一種耐有機溶劑蛋白酶高產菌以及該耐有機溶劑蛋白酶的基因和應用的製作方法

2023-08-02 06:02:11

專利名稱：：一種耐有機溶劑蛋白酶高產菌以及該耐有機溶劑蛋白酶的基因和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種耐有機溶劑蛋白酶高產菌，其耐有機溶劑蛋白酶的基因，以及該耐有機溶劑蛋白酶在有機相中催化肽合成的應用，屬於微生物學與酶學領域。技術背景蛋白酶是指能催化肽鍵水解的一類酶，自1913年被試驗用於洗滌劑的添加成分以來，由於其重要的商業價值而被廣泛關注。由於巨大的市場需求，蛋白酶逐漸成為三大工業用酶之一。當今蛋白酶的產量已經佔據酶市場的40%以上，廣泛應用於洗滌劑、食品、醫藥、皮革、有機合成、廢物處理等領域。蛋白酶雖然廣泛存在於幾乎所有生物中，但由於微生物生產的蛋白酶主要是胞外酶，與動、植物來源的蛋白酶相比更適合工業化，所以微生物來源的蛋白酶的產量佔目前蛋白酶總產量的2/3以上。蛋白酶催化的最普通的反應是水解蛋白質中的肽鍵。通常情況下，蛋白酶催化水解肽鍵的反應是在特定的pH的緩衝溶液中進行的，而且蛋白酶對其所催化肽鍵的胺基酸殘基具有特異性要求，即有著高度的區域選擇性和立體選擇性。隨著酶工程和溶劑工禾呈技術的發展，人們發現蛋白酶在有機溶劑中能夠催化一些水溶液中不能進行的反應，比如在非水條件下，蛋白酶能催化肽鍵的形成。大量的研究表明，有機溶劑中進行酶促反應有著許多的優點1、增大各種有機底物的溶解度；2、具有高度的立體選擇性和區域選擇性，有機介質可改變選擇性；3、控制反應平衡向所需方向移動，如水解酶在有機介質中能催化脫水縮合反應；4、有效防止微生物汙染，產物易於分離純化等。這使得有機溶劑中的酶反應越來越多的運用到實際中。如甜味劑Aspartame的前體物的合成，該反應以嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)為催化劑，在雙相中合成前體二肽，含有底物(Z-L-Asp和L-PheOMe)的有機相被連續添加到反應器中，底物被連續萃取到含有酶的水相中，並在水相中合成前體二肽，然後二肽再被萃取到有機相中，使反應連續進對亍；再如在精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽的合成中，先用胰蛋白酶在含有0.1MTris/HCL緩衝溶液中(PH-8.0)的極性有機溶劑乙醇中催化Bz-Arg-OEt和H-Gly-OEt生成Bz-Arg-Gly-OEt，再用木瓜凝乳蛋白酶在0.25MCHES/NaOH緩衝液(PH-9.0,EDTA10mM)的乙醇溶液中催化Bz-Arg-Gly-OEt禾卩H-Asp(-OMe)2生成Bz-Arg-Gly-Asp(-OMe)OH，兩步的產率分別為80%和70%，整個合成過程總共有8步，分別是三種胺基酸的酯化、N端胺基酸的保護與取保護、兩步酶催化的肽合成、最後一步酯水解；而化學合成方法卻需要910步分別為兩種自由胺基酸的酯化、N端胺基酸的保護與取保護、Arg中胍基的保護與去保護、兩步肽鍵合成反應、兩步酯水解反應，如果副反應過多可能還要加上最後的提純步驟，而胍基的保護和去保護由於成本過高，是化學合成中是儘量避免的。酶催化的有機相反應體系一般分三類1、水-疏水有機溶劑雙相體系，酶溶解於7K相，底物或產物則溶解於有機相，底物部分進入水相或在界面處與酶作用，此體系中底物的擴散與傳質限制了酶反應速度。2、疏水有機溶劑單相體系，酶粉懸浮於有機溶劑中，為維持酶分子表層的"必需水"，避免採用極性有機溶劑；底物的擴散速率也是該體系的限制步驟。3、水-極性有機溶劑互溶體系，酶與底物存在於均一體系中具有很高的反應效率。三種體系中有機溶劑均對酶產生影響,酶易變性失活。特別是極性有機溶劑互溶體系，一般親水有機溶劑的比例為10%30%，高於某閾值的親水有機溶劑就會奪去酶分子表面的結構水，而導致酶失活。有機溶劑體系中酶催化的誘人前景與酶易失活的矛盾推動了酶的改造與非水酶學的發展。過去20多年，研究者致力於提高酶在有機溶劑中的穩定性，常用方法1、亍吏用疏水性有機溶劑作為反應介質並控制介質中的含水量，以保證酶的"必需水"；2、在反應介質中加入保護劑甘油、乙二醇、多元醇聚合物等，或加入環糊精等冷凍乾燥保護劑，以提高酶分子在有機介質中的穩定性。