血管發生的快速體內模型的製作方法

2023-08-02 03:06:16

專利名稱：血管發生的快速體內模型的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於研究生理現象及測定為調控生理現象而設計的藥物和 方案的有效性的模型系統。具體而言，本發明關注一種動物模型，它可用來 評估血管發生(angiogenesis)及評估各種藥物對其發展的影響。
背景技術：
血管發生、血流、血管內腫瘤細胞運輸、和外滲(extravasation)是腫瘤生 長、進展和轉移中的關鍵步驟，因此全世界的藥物發現研究項目也以它們為 耙標。抗血管發生性物質的發現和評估以前依賴於體內方法，諸如絨毛膜尿 囊膜測定法、猴虹膜新血管形成(neovascularization)模型、盤式(disc)血管發 生測定法、和各種使用角膜來評估血管生長的模型。這些模型在了解血管生 長及其抑制的機制中發揮了重要作用。
在我們的實驗室中開發了一種新的用於將人腫瘤血管發生成像的轉基 因棵鼠。幹細胞標誌物巢蛋白(nestin)在新生血管中表達，而在此轉基因小鼠 中，巢蛋白的一種調節元件驅動綠色螢光蛋白(NDGFP)，使得新生血管能夠 通過它們的GFP表達來可視化。許多表達紅色螢光蛋白(RFP)的人和齧齒動物 癌細胞系被植入ND-GFP棵鼠(nude mouce)中並廣泛生長。ND-GFP在正在增殖的內皮細胞中高度表達。通過雙色螢光成像來可視化正在生長的腫瘤中的
新生血管。Amoh, Y.等，Cancer Res. (2005) 65:5352-5357。多柔比星 (doxorubicin)已被證明可抑制移植有B16F10-RFP鼠黑素瘤的ND-GFP小鼠中 的新生腫瘤血管發生及腫瘤生長。Amoh, Y.等，(見上文)2337-2343。
另外，通過雙色成像可視化了正位移植有表達RFP的MIA PaCa-2人胰腺 癌的ND-GFP轉基因棵鼠中的初級(primary)胂瘤血管發生。吉西他濱 (Gemcitabine)顯著降低了腫瘤中的平均新生血管密度且降低了腫瘤體積。這 些結果首次證明了吉西他濱在胰腺癌中不但是腫瘤生長的抑制劑，還是血管 發生的抑制劑。Amoh， Y.等，J. Surg. Res. (2006) 132:164-169。在進一步的工 作中，通過雙色焚光成像可視化了ND-GFP轉基因棵鼠中XPA-1-RFP人胰腺 癌的肝轉移的血管發生。ND-GFP在正在增殖的內皮細^^和正在生長的肝轉 移的新生血管中高度表達。通過ND-GFP表達容易地定量了肝轉移中的新生 血管密度。吉西他濱顯著降低了肝轉移中的平均新生血管密度。Amoh,Y.等, Anticancer Res.(印刷中)。
2005年5月12日公布的PCT公開文本WO 2005/042715 (通過提述併入本 申請)也記載了關於可用於觀察新血管形成的轉基因動物的說明，其中螢光 蛋白在巢蛋白衍生的控制序列的控制下表達。
發明公開
本發明提供了上文所述血管發生檢測系統的改進。在這種方法中，可以 不依賴於腫瘤移植來測量血管發生，這通過在轉基因動物中皮下植入的藥物 投遞基質中提供激勵新血管形成的適宜生長因子來實現，所述轉基因動物在 源自巢蛋白的控制序列的控制下生成螢光蛋白。然後可以通過螢光顯微術直 接觀察所述生長基質植入物中新血管的存在。可以在同 一動物中植入缺乏生 長因子的對照基質，並且也可以觀察各種藥物和方案對新血管形成的影響。
本發明與血管發生的腫瘤模型相比是有優勢的，因為宿主動物不必是免 疫缺損的(immunocompromised)。由於不需要導入異種生物材料(除了螢光 蛋白本身)，可以使用有免疫活性的(immunocompetent)的受試者。通過適當 選擇基質，可以採用不引發免疫應答的基質。
如此， 一方面，本發明涉及用於觀察轉基因動物中的新血管形成的方法， 該方法包括通過螢光顯微術直接觀察所述動物中由植入皮下層(subcutis)中的生長 基質中螢光標記的細胞所形成的螢光標記的新生血管的存在、不存在或量；
其中所述螢光是由所述細胞中表達的螢光蛋白生成的。
