人造皮膚，用5％二氧化碳、37℃的條件下靜置10～15分鐘使其融解。吸取除去培養基後，用2ml DMEM洗2次。添加2ml DMEM後，在5％二氧化碳、37℃條件下進行培養。培養3日後回收培養上清液，用ELISA法測定上清液中的膠原蛋白I型的量。作為對照，對沒有進行冷凍的人造皮膚進行同樣的測定。由於本發明人使用的抗膠原蛋白I型抗體和培養基含有血清中的牛膠原蛋白發生交叉反應，所以僅對在DMEM上培養的人造皮膚進行了膠原蛋白I型的定量。培養3日後活細胞的膠原蛋白產生量和非冷凍的人造皮膚幾乎一樣。表4表示培養3日後人造皮膚的膠原蛋白型I產生量(ng/ml/105活細胞)。
表4
B利用現有方法的人造皮膚的冷凍保存使用培養瓶(培養面積80cm2)，在DMEM+10％FBS中培養人成纖維細胞。對數增殖期中的成纖維細胞用0.25％胰蛋白酶溶液處理並回收。用DMEM+10％FBS調製9.0×105細胞/ml的細胞懸浮液。事先在12孔板放入直徑22mm的圓形膠原蛋白海綿，各接種0.5ml細胞懸浮液(1.2×105細胞/cm2)。將12孔板在5％二氧化碳、37℃條件下進行15小時以上培養。在確認細胞已經粘附時，吸取除去培養基後，用冷凍保存液(FBScryo、Cell BonkerII、Cellvation)2ml分別洗2次。各孔中分別添加冷凍保存液2ml，將12孔板以-0.5～2℃/分的速度進行冷卻冷凍。B-1)人造皮膚的融解以及存活率測定在-80℃保存必要期間的人造皮膚用5％二氧化碳、37℃條件下靜置10～15分鐘使其融解。吸取除去培養基後，用2ml DMEM+10％FBS或者DMEM洗2次。添加2ml DMEM+10％FBS或者DMEM後，在5％二氧化碳、37℃條件下進行15小時以上培養。其次將得到的人造皮膚浸泡在5.0ml的0.5％膠原蛋白酶溶液中，37℃的水浴中振蕩5-10分鐘使該組織等效物溶解。在約400×g、4℃的條件下，進行5分鐘離心操作回收細胞。冷凍1日後溶解人造皮膚測定總細胞數、活細胞數以及細胞的存活率。細胞和膠原蛋白海綿粘附狀態下緩冷冷凍，與冷凍保存液的種類無關，細胞的存活率非常低，僅10～20％。表5表示細胞的存活率。
表5
C冷凍時細胞形態和細胞存活率的相互關係在細胞與膠原蛋白海綿粘附狀態冷凍人造皮膚的現有方法中，與冷凍保存液的種類無關，細胞存活率非常低。在用本發明方法的人造皮膚與細胞和膠原蛋白海綿呈粘附狀態冷凍的人造皮膚之間被確認存活率有差異，作為其原因可以認為是由冷凍時細胞形態的不同而造成的。因此，為了明確人造皮膚冷凍時細胞形態與存活率之間關係，改變冷凍前的培養時間，其它和實施例1-1的A同樣順序製作人造皮膚，測定冷凍和融解後細胞存活率。具體是靜置到細胞懸浮液浸透海綿後(本發明)，或者在37℃培養2小時或者15小時後和實施例1-1的A同樣順序製作冷凍人造皮膚。還有，作為對照，對細胞接種後在37℃培養48小時的人造皮膚進行同樣的細胞存活率測定。細胞接種後培養2小時-15小時的人造皮膚的存活率低，但細胞接種後立即冷凍的人造皮膚得到了非常高的存活率。冷凍前用顯微鏡進行觀察確認了在接種後2小時培養的人造皮膚中有一半以上的細胞、15小時以上培養的人造皮膚中全部的細胞，和海綿粘附著。即，可以認為細胞的存活率因冷凍時細胞形態的不同而異。細胞在沒有粘附狀態冷凍人造皮膚的細胞回收率和沒有冷凍的人造皮膚相比在90％以上。因此，人造皮膚融解後既使進行洗的操作，仍可以認為細胞還滯留在海綿上。表6表示細胞的存活率和總細胞數。
表6
實施例1-2來自人成纖維細胞的人造皮膚的快速冷凍保存A利用本發明的方法進行人造皮膚的冷凍保存使用培養瓶(培養面積80cm2)，在DMEM+10％FBS中培養人成纖維細胞。對數增殖期中的成纖維細胞用0.25％胰蛋白酶處理並回收。使細胞懸浮在FBScryo中，調製成9.0×105細胞/ml的細胞懸浮液。事先在12孔板放入直徑22mm的圓形膠原蛋白海綿，各接種0.5ml細胞懸浮液(1.2×105細胞/cm2)。靜置至細胞懸浮液浸透海綿時，用塑料帶密封。保持12孔板原樣直接放入-152℃的超低溫冰箱中冷凍保存。A-1)人造皮膚的融解以及存活率測定冷凍1日後，在-152℃保存的人造皮膚在37℃水浴中浸泡3分鐘使其融解，吸取去除FBScryo培養基，用2ml DMEM+10％FBS洗2次。添加2mlDMMEM+10％FBS後，在5％二氧化碳、37℃條件下進行15小時以上培養。其次將得到的人造皮膚浸泡在5.0ml的0.5％膠原蛋白酶溶液中，37℃的水浴中振蕩5-10分鐘使該人造皮膚溶解。在約400×g、4℃的條件下，進行5分鐘離心操作回收細胞，用臺盼藍色素排除法測定總細胞數，活細胞數以及存活率。作為對照，對沒有進行冷凍的人造皮膚也同樣測定了存活率。在-152℃的快速冷凍人造皮膚中，獲得了77.4％高存活率。這個結果可以說和緩冷冷凍時相同。還有，本發明方法冷凍的人造皮膚融解後，培養過夜時確認了細胞伸長偽足和膠原蛋白海綿粘附。表7表示細胞的存活率。