3、利用固定化、包埋法、大分子修飾等理化修飾方法提高酶在有機介質中的活性和穩定性；4、利用基因改瑋提高酶的有機溶劑穩定性；然而上述方法只能在一定程度上改善酶在有機溶劑中的活性和穩定性。天然具有有機溶劑穩定性的蛋白酶為近年來發現的一類新型蛋白酶，具有能穩定存在於有機溶劑中的天然特性。這類蛋白酶通常由耐有機溶劑極端微生物產生。儘管有t幾溶劑對微生物細胞具有極大的毒害，但近年來有關耐有機溶劑的極端微生物成為一個研:究熱點。由於耐有機溶劑極端微生物能在富含有機溶劑的環境中生存，因此由這類微生物分泌到包外的如蛋白酶、脂肪酶、澱粉酶等也具有一定的有機溶劑耐受性。1995年Ogino(Appl.Environ.Microbiol.61,42584262)首次報導產耐有機溶劑蛋白酶的極端微生物，隨後Ghorbel(EnzymeMicrob.Technol.32,513518)，Rahman(Biochem.Eng.J.13，7377),Gupta(Bioresour.Technol.97，17881793)，Ruiz(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.34，111115)又相繼報導了以耐有機溶劑極端微生物為來源的耐有機溶劑蛋白酶的研究。在目前所報導的耐有機溶劑蛋白酶產生菌絕大多數集中在假單胞屬(屍^M^/^"w)和芽胞桿菌屬(5""7/^)，且這類蛋白酶對多種有機溶有明顯的耐受性，但目前所報導的蛋白酶的相關溶劑耐受濃度較低(約25%_v/v)，而且產量也相對較低(全都低於2000U/mL)，目前未見耐有機溶劑蛋白酶高產菌的報導。
發明內容本發明的目的是提供一種耐有機溶劑蛋白酶高產菌、耐有機溶劑蛋白酶、耐有機、溶劑蛋白酶基因及其在有機相中催化肽合成的應用，能為耐有機溶劑蛋白酶的生產提供良好的天然菌種來源，同時也為重組生物反應器來工業化廉價生產耐有機溶劑蛋白酶提供基因資源。為了實現本發明的目的，本發明首先從油汙土樣中篩選獲得一株耐有機溶劑蛋白酶高產菌，分類命名為銅綠假單胞菌i^e^o7womwaen/g/mwaPT121,其保藏號登記號為CCTCCM208029。本發明對銅綠假單胞菌Aewtfowomwflen^'mwaPT121的生物特徵進行鑑定，對該菌的革蘭氏染色觀察表明該菌株為革蘭氏陰性菌株，無芽孢，採用透射電鏡觀察表明該菌株為單鞭毛細菌，大小為0.5nmxl2pm。在肉湯培養基中生長24小時後，菌落大小為23mm，生長範圍為3040'C,最適生長溫度為37'C，生長pH為611，最適pH為8.0，其生理生化特性表現在，過氧化氫酶反應、氧化酶反應、硝酸還原反應、明膠反應、葡萄糖、D-木糖以及D-果糖利用的結果為陽性，乳糖、麥芽糖以及甘露糖利用結果為陰性，在有氧條件下生長。本發明對銅綠假單胞菌i^ew(/owomwflen/g!'wo^fPT121經BIOLOG全自動細菌鑑定儀鑑定，表明該菌株與銅綠假單胞菌屍wwffo加ow^yam^/"(wa相似度(SIM)為0.748，經16SrDNA序列分析表明與該序列相似度高於98%的菌株均為Pwm/o附omw屬菌株，其中與屍wwctowo"osflen^gz'wwaMML2212相似度為99%。本發明針對該菌株進行了有機溶劑耐受性實驗，發明菌株PwwdoffJomwawwgZ"osaPT121能在含有10%不同有機溶劑的培養基中生長。本發明對該耐有機溶劑蛋白酶產生菌PT121進行了產酶優化，優化後產酶量高達10876U/mL。本發明對該菌產生的耐有機溶劑蛋白酶進行純化，經過一步純化達到電泳純，其比活性高達134045U/mg。本發明對該耐有機溶劑蛋白酶進行了酶學性質的研究，實驗證明該蛋白酶對多種有機溶劑都具有良好的耐受性，並且耐受濃度高達50%(Wv)以上，大大優於多數已經報導耐有機溶劑蛋白酶耐受濃度(25%，v/v);該耐有機溶劑蛋白酶的最適pH為8.0，有效作用的pH值較寬，為610，為中性偏鹼性蛋白酶，其最佳反應溫度為6(TC，60'C處理1小時，其酶活還維持在80%,表明其具有良好的熱穩定性。