在一個實施方案中，所述螢光蛋白的表達受到巢蛋白控制元件的控制。 新血管形成的量可以通過測量新生血管的長度來定量。典型地，採用包含生 長因子的生長基質，以及植入同 一動物中用於比較的對照藥物投遞基質。
另一方面，本發明涉及血管發生的轉基因動物模型，該動物模型經修飾 而在新生血管形成細胞中表達螢光蛋白，且其中所述動物模型進一步包含植 入皮下層中 一個或多個基質，其中至少 一個基質包含至少一種激勵血管發生 的生長因子。在一個實施方案中，所述螢光蛋白的表達處於源自巢蛋白的控 制元件的控制之下。
另一方面，本發明涉及鑑定調控血管發生的藥物或方案的方法，其中該 方法包括將所述藥物或方案施用於上文所述動物模型，觀察當存在所述藥物 或方案時，與該藥物或方案不存在時相比，所述藥物或方案對血管發生的存 在、不存在或量的影響，由此鑑定調控血管發生的藥物或方案。
附圖
簡述
圖l示意性顯示了整個過程的一個例子。如該圖第一部分所示，將 Gelfoam⑧移植到小鼠的體側皮下層中，其中該小鼠已過修飾而包含處於巢蛋 白第二內含子增強子控制下的綠色螢光蛋白核苷酸序列(ND-GFP轉基因小 鼠)。該移植後7天，創建皮瓣(skinflap)，該皮瓣含有已與先前存在的血管匯 合(merge)的Gelfoam 。通過焚光顯微術直接測量皮瓣中的Gelfoam⑧。
圖2顯示了在各種條件下觀察到的血管發生的比較。圖2a顯示了當 Gelfoam⑧含有鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)時，植入的Gelfoam 中的血 管發生。圖2b顯示了不含bFGF的對照Gelfoam⑧中血管發生的缺失。圖2c顯 示了多柔比星對含有bFGF的Gelfoam⑧中的血管發生的影響。圖2d是另一種 對照，其顯示了不含bFGF且用多柔比星處理的對照中血管發生的缺失。
圖3顯示了冷凍的、血管化的Gelfoam⑧的組織化學切片中的螢光與內皮 細胞標誌物CD31的相關性。圖3a顯示了通過螢光測定的血管分布，而圖3b 顯示了CD31的分布。
圖4顯示了給小鼠植入含有各種成分的Gelfoam⑧後7天平均新生血管長度(單位為mm/mm2)的比較(對小鼠施用或不施用多柔比星)。本發明的最佳實施方式本發明為測量任何藥物或方案對新血管系統(neovasculature)形成的影響 提供了便利且高效的模型。本文所述模型不依賴於與腫瘤形成和生長並發的 血管發生，本文所述模型單純地(cleanly)在人工基質中誘導血管發生，如此 可以測定藥物或方案對血管發生的特異性影響，並可以鑑定成功的方案和藥 物。所述模型可以是、但並非必須是免疫缺損的。它是這樣的轉基因動物， 在負責新生血管形成的內皮細胞中生成螢光蛋白。在這些細胞中的表達是通 過將編碼螢光蛋白的核苷酸序列置於組織選擇性啟動子或其它組織選擇性 控制序列的控制下來實現的。在本發明中特別有用的是源自巢蛋白的控制序 列，但是也可以使用內皮或其它血管形成細胞的其它控制序列。然後轉基因 動物會在適宜的血管形成細胞中選擇性生成螢光蛋白。然而，特異性不必是 完全的，因為新生血管會生長成不提供背景"噪音，，的中性基質。所述動物模型是對此目的有用的任何物種，典型的是哺乳動物，諸如齧 齒動物諸如大鼠或小鼠、家兔、靈長動物、或其它合適的受試者。新血管系統將在激勵下侵入合成基質，諸如Gelfoam⑧(Upjohn)。本文中 列舉Gelfoam⑧為例來進行說明，但是也可以使用其它基質，諸如MatrigelTM (BD Biosciences).基質僅須足夠多孔以支持新血管形成，而且有足夠保持力 (retentive),以能夠在皮下層中局部地供應生長因子。各種基質在本發明中是 有用的。所述基質既充當新血管系統的支架，又充當已知激勵血管發生的生 長因子的來源。典型地，會在動物模型中植入含有生長因子的基質及不含所 述生長因子的對照基質二者。在對照基質中，通常幾乎觀察不到新血管系統。 要植入的基質塊的尺寸取決於動物模型的性質。例如，對於小鼠，可以使用 邊長2-6mm的片。對於大型動物，則採用更大的片。片的厚度在l-3mm左右。 所述片應當是這樣的尺寸(dimension),使得它可以被包括在皮瓣中。