表7
實施例2來自表皮細胞的人造皮膚的冷凍保存A由本發明的方法製作人造皮膚及冷凍方法使用培養瓶(培養面積80cm2)在含有3％(V/V)FBS的Green氏培養基(以下寫作Green氏培養基+3％FBS)上培養人表皮細胞。人表皮細胞用調製成1000單位/ml分散酶(合同酒精(株)制)的PBS(-)(磷酸緩衝液)溶液2ml進行處理並回收。回收的表皮細胞進一步用0.25％胰蛋白酶溶液處理使其單細胞化。在冷凍保存液A(含有10％(v/v)甘油、20％(v/v)FBS的Green氏培養基)懸浮調製成2.5×106細胞/ml的細胞懸浮液。將其以各0.5ml接種在事先放入12孔板的直徑為22mm的圓形膠原蛋白海綿(3.3×105細胞/cm2)。其次，按以下方法製作人造皮膚。
①接種後，靜置至細胞充分浸透海綿後，以-0.2～-5℃/分的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。
②接種後，靜置至細胞充分浸透海綿後，放入-80℃超低溫冰箱中冷凍(快速冷凍法)。
③接種後，靜置至細胞充分浸透海綿後，放入-152℃超低溫冰箱中冷凍(快速冷凍法)。B由現有方法製作的人造皮膚以及對照用人造皮膚的製作方法使用培養燒瓶(培養面積80cm2)在Green氏培養基+3％FBS上培養人表皮細胞。人表皮細胞用調製成1000單位/ml分散酶(合同酒精(株)制)的PBS(-)(磷酸緩衝液)溶液2ml進行處理並回收。回收的表皮細胞進一步用0.25％胰蛋白酶溶液處理使其單細胞化。調製Green氏培養基+3％FBS中懸浮的2.5×106細胞/ml的細胞懸浮液。將其以各0.5ml接種在事先放入12孔板的直徑為22mm的圓形膠原蛋白海綿(3.3×105細胞/cm2)。其次，按以下方法製作人造皮膚。
④接種後用5％二氧化碳、37℃下培養過夜(15小時以上)。吸取去除培養基後，用冷凍保存液A洗2次。往各孔中添加冷凍保存液A 1.5ml，以-0.2～-5℃/分的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。
⑤不經冷凍培養2日，用C的方法(後述)測定細胞的存活率。C人造皮膚的融解以及存活率測定上述實施例2的A、B製作的人造皮膚中細胞存活率以下述方法進行測定。
在-80℃或-152℃的超低溫冰箱中保存了1～7日的人造皮膚，在37℃水浴中浸泡5-10分鐘使其融解。吸取去除培養基後，用2.0ml Green氏培養基+3％FBS洗人造皮膚2次。再添加上述的培養基1.5ml，在5％二氧化碳、37℃條件下培養過液(15小時以上)。其次，將得到的人造皮膚浸泡在0.5％膠原蛋白酶溶液5ml中，在37℃水浴中振蕩5～10分鐘使膠原蛋白海綿溶解。用約100×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細胞。除去上清液後，加0.25％胰蛋白酶溶液3.0ml到細胞中，在37℃水浴中振蕩5-10分鐘。再一次用約400×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細胞。將細胞懸浮在Green氏培養基+3％FBS中，用臺盼藍色素排除法測定細胞的存活率。
其結果是在膠原蛋白海綿上接種細胞後，在細胞發生粘附前緩冷冷凍(本發明，表8中的①)或者快速冷凍(本發明，表8中的②和③)的人造皮膚，得到了高存活率。與此相對，細胞接種並培養15小時後緩冷冷凍的人造皮膚(現有方法，表8中的④)，其存活率低。表8表示細胞的存活率。
表8
