一株紅球菌以及利用該菌株製備光學純手性亞碸的用途的製作方法

2023-08-01 19:24:16

專利名稱：：一株紅球菌以及利用該菌株製備光學純手性亞碸的用途的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物化工領域，涉及一株紅球菌及其用於生產光學純手性亞碸的用途。
背景技術：
：有機硫化合物在有機合成中很早就得到了廣泛的應用。光學活性的亞碸在不對稱合成中的應用也日漸增多，成為誘導許多不對稱轉化的一個重要工具。尤其在過去的20年中，手性亞碸化合物作為手性輔助試劑在不對稱合成領域中的應用呈現指數級的增長，確立了手性亞碸官能團在碳碳鍵和碳雜鍵形成過程中作為最有效、最通用手性控制因素的地位。手性亞碸化合物作為最成功、最有效的手性控制因素之一，至少存在三個有利的因素(l)手性亞碸具有高度的立體化學穩定性。由大多數亞碸的熱力學常數計算表明，亞碸的兩個異構體要在200'C左右才能發生轉化或消旋化。(2)它是手性信息的有效載體。亞碸類化合物具有一個錐形結構，與其它手性基團相比，它至少有三個具有明顯位阻和電子差異的取代基，即氧原子、孤對電子、兩個取代基(烷基或芳基)。當兩個取代基不同時，亞碸就具有手性特徵。(3)兩種構型的對映異構體都能較容易得到。手性亞碸的功能進一步表現在一些含有硫原子手性中心的具有藥理活性的化合物中。例如苯並吡唑類質子泵抑制劑是治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍、反流性食管炎、Zollinger-Emson綜合症、HP感染等眾多病症的有效藥物。目前使用較多的是替莫拉唑(Timoprazole)、皮可拉唑(Picoprazole)、奧美拉唑(Omeprazole)、蘭索拉唑(Lansoprazole)、潘妥拉唑(Pantoprazole)、雷貝拉唑(Rabeprazole)等。2002年這些質子泵抑制劑的全球銷售額達219億美元。然而在一些這類藥物當中，只有一種對映體表現出所需要的或者更好的藥理活性，因此這又進一步說明了獲得光學活性的亞碸是非常必要的。生產光學活性亞碸的途徑可以分為兩種，一種傳統的途徑是外消旋亞碸的動力學拆分，另一種途徑是前手性硫醚的不對稱氧化。外消旋體的拆分需要先將硫醚首先化學氧化為外消旋的亞碸，然後再對其進行拆分，過程比較繁瑣並且最高的理論得率只有50%。而與傳統的拆分相比較，硫醚的不對稱氧化則更加直接和經濟，它直接以前手性的硫醚為底物，理論得率可以達至!1100%。近年來，金屬催化劑和酶己經成功地用於前手性硫醚的不對稱氧化來生產光學活性的亞碸。但是利用金屬催化劑進行的硫醚不對稱氧化反應，反應條件比較苛刻，操作比較繁瑣，對環境不友好以及得到的產物"值普遍不高。而利用分離得到的酶進行反應，還需要先將酶分離純化出來，而酶的分離純化是非常困難的，並且在反應過程中還需要添加昂貴的輔因子(NADH或NADPH)。利用微生物整細胞作為催化劑進行硫醚的不對稱氧化反應，可以克服以上金屬催化劑和酶進行的反應所具有的缺點，它避免了酶的分離純化，而且由於細胞本身具有輔酶再生體系，可避免使用昂貴的輔因子，並且反應過程簡單、對環境友好，對於製備規模生產光學活性的亞碸是比較方便的。巳有一些文獻報導利用整細胞對硫醚進行不對稱氧化得到光學活性的亞碸。例如，Beecher等人(歷oec/mo/.丄e".，1994,16:909陽912)利用屍WMfifo/no"as;^"V/a[NCBI10007和^c/"eto6flc^"ca/coflc幼'a^NCBI9871對苯甲硫醚進行不對稱氧化，結果苯甲亞碸的產率分別為87。/。和97。/。,ee分別為27%和85%。Beecher等人(歷ofec/j"o/.1995，10:1069-1074)又利用&cc/iflraw3;cMcerev/w'aeNCYC73不對稱氧化苯甲硫醚，亞碸的得率為30%，"為60%。Adam等人(7Wra/ze士o":^sywmefry，2004,15:983-985)利用屍seMcfomonas,etfeWfo&ergew^對苯甲硫醚進行不對稱氧化，底物的轉化率為87%，"為91%。但這些以整細胞作為催化劑進行的硫醚不對稱氧化，產物的"值普遍不高，很難滿足合成過程中純度的要求。