合適的生長因子包4舌血管生成素(angiogenin)、 angiopoietin 1 、 Del 1 、成 纖維細胞生長因子(酸性的(aFGF)和鹼性的(bFGF))、卵泡抑素(follistatin)、 粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、肝細胞生長因子(HPGF)或散射因子(scatter factor, SF)、白介素-8、瘦蛋白(leptin)、胎盤生長因子、血小板衍生的內皮生 長因子(PDEGF)、血小板衍生的生長因子BB (PDGF-BB)、多效營養因子(pleiotropin, PTN)、增殖素(proliferin)、轉化生長因子-a (TGF-a)或-卩(TGF-卩)、 腫瘤壞死因子-a (TNF-a)、血管內皮生長因子(VEGF)、和前孩i粒體蛋白 (progranulin)。有些實施方案特別地使用酸性或鹼性FGF、 VEGF、和PDEGF。
關於標記內皮細胞，可以使用具有足夠輝度(brilliance)的任何螢光蛋白。 本文中例示了綠色螢光蛋白，但是也可以採用其它顏色的螢光，包括紅色、 黃色和藍色。在必要時，還可以修飾焚光蛋白以使其與宿主相容。
在一個典型的實驗中，在動物的一側皮下植入一小片經生長因子處理的 生長基質，而在另一側植入另一片不含生長因子的基質。合適長度的時間段 後，典型的是幾天，但是在一個典型的實施方案中可以在4小時與2周之間任 意選擇，暴露包含基質的皮瓣，並使用螢光顯微鏡進行評估。新血管系統作 為螢光是直接可見的。
然後可以通過對施用方案的動物中所觀察到的血管發生與類似構建但 未經處理的動物進行比較，來評估藥物或方案的影響。可以以這種方式評估 施用藥物或提供方案的任何合適方法。
許多以前的血管發生模型是胂瘤模型，它們要求腫瘤的宿主對於腫瘤是 嚴重免疫缺損的或同基因的。因為合成的生長基質不引發免疫應答，而螢光 蛋白或者不引發此類應答，或者可以經修飾而成為免疫透明的 (immunotransparent),所以在使用本發明的模型時不要求這些限制條件。這 能夠實現更現時的結果和更便利的分析。雖然下文實施例中使用了棵鼠，但 是在所述測定法中並非必須使用免疫缺損的動物。
"合成基質"意指自單體或其它成分從新合成的基質，或者是從活體系 統(但不是腫瘤)分離的基質。如此，例如，例示的Gdfoam源自豬明膠。
提供以下實施例來例示而非限制本發明。
實施例l:多柔比星對血管發生的影響
使用在內皮細胞中生成綠色螢光蛋白(GFP)的轉基因C57/B6棵鼠。用三 溴乙醇麻醉這些轉基因小鼠(6-8周齡)。將Gelfoam⑧(Pharmacia & Upjohn company, Kalamazoo, MI)塊(5 x 5 mm)用75pl RPMI 1640培養基(Cellgro， Herndon， VA)中的300ng石鹹性成纖維細胞生長因子(bFGF) (Chemicon, Temecula， CA)處理，或者不處理。將Gelfoam⑧塊移植到轉基因小鼠兩邊體 側皮下層中， 一側植入一塊經過處理的Gelfoam⑧塊，另一側植入一塊未經處理的Gelfoam⑧塊。在移植Gdfoam⑧後第0、 1、和2天，給一組小鼠每天一次 ip注射5pg/g多柔比星，而另一組給予0.9% NaCl溶液(溶媒對照)。第7天在 麻醉下製作皮瓣。通過體內焚光顯微成像來測量皮瓣中發焚光的新生血管的 長度，由此對血管發生定量。
使用配備有汞燈和50W電源的Leica LZ12型螢光立體顯樣H竟。通過 D425/60帶通濾光片和470 DCXR雙色鏡產生GFP的選擇性激發。在 Hamamatsu C5810 3晶片冷色電荷耦合器件相機(Hamamatsu Photonics, Bridgewater， NJ)上穿過長通(long-pass)濾光片(GG475; Chroma Technology, Brattleboro, VT)收集所發射的焚光。使用IMAGE PRO PLUS 3.1軟體(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)對圖像進行反差和亮度加工並進行分析。在 IBM PC上直接捕獲1024 x 724像素的高解析度圖像，或者通過高解析度Sony VCR (SLVR1000型；Sony, Tokyo)上的視頻輸出來連續地捕獲該圖像。