本發明分離克隆到該菌株所產耐有機溶劑蛋白酶的編碼基因，它具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，為此基因的改造並在各種外源基因表達系統中高效表達提供了優良的基因材料。通過PCR法分離克隆了這一耐有機溶劑蛋白酶基因，DNA全序列分析結果表明，該耐有機溶劑蛋白酶基因全長1497個核苷酸，編碼498個胺基酸，成熟蛋白酶為301個胺基酸，與銅綠假單胞菌屍wwifomomwaerwg/"cwflstrainK同源性為98%，蛋白質一級結構同源性為97%。其胺基酸序列示於SEQIDNO:2。本發明還提供了耐有機溶劑蛋白酶PT121在有機相中催化肽合成中的應用。將純化獲得的蛋白酶PT121成功應用到有機相合成肽的反應中，結果表明在含有50%(v/v)DMSO的Tris-HCl(pH8.0，0.05M)中，產物甜味劑Aspartame的前體Cbz-Asp-Phe-NH2相對Cbz-Arg的生成率高達85~95%，而且產物直接在溶劑中析出，非常易於回收。本發明的有益效果在於所提供的耐有機溶劑蛋白高產菌i^ewcfowomwaerwg/wasaPT121以及其耐有機溶劑蛋白酶基因證明了該有機溶劑蛋白酶具有高產率、易純化、具有高比活、有機溶劑耐受性強、作用pH範圍廣、耐高溫等優點。該耐有機溶劑在有機溶劑中催化小肽前體的成功應用，進一步證明該耐有機溶劑蛋白酶在有機溶劑催化反應所表現的優良性質，該蛋白酶將來在有機相催化肽合成以及製藥、毛紡、洗滌、皮革加工等行業的應用潛力巨大。圖1PT121菌體的透鏡電鏡照片(5000X)圖2菌株PT121的溶劑耐受性圖3純化後的耐有機溶劑蛋白酶的SDS-PAGE電泳分析圖4耐有機溶劑蛋白酶的最適pH圖5耐有機溶劑蛋白酶的pH穩定性圖6耐有機溶劑蛋白酶的最適反應溫度圖7耐有機溶劑蛋白酶的熱穩定性本發明的微生物分類命名為銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaPT121，保藏日期為2008年3月6日，保藏單位全稱為中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏編號CCTCCM208029。具體實施方式實施例一本實驗說明產生耐有機溶劑蛋白酶的天然菌株的篩選程序。採用不同濃度環己垸、甲苯、丙酮等有機溶劑為篩選壓力從油汙土樣中篩選獲得耐有機溶劑極端微生物。採用牛奶瓊脂平板培養基，具體配方為胰蛋白腖5g/L，酵母粉3g/L，脫脂奶粉25g/L，瓊脂12g/L。將所篩選到的耐有機溶劑微生物接種於牛奶瓊脂平板，根據菌落與透明圈大小的比值，初步篩選蛋白酶產量高的菌株。此方法篩選到具有蛋白酶產量高的耐有機溶劑極端微生物10株。為了進一步檢測所分泌蛋白酶的溶劑耐受性，對10株菌的蛋白酶產生能力和所產蛋白酶的耐有機溶劑性質進行全面的檢測。將所篩選到的高活力菌株接種到產酶發酵培養基，具體配方為胰蛋白腖10g/L，(NH4)2SO41.0g/L，KH2P040.5g/L，MgSO40.3g/L，CaCl21.0g/L，NaC11.0g/L，甘油6.3g/L,p脂。培養溫度為37。C，培養時間為72h,搖床轉速為180rmp。發酵結束後，10,000rmp4'C離心15min，取上清為粗酶液。取粗酶液lmL分別加入等體積的氯仿、苯、己醇、異戊醇、丁醇、異丙醇、丙酮、乙醇、二甲基甲醯胺(DMF)和二甲基亞碸(DMSO)，於30。C、150rpm震蕩處理24h，以酪蛋白為底物檢測蛋白酶剩餘酶活；選取具有最高剩餘活力的菌株作為耐有機溶劑蛋白酶生產菌株。蛋白酶活力檢測方法為配製酪蛋白含量為2%的pH為8.0的Tris-HCl緩衝液作為反應底物。取1mL稀釋酶液加入1mL反應底物，40'C保溫10min，加入4mLTCA反應終止液(O.llM三氯乙酸，0.22M醋酸鈉，0.33M醋酸)終止反應，4r放置15min,15000rpm離心15min，於280nm處檢測紫外吸光值。每1個單位(U)蛋白酶**酶活定義為，在相應條件下，每分鐘催化產生l嗎酪氨酸(U=ng/min)所需的酶量為l個酶活力單位。通過酶活性檢測以及有機溶劑穩定性檢測，其中一株具有優良耐受性的蛋白酶生產菌株所產蛋白酶活力高達10876U/mL,經過BIOLOG自動細菌鑑定儀鑑定和16SrDNA序列分析，表明該菌株屬於銅綠假單胞菌屬，並命名為Pwwc/owomw加n^/wosaPT121，該菌即為進一步研究的材料。