實施例3來自血管內皮細胞的人造血管的冷凍保存A由本發明方法製作人造血管以及冷凍方法使用培養瓶(培養面積80cm2)在含有10％(v/v)FBS以及10ng/ml人FGF(人成纖維細胞增殖因子)的Green氏培養基中培養人血管內皮細胞。人血管內皮細胞用0.25％胰蛋白酶溶液處理並回收。在冷凍保存液B(含有10％(v/v)甘油、20％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF的Green氏培養基)中懸浮，調製成1.4×106細胞/ml的細胞懸浮液。將其以各0.6ml接種在事先放入12孔板的直徑為22mm的圓形膠原蛋白海綿(2.2×105細胞/cm2)。
其次，按以下方法製作人造血管。
①接種後，靜置至細胞充分浸透海綿後，以-0.2～-5℃/分的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。B由現有方法製作人造血管以及對照用人造血管的製作方法使用培養瓶(培養面積80cm2)在含有10％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF(人成纖維細胞增殖因子)的Green氏培養基上培養人血管內皮細胞。人血管內皮細胞用0.25％胰蛋白酶溶液處理並回收。在含有10％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF的Green氏培養基中懸浮，調製成1.4×106細胞/ml的細胞懸浮液。將其以各0.6ml接種在事先放入12孔板的直徑為22mm的圓形膠原蛋白海綿(2.2×105細胞/cm2)。
其次，按以下方法製作人造血管。
②接種後培養過夜，用冷凍保存液B洗2次後，以-0.2～-5℃/分的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。
③不經冷凍培養2日，用C的方法(後述)測定細胞的存活率。C人造血管的融解以及存活率測定上述實施例3的A、B製作的人造血管中的細胞存活率以下述方法進行測定。
在-80℃的超低溫冰箱中保存了1～7日的人造血管，在37℃水浴中浸泡5-10分鐘使其融解。吸取去除培養基後，用2.0ml含10％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF的Green氏培養基洗人造血管2次。再添加上述的培養基1.5ml，在5％二氧化碳、37℃條件下培養過夜(15小時以上)。其次，將得到的人造血管浸泡在0.5％膠原蛋白酶溶液5ml中，在37℃水浴中振蕩5～10分鐘使膠原蛋白海綿溶解。用約400×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細胞。除去上清液後，加0.25％胰蛋白酶溶液3.0ml到細胞中，在37℃水浴中振蕩5-10分鐘。再一次用約400×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細胞。將細胞懸浮在含有10％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF的Green氏培養基中，用臺盼藍色素排除法測定細胞的存活率。
其結果是在膠原蛋白海綿接種細胞後，細胞發生粘附前緩冷冷凍(本發明，表9中的①)的人造血管，得到了高存活率。與此相對，細胞接種並培養15小時後緩冷冷凍的人造血管(現有方法，表9中的②)，其存活率低。表9表示細胞的存活率。
表9
實施例4來自肝細胞的人造肝臟的冷凍保存A由本發明方法製作人造肝臟以及冷凍方法使用培養燒瓶(培養面積80cm2)在含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素鈉的Green氏培養基中培養人肝細胞。人肝細胞用0.25％胰蛋白酶溶液處理並回收。在冷凍保存液C(含有10％(v/v)甘油、20％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素鈉的Green氏培養基)中懸浮，調製成1.5×106細胞/ml的細胞懸浮液。將其以各0.5ml接種在事先放入12孔板的直徑為22mm的圓形膠原蛋白海綿(2.0×105細胞/cm2)。其次，按以下方法製作人造肝臟。
①接種後，靜置至細胞充分浸透海綿後，以-0.2～-5℃/分的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。