發明內容本發明需要解決的技術問題是提供一株紅球菌及其用於製備光學活性亞碸的用途，以克服現有技術存在的上述缺陷。本發明的紅球菌(及/w^ococc^sp.ECU0066)是一種屬於紅球菌屬的菌株，是發明人從土壤樣品中，經過初篩、復篩及分離純化得到的高選擇性硫醚單加酶產生菌，該菌株已於2008年06月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，，保藏號為CGMCCNo.2547。上述的菌株是從上海、江蘇、山東等地區的200份土壤中篩選得到的，篩選的具體步驟如下從不同的環境中採集土壤樣品，利用苯甲硫醚為唯一碳源進行兩輪富集培養，篩選硫醚單加氧酶產生菌。通過反覆篩選，分離得到一株高活力和高選擇性的硫醚單加酶產生菌。本發明的菌種具有如下的微生物學特徵1、形態大小球狀，2~3拜，不產芽孢，無鞭毛，革蘭氏染色陽性；2、適宜生長環境適宜的生長溫度為2535。C，可以在pH59環境中生存；3、平板培養菌落特性在3(TC平板上培養12h可形成小的菌落，36h形成粘稠、溼潤的白色菌落，邊緣光滑，中間突出。隨著培養時間的延長，有紅色素生成，最後變成深紅色菌落。根據"伯傑氏鑑定手冊"提供的鑑定方法和上述的微生物學特徵，並經16SrDNA鑑定，確認該菌株為紅球菌屬(及o/iof/ococcwssp.)，標號為及o/iodococcw51sp.ECU0066。但該微生物菌體與之前報導的紅球菌株有明顯的不同，其主要不同之處在於:該菌能氧化一系列的硫醚，具有較高的產率和良好的選擇性，與之前的紅球菌相比較有很大的優勢。本發明的紅球菌株/o/zo^cocowsp.ECU0066可以用於生產單一對映體的苯甲亞碸或其衍生物，生產的方法包括如下的步驟(1)菌種的準備將紅球菌ECU0066在滅過菌(121。C，20~40min)的豐富培養基(例如葡萄糖1%，蛋白腖0.5%,酵母膏0.5%，瓊脂1.5%)平板上劃線，於2530'C靜置培養約2天後挑取單菌落，作為種子進行斜面培養(培養條件同上)，約2天後保存於4'C冰箱中備用。(2)菌株的培養將所述的紅球菌及o/w^cocc^sp.ECU0066採用本領域常規的方法，在發酵培養基中進行擴增培養2436h，溫度205(TC;再以上述培養液作為種子，基於發酵培養基體積的接種量為l10。/。(v/v)，接種至50ml的發酵培養基中，在2050。C下10(M60rpm搖床上培養24^48h，離心得到靜息細胞；所說的發酵培養基可採用常規的培養基，其中各組分的含量如下葡萄糖10~50g,蛋白腖1~20g，KH2P041~10g,K2HP041~10g，NaCl0.1~2g，MgS040.1~2g，水1000ml，pH3~8。(3)底物的生物轉化將收穫的靜息細胞，懸浮於pH為6.08.0的磷酸鉀緩衝溶液中，靜息細胞的含量為10100g(溼重)/L;加入前手性底物苯基甲基硫醚或其衍生物，最終濃度為5~100mM，在2540。C和100-160rpm的恆溫搖床上振蕩反應618h，然後從反應液中收集產物(5)-(-)-苯甲亞碸，精製後得到純品無色油狀液體，產率44.2%，ee99%，比旋光度[a]g=-134.5。(c0.7,acetone)。