實施例二本實驗說明耐有機溶劑極端微生物屍WMc/owomwaerwg/"osaPT121的生物學性質。生理生化性質對該菌株的革蘭氏染色觀察表明該菌株為革蘭氏陰性菌株，無芽孢，採用透射電子顯微鏡觀察(圖1)表明該菌為單鞭毛細菌，大小為0.5pmxl2pm。在肉湯培養基中生長24小時後，菌落大小為23mm，生長範圍為3040'C，最適生長溫度為37'C，生長pH為611，最適pH為8.0,其生理生化特性表現在，過氧化氫酶反應、氧化酶反應、硝酸還原反應、明膠反應、葡萄糖、D-木糖以及D-果糖利用的結果為陽性，乳糖、麥芽糖以及甘露糖利用結果為陰性，在有氧條件下生長。該菌部分生理生化鑑定特徵如表1。表1菌株PT121的部分生理生化特徵特徵結果特徵結果過氧化氫酶反應+D-木糖+氧化酶反應+D-果糖+硝酸還原反應+乳糖—明膠反應+麥芽糖一葡萄糖+甘露糖—菌株的溶劑耐受性實驗以培養過夜的屍wwfifomomwaen^/"owPT121培養物為種子液，以2%的接種量接種至MLB培養基，分別加入18種有機溶劑(圖2)，每500mL三角瓶裝液量為50mL(其中有機溶劑含量為30%)，以橡膠塞封口，與37'C搖床180rpm培養，分別在24h，36h和48h取樣檢測細胞乾重(mg/mL)，實驗結果如圖2所示。實驗表明菌株PT121能在含有不同濃度有機溶劑的培養基中生長，其中LogPo/w高於3.0的有機溶劑如十四烷，癸烷，壬烷，十二烷醇，辛烷，庚烷，己烷，環己垸等有機溶劑對PT121的生長影響較小；而LogPo/w低於3.0的有機溶劑甲苯，氯仿，苯，己醇，異戊醇，丁醇，異丙醇，丙酮，乙醇，DMF,DMSO等能明顯抑制菌株PT121的生長。實驗表明菌株PT121對高濃度的有機溶劑有一定的耐受性。實施例三本實驗說明耐有機溶劑蛋白酶的純化程序。首先將菌株在產酶培養基中培養72h後，10，000rmp在4'C離心15min，取上清作為粗酶液，將粗酶液置於冰浴中，一邊攪拌一邊緩慢加入NaCl到終濃度為1.6mol/L。將處理過的上清液加到用含1.2mol/LNaCl，0.05MTris-HCl緩衝液(pH8.0)平衡過的PhenylsepharoseFastFlow層析柱，用0.05M的Tris-HCl(pH8.0，NaCl含量為1mol/L)的緩衝液進行洗脫，收集洗脫液。發酵液上清僅經過一步色譜柱分離，通過SDS-PAGE(圖3)分析表明純化蛋白酶己經達到電泳純。該蛋白酶亞基分子量約為33kDa。蛋白酶純化的回收率和純化倍數見表2，經過一步分離純化後，純化倍數為4.9，回收率為52%，最終蛋白酶比活達到134045U/mg。表2耐有機溶蛋白酶PT121的純化步驟及結果tableseeoriginaldocumentpage9注蛋白質濃度採用考馬斯亮蘭法測定實施例四本實驗說明耐有機溶劑蛋白酶PT121的酶學性質的測定方法。耐有機溶劑蛋白酶的溶劑耐受性檢測將純化後的lmL蛋白酶稀釋液分別加入17種等體積的有機溶劑(表3)置於密封的試管中，以加入等體積0.05MTris-HCl緩衝液中(pH9.0)為對照，30'C，140rpm振蕩。分別在5天，10天和15天取樣，以酪蛋白為底物檢測蛋白酶活力，結果如表3所示。耐有機溶劑蛋白酶PT121具有良好的有機溶劑耐受性，在已經研究的17種有機溶劑中，異丙醇、丙酮、乙醇、DMF對酶活影響較大，在5天以後，相對酶活力都在70%以下。氯仿、己醇、異戊醇和丁醇對蛋白酶酶活力有一定影響，但在15天後相對酶活力仍然保持在60%以上。其餘的有機溶劑對蛋白酶的相對酶活力幾乎沒有影響。實驗表明耐有機溶劑蛋白酶PT121對多種有機溶劑具有優良的耐受性。表3有機溶劑對蛋白酶穩定性的影響有機溶劑_^2i^_酶活力(。/。)對照~十四烷7.6103a5.6103a4.5103a4.0102a3.5103a環己烷3.2102a甲苯2.5100a氯仿2.066a苯2.0127a己醇1.888a異戊醇1.394a正丁醇0.867aDMSO-1.35100a異丙醇0.0523b丙酮-0.2317b乙醇-0.2452bDMF-1.062b注a，30°C，140卬m保溫15天；b，30°C,140rpm保溫5天耐有機溶劑蛋白酶最適反應pH值和pH穩定性的測定以不同pH值的酪蛋白為底物，以pH8.0條件下的反應活力為參照(100%)，不同pH體系中的酶活如圖4所示，PT121菌株所產蛋白酶在pH8.0反應體系中具有最佳活力。