使用抗大鼠免疫球蛋白辣根過氧化物酶檢測試劑盒(BD Pharmingen， San Diego, CA)遵循製造商的說明書檢測血管化的Gelfoam⑧的冷凍切片中發 焚光的新血管系統和CD31的共定位。 一抗是抗CD31單抗(1:50; Chemicon， Temecula, CA)。抗原染色使用底物-色原體3,3'-二氨基聯苯胺染色。
實驗數據表述成均值士SD。統計學分析使用雙尾Student氏t檢驗來進行。
圖2顯示了結果的比較。圖2a-2d中的短線代表50(Him的長度。如圖2a所 示，在給予對照(0.9。/。NaCl)溶液的小鼠中，在含bFGF的Gelfoam⑧小塊中形 成了大的新血管系統複合體。即使在這些小鼠中，在不含bFGF的Gelfoam⑧ 中沒有觀察到顯著的新血管系統(圖2b)。如圖2c所示，施用多柔比星的小鼠 在經bFGF處理的泡沫體中顯示出大大減少的新血管系統，而在不含bFGF的 泡沫體中觀察不到血管發生。
圖4是圖2所示結果的圖示。在施用作為對照的氯化鈉的小鼠中，在含 bFGF的Gelfoam⑧小塊中的平均新生血管長度(單位為mm/mm2)幾乎為6， 而且這些小鼠中即使在未經如此處理的Gelfoam⑧中也表現出一些血管發生 的存在。在施用多柔比星的小鼠中，經bFGF處理的Gelfoam⑧中的血管發生 的程度降低到低於用氯化鈉處理的小鼠中的未經處理的Gelfoam⑧。
圖3顯示了發焚光的血管與CD31 (—種內皮細胞標誌物)表達之間的相 關性。在圖3中，短線代表100nm。在第7天由經bFGF處理的Gelfoam⑧製成 冷凍切片。圖3a顯示了通過螢光測定的新血管分布，圖3b顯示了CD31分布。血管的分布與CD31的分布實際上是同樣的,
權利要求
1. 一種血管發生轉基因動物模型，該模型包含經修飾而在新生血管形成細胞中表達螢光蛋白的動物且進一步包含在皮下層中植入的一個或多個生長基質單元。
2.權利要求l的動物模型，其中所述螢光蛋白是由編碼核苷酸序列在源自 巢蛋白的控制序列的控制下生成的。
3.權利要求l的動物模型，其中至少一個所述生長基質單元含有血管發生 的生長因子。
4.權利要求3的動物模型，該模型進一步包含至少一個未經生長因子處理 的生長基質單元。
5.權利要求3的動物模型，其中所述生長因子是VEGF或bFGF。
6.權利要求1的動物模型，其中所述生長基質單元包含在皮瓣中。
7. 權利要求1的動物模型，其中所述生長基質單元是膠原凝膠。
8. 一種鑑定調控血管發生的藥物或方案的方法，該方法包括將所述藥物或 方案施用於權利要求3的動物模型，比較未施用所述藥物或方案的對照 動物模型中的血管發生程度。
9.一種觀察轉基因動物中的新血管形成的方法，該方法包括通過螢光顯微所形成的螢光標記的新生血管的存在、不存在或量， 其中所述螢光是由所述細胞中表達的螢光蛋白生成的；且 其中所述生長基質包含血管發生的生長因子。
10.權利要求9的方法，其中通過測量所述新生血管的長度來對新血管形成 定量。
11.權利要求9的方法，其中所述螢光蛋白的生成受到源自巢蛋白的控制元 件的控制。
12.權利要求9的方法，其中所述生長基質是膠原凝膠。
13.權利要求9的方法，該方法進一步包括比較包含生長因子的所述生長基質中的新生血管量與不含生長因子的對照生長基質中觀察到的新生血
14.權利要求9的方法，其中所述觀察是通過螢光顯微術進行的
15.權利要求14的方法，其中所述生長基質包含在皮瓣中。
全文摘要
本發明描述了血管發生的動物模型。新生血管被包含生長因子的生長基質所支持。新生血管被在形成這些血管的細胞中選擇性表達的螢光蛋白所標記。
文檔編號G01N33/00GK101523205SQ200780036277
公開日2009年9月2日 申請日期2007年9月27日 優先權日2006年9月27日
發明者天羽康之 申請人:抗癌公司