所述的苯甲硫醚及其衍生物具有如下結構式R廣S-R2，其中取代基&或R2分別選自苯基、Cl4的烷基、Cl4的烷基苯基、Cl4的垸氧基苯基、滷代苯基、噻唑基或噻吩基中的任意一種，且I^4R2。由上述公開的技術方案可見，採用本發明的紅球菌株生產光學純的手性亞碸，不僅具有較好的催化效果，能夠合成光學純度(>99%)的亞碸，而且催化劑易於製備、反應條件溫和、底物適應性廣，具有很好的工業應用開發前景。具體實施例方式通過下述實施例將有助於進一步理解本發明，但是不能限制本發明的內容。實施例l菌株的篩選配製富集培養基，成分如下(NH4)2SO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，K2HPO46.0g/L，MgSO40.5g/L，CaCl20.05g/L;另配製豐富培養基，組成如下葡萄糖15g/L，酵母膏5g/L，蛋白腖5g/L，KH2P041.0g/L，K2HP041.0g/L，MgSO40.5g/L，pH7.0。取少量的土樣懸浮於2ml的富集培養基中，加入苯甲硫醚的吐溫-80乳化液或甲醇溶液為唯一碳源，在254(TC條件下進行兩輪富集培養，總共需要2~4天；富集培養之後進行薄板層析，半定量地檢測產物苯甲亞碸的有無或含量。對有明顯硫醚氧化產物的富集培養液，取少量稀釋塗布於豐富培養基平板上培養1~2天，然後根據菌落的形態和顏色的不同挑取單菌落。將挑取的單菌落接種於2ml發酵液體培養基(其組成同豐富培養基)中，預培養24h，然後加入苯甲硫醚的甲醇溶液，使其終濃度為10mM，生物轉化18h之後，用乙酸乙酯萃取後點樣進行薄板層析，檢測苯甲亞碸的生成量，對有明顯硫醚氧化活性的菌株進行保藏。將保存的有明顯活性的菌株接種於50ml的發酵液培養基中，培養24h後，離心收集菌體。然後將離心下來的菌體再懸浮於IOml的磷酸緩衝液(50mM，pH7.0)中，再加入底物苯甲硫醚進行生物轉化，轉化18h後，用等體積的乙酸乙酯萃取後進行HPLC(使用日本Daicel公司的手性色譜柱ChiracelOD-H,小0.46cmx25cm，流動相為正己烷/異丙醇=93:7，v/v，流速lml/min)分析測定產物的對映體過量值(^p)和底物的轉化率。最後在800多株候選菌株中篩選出了能立體選擇性氧化苯甲硫醚生成OS)-苯甲亞碸的微生物及oto^coo^ysp.ECU0066。實施例2微生物的培養培養基配方葡萄糖15g/L，酵母膏5g/L，蛋白腖5g/L，KH2PO41.0g/L，K2HP041.0g/L，MgS040.5g/L，pH7.0，121°C高溫滅菌20min。取4'C保藏的紅球菌斜面，挑取一環接種至裝有50ml培養基的250ml的搖瓶中。在30'C下，160rpm培養12h，按5%(v/v)的接種量轉接至裝有100ml培養基的500ml的搖瓶中，於3(TC、160rpm繼續培養30h，離心收穫細胞。測得發酵液的酶活力約為34U/L，細胞濃度約30g(溼重)/L，單位溼細胞的酶活為1.0U/g溼細胞。細胞酶活力單位的定義為在30'C、pH8.0的條件下，每分鐘催化苯甲硫醚氧化生成l.Onmol苯甲亞碸所需要的細胞量。實施例3利用靜息細胞製備(5)-(-)-苯甲亞碸將離心得到的紅球菌及o幻必cocowsp.ECU0066靜息細胞12g懸浮於100ml磷酸緩衝液(50mM,pH8.0)中，加入底物苯甲硫醚，使其終濃度為5mM，在3(TC和160rpm的恆溫搖床上振蕩反應4h後，將反應液以12，000xg離心l0min，除去細胞。在上清液中加入NaCl至飽和，用50ml的乙酸乙酯萃取，重複三次。離心得到的細胞用20ml乙酸乙酯浸泡，重複兩次，將這兩部分乙酸乙酯合併，然後用飽和的NaCl溶液洗滌兩次，每次IOml。