從圖5中可以看出蛋白酶PT121有效作用的pH值較寬，為610，為明顯的中性偏鹼性蛋白酶。以原始酶液的酶活為參照檢測蛋白酶PT121的pH穩定性，將蛋白酶PT121加入pH412的緩衝溶液中30'C保溫1h後測量酶活力，實驗表明該蛋白酶在pH511的範圍具有很高的穩定性，在pH12的溶液中保溫1h以後仍然保留50%以上酶活力。耐有機溶劑蛋白酶最適反應溫度和熱穩定性的測定耐有機溶劑蛋白酶的最適溫度的測定為在0.05MTris-HCl緩衝體系(pH8.0)下，在不同的溫度條件下以酪蛋白為底物進行酶促反應。熱穩定測定蛋白酶在3(TC、40'C、50°C、6(TC、7(TC下處理lh以後，測定殘留酶活。酶的最適反應溫度測量結果表明(圖6)，純化後的蛋白酶在4(TC7(TC反應時，具有較高的蛋白酶活力。該蛋白酶最適反應溫度為60'C，在80'C條件下反應仍然具有最佳情況下20M的酶活力，在熱穩定性實驗中(圖7)，蛋白酶60'C處理1h後仍然保留80%左右的酶活力，這表明該蛋白酶具有較好的熱穩定性。實施例五本實驗說明耐有機溶劑彈性蛋白酶編碼基因的分離克隆程序採用酚一氯仿法抽提菌體總DNA。根據銅綠假單胞菌/^ewcfo/womwaen/g/mwastrainK及其彈性蛋白酶基因序列，在CDS兩端外各約100bp處設計引物，擴增有機溶劑蛋白酶的CDS編碼序列。將CDS編碼序列的PCR片段電泳回收後克隆到pMD18-T載體，進行序列分析。設計的引物為EUF:AGGACTGATACGGCTGTTCCGATCEUR:AACGGCCCAAGCGACATAAAGCAPCR反應參數為94。C預變性5min;94'C變性30sec;65。C退火30sec，72。C延伸lmin30sec;循環19輪，每次循環退火溫度降低rC;94。C變性30sec;45。C退火30sec;72°C延伸lmin;循環16輪後，72'C保溫10min。根據該反應條件，擴增到了1.7kb的PCR片段，根據測定此蛋白的分子量。推斷出此酶成熟蛋白的編碼基因長度約lkb。將此片段連接至ljPmdl8-T載體，進行序列測定。結果表明，此片段有一個全長為1497bp的閱讀框，含有信號肽序列23個胺基酸，編碼成熟蛋白酶的胺基酸301個。實施例六本實驗說明耐有機溶劑蛋白酶PT121在有機催化肽合成中的應用以50mM的Cbz-Asp-OH和100mM的L-Phe-NH2為底物，分別以乙腈、丙酮、乙醇、DMSO、DMF為有機溶劑，在50mMTris-HCl(pH8.0)反應緩衝中分別加入等體積的上述溶劑，反應總體積為1mL，加入純化的PT121蛋白酶約1mg/mL，在37'C水浴中靜止反應，每兩小時取樣以蒸餾水(含0.05%三氟乙酸)/乙腈(60/40,v/v)稀釋20倍，以化學合成的產物為標準品採用反向HPLC檢測產物，結果表明，DMSO為最佳溶劑，在該條件下，Cbz-Asp-Phe-NH2相對於Cbz-Asp-OH的生成率在8h後達到8595%。序列表南京工業大學—種耐有機溶劑蛋白酶高產菌以及該耐有機溶劑蛋白酶的基因和應用njut200803034<170〉Patentlnversion3.311497DNA屍5^wofiowo"asaerwg/"cwaPT121CDS(1)..(1494)sigjpeptide(1)..(69)mat_peptide(592)..1atgaagaaggtttctMetLysLysValSer-195ggtgtttegccggccGlyValSerProAla-180aaaetccccageaagLysLeuProSerLys-165ttgcaagccgcggtcacgcttgacctgttgttcThrLeuAspLeuLeuPhe-190gettttgccgccgacctgAlaPheAlaAlaAspLeu-175getgcccagggcgcgcccAlaAlaGinGlyAlaPro-160ggcgetggcggtgccgacgttgcgateatg45ValAlalieMet