②接種後，靜置至細胞充分浸透海綿後，放入-80℃超低溫冰箱中冷凍(快速冷凍法)。
③接種後，靜置至細胞充分浸透海綿後，放入-152℃超低溫冰箱中冷凍(快速冷凍法)。B對照用人造肝臟的製作方法使用培養燒瓶(培養面積80cm2)在含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素鈉的Green氏培養基中培養人肝細胞。人肝細胞用0.25％胰蛋白酶溶液處理並回收。在含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素鈉的Green氏培養基中懸浮，調製成1.5×106細胞/ml的細胞懸浮液。將其以各0.5ml接種在事先放入12孔板的直徑為22mm的圓形膠原蛋白海綿(2.0×105細胞/cm2)。其次，按以下方法製作人造肝臟。
④接種後，在5％二氧化碳、37℃條件下培養過夜(15小時以上)。吸取除去培養基後，用冷凍保存液C洗2次。往各孔添加冷凍保存液C1.5ml，以-0.2～-5℃的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。
⑤接種後，在5％二氧化碳、37℃條件下培養過夜(15小時以上)。吸取除去培養基後，用冷凍保存液C洗2次。往各孔添加冷凍保存液C1.5ml，放入-80℃的超低溫冰箱中冷凍。
⑥不經冷凍、培養2日，用C的方法(後述)測定細胞的存活率。C人造肝臟的融解以及存活率測定上述實施例4的A、B製作的人造肝臟中的細胞存活率以下述方法進行測定。
在-80℃或-152℃的超低溫冰箱中保存了1～7日的人造肝臟，在37℃水浴中浸泡5-10分鐘使其融解。吸取去除培養基後，用含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素鈉的2.0ml Green氏培養基洗人造肝臟2次。再添加同上的培養基1.5ml，在5％二氧化碳、37℃條件下培養過液(15小時以上)。其次，將得到的人造肝臟浸泡在0.5％膠原蛋白酶溶液5ml中，在37℃水浴中振蕩5～10分鐘使膠原蛋白海綿溶解。用約400×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細胞。除去上清液後，加0.25％胰蛋白酶溶液3.0ml到細胞中，在37℃水浴中振蕩5-10分鐘。再一次用約400×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細胞。將細胞懸浮在含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素鈉的Green氏培養基中，用臺盼藍色素排除法測定細胞的存活率。
其結果是在膠原蛋白海綿接種細胞後，細胞發生粘附前緩冷冷凍(本發明，表10中的①)或者快速冷凍(本發明，表10中的②和③)的人造肝臟，得到了高存活率。與此相對，細胞接種並培養15小時後緩冷冷凍的人造肝臟(現有方法，表10中的④和⑤)，其存活率低。表10表示細胞的存活率。
表10
實施例5來自角膜實質細胞的人造角膜的冷凍保存A由本發明方法製作人造角膜以及冷凍方法使用培養燒瓶(培養面積80cm2)在DMEM+10％(v/v)FBS培養基中培養兔角膜實質細胞。兔角膜實質細胞用0.25％胰蛋白酶溶液處理並回收。在冷凍保存液FBScryo中懸浮，調製成1.0×106細胞/ml的細胞懸浮液。將其以各0.5ml接種在事先放入12孔板的直徑為22mm的圓形膠原蛋白海綿(1.3×105細胞/cm2)。其次，按以下方法製作人造角膜。
①接種後，靜置至細胞充分浸透海綿後，以-0.2～-5℃/分的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。
②接種後，靜置至細胞充分浸透海綿後，放入-152℃超低溫冰箱中冷凍(快速冷凍法)。B對照用人造角膜的製作方法使用培養燒瓶(培養面積80cm2)在DMEM+10％(v/v)FBS培養基上培養兔角膜實質細胞。兔角膜實質細胞用0.25％胰蛋白酶溶液處理並回收。在冷凍保存液DMEM+10％FBS中懸浮，調製成1.0×106細胞/ml的細胞懸浮液。將其以各0.5ml接種在事先放入12孔板的直徑為22m的圓形膠原蛋白海綿(1.3×105細胞/cm2)。其次，按以下方法製作人造角膜。