得到的乙酸乙酯萃取液用無水硫酸鈉乾燥過夜，旋轉蒸發除去乙酸乙酯，得到產物的結晶粗品，通過矽膠柱層析(石油醚:乙酸乙酯，體積比2:l)純化後得到(S)-(-)-苯甲亞碸無色油狀液體，產率44.2%，光學純度99%ee，[a]g=-134.5。(c0.7,acetone)。實施例4~10光學純苯甲亞碸衍生物的合成稱取實施例2的溼重12g的及o/wfifococc"ssp.ECU0066靜息細胞，以下列表中所列的苯甲硫醚衍生物為底物，底物濃度為5mM，反應體積為IOOml，在30'C和160rpm的恆溫搖床振蕩反應大約4h，間歇取樣測定反應的轉化率，至轉化完全時結束反應。將反應液以12，000xg離心10min，除去細胞。在離心之後的上清液中加入NaCl至飽和，用50ml的乙酸乙酯萃取，重複三次，離心得到的細胞用20ml的乙酸乙酯浸泡，重複兩次，將這兩部分乙酸乙酯合併，然後用飽和NaCl溶液洗滌兩次，每次IOml。將得到的乙酸乙酯萃取液用無水硫酸鈉乾燥過夜，旋轉蒸發除去乙酸乙酯，得到結晶粗品，通過矽膠柱層析(石油醚:乙酸乙酯，體積比2:1)純化後得到產物的純品，用液相色譜分析產物的ee值，稱量產物的質量計算產物的分離產率，並測定產物的比旋光度，對照文獻確定產物的絕對構型。反應的結果如下表所示。formulaseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage8formulaseeoriginaldocumentpage9權利要求1.一株紅球菌(Rhodococcussp.ECU0066)，保藏號為CGMCCNo.2547。2.—種如權利要求1所述的紅球菌(itof/ococcwssp.ECU0066)用於製備光學純苯甲亞碸及其衍生物。3.如權利要求2所述的紅球菌(/^o^cocc^sp.ECU0066)的用途，其特徵是通過如下步驟製備光學純苯甲亞碸及其衍生物(1)將所述的紅球菌及/w^ococowsp.ECU0066在發酵培養基中進行擴增培養，離心得到靜息細胞；(2)將(l)收穫的靜息細胞懸浮於pH為6.0-8.0的磷酸鉀緩衝液中，加入前手性的苯甲硫醚底物及其衍生物，在2540'C反應618h，然後採用常規的分離方法從反應混合物中收集光學純的苯甲亞碸及其衍生物；所述的苯甲硫醚及其衍生物具有如下結構式R廣S-R2，其中取代基&或R2分別選自苯基、C14的垸基、Cl4的垸基苯基、C14的垸氧基苯基、滷代苯基、噻唑基或噻吩基中的任意一種，且Rt^R2。4.根據權利2所述的方法，其特徵在於，靜息細胞在磷酸緩衝液中的含量為10~100g溼重/L。5.根據權利2所述的方法，其特徵在於，前手性底物苯甲硫醚及其衍生物的濃度為5~100mmol/L。6.根據權利2所述的方法，其特徵在於，所說的發酵培養基組成如下葡萄糖1050g，蛋白腖l~20g，KH2PO4l~10g，K2HPO4l~10g，NaC10.12g，MgSO40.1~2g，自來水lOOOml，pH3~8。7.根據權利3所述的方法，其特徵在於，所述的硫醚底物選自苯環對位被取代的苯甲硫醚衍生物或者側鏈被取代的苯基乙基硫醚以及帶有雜環的硫醚。全文摘要本發明公開了一株紅球菌(Rhodococcussp.ECU0066)以及用途，該菌株保藏號為CGMCCNo.2547。以該菌株的靜息細胞為生物催化劑，對前手性的苯烷基硫醚及其衍生物進行不對稱催化氧化，獲得了光學活性的手性苯甲亞碸及其衍生物。本發明所述的菌株及其立體選擇性生物氧化工藝不僅具有較好的催化效果，而且操作簡單、安全，成本低廉，產物容易純化，對環境友好。文檔編號C12N1/20GK101372676SQ20081004242公開日2009年2月25日申請日期2008年9月3日優先權日2008年9月3日發明者盧文芽,張建棟,李愛濤,林國強,許建和申請人:華東理工大學