-185ategacgtgtec90lieAspValSer-170ggcccggtcacc135GlyProValThr-155gaactgaaagcg180LeuGinAlaAlaValGlyAlaGly-150-145GlyAlaAspGluIxu-140LysAlaatecgcagelieArgSer-135acgaccctgThrThrLeucccaacProAsn-130ggcGlyaagLyscagGingtcValaccThr.125cgcArgtacTyr225gagcaattcGluGinPhe-120cacaacggcHisAsnGlygtaeggValArg-115gtgValgtcValggcGlygaaGlugccAla1103tClie3CCThr270gaagtcaagGluValLys-105ggtcccggcGlyProGlyaagageLysSer-100gtgValgcgAlagcgAlacagGincgcArg95ageggccatSerGlyHis318ttcgtcgccaacategetgccgacctgccgggcagePheValAlaAsnlieAlaAlaAspLeuProGlySer-90-85-80accaccgcggcgThrThrAlaAla366gtatecgccgagcaggtgctggcccaggccaagageValSerAlaGluGinValLeuAlaGinAlaLysSer-75-70-65ctgaaggcccagLeuLysAlaGin-60414ggccgcaagaccgagaatgacaaagtggaactggtgatecgcctgggcGlyArgLysThrGluAsnAspLysValGluLeuVallieArgIxuGly-55-50-45462gagaacaacGluAsnAsnatelie-40gccAlacaaGinctggtctacLeuValTyr-35aacAsngtcValtecSertacctgTyrLeu-30attliecccPro510ggcgagggaGlyGluGly-25ctgLeutegSereggArgccgcatttcProHisPhe-20gtcValateliegacAspgccAla15aagLysaccThrggcGly558gaagtgetcGluValLeu-10gatAspcagGintggTrpgaaggcctgGluGlyLeugccAlacacHis-1gccgagAlaGlu1gcgAlaggcGlyggcGly606cccggcggcProGlyGlyaacAsncagGin10aagLysateggcaaglieGlyLysUcTyr15accThrtacggtTyrGlyageSergacAsp20tacTyr654ggtccgctgategtcaacgaccgctgcgagatggacgacggcaacgtcGlyProLeulieValAsnAspArgCysGluMetAspAspGlyAsnVal702253035ateaccgtcgacatgaacageageaccgacg'acageaagaccacgccg750lieThrValAspMetAsnSerSerThrAspAspSerLysThrThrPro404550ttccgcttcgcctgcccgaccaacacctacaagcaggtcaacggcgcc798PheArgPheAlaCysProThrAsnThrTyrLysGinValAsnGlyAla556065tattcgccgctgaacgacgcgcatttcttcggcggcgtggtgttcaaa846TyrSerProLeuAsnAspAlaHisPhePheGlyGlyValValPheLys70758085ctgtacegggactggttcggc.accageccgctgacccacaagctgtac894LeuTyrArgAspTrpPheGlyThrSerProLeuThrHisLysLeuTyr9095100atgaaggtgcactacgggcgcagegtggagaacgcctactgggacggc942MetLysValHisTyrGlyArgSerValGluAsnAlaTyrTrpAspGly105110115acggcgatgetcttcggcgacggcgccaccatgttctatccgctggtg990ThrAlaMetLeuPheGlyAspGlyAlaThrMetPheTyrProLeuVal120125130tcgctggacgtggcggcccacgaggtcagecacggcttcaccgagcag1038SerLeuAspValAlaAlaHisGluValSerHisGlyPheThrGluGin135140145aactecgggctgatetaccgcgggcaateaggcggaatgaacgaagcg1086AsnSerGlyLeulieTyrArgGlyGinSerGlyGlyMetAsnGluAla150155160165ttctecgacatggccggcgaggetgccgagttctatatgcgcggcaag1134PheSerAspMetAlaGlyGluAlaAlaGluPheTyrMetArgGlyLys170175180aacgacttcctgateggctacgacateaagaagggcageggtgcgctg1182AsnAspPheLeulieGlyTyrAsplieLysLysGlySerGlyAlaLeu185190195cgctacatggaccagcccagecgcgacgggcgatecategacaacgcg1230ArgTyrMetAspGinProSerArgAspGlyArgSerlieAspAsnAla200205210tcgcagSerGin215tactacTyrTyraacggcateAsnGlylie220gacAspgtgValC3CHiscacHistecSer225ageSerggcGlygtgtacValTyr1278aaccgcAsnArg230gcgttcAlaPhetacctgttgTyrLeuLeu235gccAlaaatAsntcgSerccgPro240ggcGlytggTrpgatAsp3CCcgcThrArg2451326aaggccLysAlattcgagPheGlugtgttcgtcValPheVal250gacAspgccAlaaacAsn255cgcArgTyrTyrtggTrpaccgccThrAla2601374acc8gcThrSeraactacAsnTyr265aaxageggcAsnSerGlygccAlatgcCys270gggGlygtgValattliecgcArgtcgSer275gcgC3gAlaGin1422aaccgcAsnArgaactacAsnTyr280tcggcggetSerAlaAlagacAsp285gtcVal3CCThreggArggcgAlattcPhe290ageSeraccgtcThrVal1470ggcgtgGlyVal295acctgcThrCysccgagegcgProSerAla300ttgLeutaa14972498PRTi^ewdowowosaerwg//(waPT1212MetLysLysValSerThrLeuAspLeuLeuPheValAlalieMet-195-190-185GlyValSerProAlaAlaPheAlaAlaAspUulieAspValSer-180-175-170LysLeuProSerLysAlaAlaGinGlyAlaProGlyProValThr-165-160-155LeuGinAlaAlaValGlyAlaGlyGlyAlaAspGluLeuLysAla-150-145-140lieArgSerThrThrLeuProAsnGlyLysGinValThrArgTyr-135-130-125GluGinPheHisAsnGlyValArgValValGlyGluAlalieThr-120-115-110GluValLysGlyProGlyLysSerValAlaAlaGinArgSerGlyHis-105-100-95PheValAlaAsnlieAlaAlaAspLeuProGlySerT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