③接種後，在5％二氧化碳、37℃條件下培養過夜(15小時以上)。吸取除去培養基後，用FBScryo洗2次。往各孔添加FBScryo 1.5ml，以-0.2～-5℃的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。
④接種後，在5％二氧化碳、37℃條件下培養過夜(15小時以上)。吸取除去培養基後，用FBScryo洗2次。往各孔添加FBScryo 1.5ml，放入-80℃的超低溫冰箱中冷凍。
⑤不經冷凍、培養2日，用C的方法(後述)測定細胞的存活率。C人造角膜的融解以及存活率測定上述實施例5的A、B製作的人造角膜中的細胞存活率以下述方法進行測定。
在-80℃或-152℃的超低溫冰箱中保存了1～7日的人造角膜，在37℃水浴中浸泡5-10分鐘使其融解。吸取去除培養基後，用2.0ml 10％(v/v)FBS洗人造角膜2次。再添加上述的培養基1.5ml，在5％二氧化碳、37℃條件下培養過液(15小時以上)。其次，將得到的人造角膜浸泡在0.5％膠原蛋白酶溶液5ml中，在37℃水浴中振蕩5～10分鐘使膠原蛋白海綿溶解。由約400×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細胞。除去上清液後，加0.25％胰蛋白酶溶液3.0ml到細胞中，在37℃水浴中振蕩5-10分鐘。再一次由約400×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細胞。將細胞懸浮在DMEM+10％FBS中，用臺盼藍色素排除法測定細胞的存活率。
其結果是在膠原蛋白海綿接種細胞後，細胞發生粘附前緩冷冷凍(本發明，表11中的①)或者快速冷凍(本發明，表11中的②)的人造角膜，得到了高存活率。與此相對，細胞接種並培養15小時後緩冷冷凍的人造角膜(現有方法，表11中的③和④)，其存活率低。表11表示細胞的存活率。
表11
本發明的冷凍保存方法由於可以使細胞的存活率比現有方法高，所以可以長期地保存對創傷癒合有效的組織等效物。還有，本方法省去了冷凍前的預培養以及清洗工序、而且融解後的清洗操作簡單，所以比現有方法又簡便，又經濟。進一步，本發明用簡單的冷凍裝置(-85℃～-20℃)使組織等效物的冷凍保存成為可能，因此可以在更多的醫療設施保存。此外，由本方法冷凍保存的組織等效物無毒、安全性高，所以可以立即應用在臨床上。
權利要求
1.組織等效物的冷凍保存方法，是由在冷凍保存液中懸浮細胞的工序、在基材上接種細胞的工序、以及將所得到的組織等效物在細胞與基材粘附之前使其冷凍的工序構成的。
2.權利要求1記載的方法，其細胞是選自來自哺乳動物的成纖維細胞、表皮細胞、血管內皮細胞、朗格爾漢斯細胞、黑素細胞、脂肪細胞、毛母細胞、毛乳頭細胞、平滑肌細胞、肝細胞、角膜實質細胞、角膜上皮細胞以及角膜內皮細胞中的一種以上。
3.權利要求1記載的方法，其冷凍工序是通過緩冷冷凍法進行的。
4.權利要求1記載的方法，其冷凍工序是通過快速冷凍法進行的。
5.權利要求1記載的方法，其冷凍工序是通過玻璃化冷凍法進行的。
6.權利要求1記載的方法，其冷凍後的保存溫度為-196℃以上-20℃以下。
7.權利要求1記載的方法，其組織等效物是人造皮膚，人造血管、人造肝臟或人造角膜。
8.冷凍保存的組織等效物，是將在冷凍保存液中懸浮的細胞接種在基材上，在細胞和基材發生粘附前進行冷凍而得到的。
9.權利要求8記載的組織等效物，該組織等效物是由人造皮膚、人造血管、人造肝臟或人造角膜組成的。
10.權利要求8記載的組織等效物，其中基材和細胞的組合是由不全膠原蛋白構成的海綿和來自人的成纖維細胞的組合。
11.權利要求10記載的組織等效物，其中由不全膠原蛋白構成的海棉具有縱向空孔。
全文摘要
本發明提供組織等效物的冷凍保存方法可以提高冷凍細胞的存活率以及融解細胞的生物活性。進一步提供由本發明方法而製得的冷凍保存的組織等效物。將在冷凍保存液中懸浮的細胞接種在基材上，在細胞和基材發生粘附之前進行冷凍。
文檔編號A61L27/60GK1419410SQ01807113
公開日2003年5月21日 申請日期2001年3月2日 優先權日2000年3月24日
發明者山本直香, 野村昌代, 森山剛 申請人:株式會社美你康