一種九味獐牙菜片的製備方法及其在製備抑制淋巴瘤細胞yac-1細胞增殖藥物中的應用的製作方法
2023-07-30 09:07:31
一種九味獐牙菜片的製備方法及其在製備抑制淋巴瘤細胞yac-1細胞增殖藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於中藥【技術領域】，具體涉及一種九味獐牙菜片的製備方法及應用。本發明的九味獐牙菜片的製備方法，由獐牙菜53.6g、金腰草17.9g、榜嘎35.7g、木香35.7g、兔耳草35.7g、苦蕒菜42.9g、角茴香35.7g、小檗皮28.6g、波稜瓜子14.2g作為原料藥製成，採用超臨界萃取、微波萃取和大孔樹脂吸附製備而成，使得鹽酸小檗鹼含量有很大提高。本發明還提供了九味獐牙菜片在製備抑制小鼠淋巴瘤細胞YAC-1細胞增殖藥物中的應用。
【專利說明】一種九味獐牙菜片的製備方法及其在製備抑制淋巴瘤細胞YAC-1細胞增殖藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於中藥【技術領域】，具體涉及一種九味獐牙菜片的製備方法及其在製備抑 制小鼠淋巴瘤細胞YAC-I細胞增殖藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 九味獐牙菜膠囊標準號WS-11182 (ZD-1182)-2002,記載於國家中成藥標準彙編 內科肝膽分冊。由獐牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香35. 7g、兔耳草35. 7g、苦蕒 菜42. 9g、角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波稜瓜子14. 2g作為原料藥製成，具有清熱，消炎，止 痛的功效。用於膽囊炎，急性黃疸型肝炎。
[0003] 現有技術中，尚未有九味獐牙菜膠囊在提取製備方面採用CO2超臨界萃取、微波技 術和大孔樹脂吸附技術提取的報導，而中藥直接打粉取的方法，工藝粗糙、落後，雜質多，導 致患者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床上應用。
【發明內容】
[0004] 為了解決上述的技術問題，本發明提供了一種九味獐牙菜片的製備方法。
[0005] 本發明的另一個目的在於提供一種九味獐牙菜片在製備抑制小鼠淋巴瘤細胞 YAC-I細胞增殖藥物中的應用。
[0006] 本發明的目的是通過如下的方案實現的： 一種九味獐牙菜片的製備方法，由獐牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香 35. 7g、兔耳草35. 7g、苦蕒菜42. 9g、角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波稜瓜子14. 2g作為原 料藥製成，所述的製備方法由下列步驟組成：取木香、角茴香，粉碎成細粉，加入到C02超 臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力 20-30MPa，溫度30-50°C，C0 2流量l-3ml/g生藥^min,萃取時間130-170min，得超臨界萃取 物，備用；萃取後的木香、角茴香殘渣與其他七味藥材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入微波 萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合併萃取液，濃 縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回 收乙醇，濃縮並乾燥，得微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，60%乙醇 制顆粒，乾燥，壓片，製成200片，每片重0. 3g。
[0007] 上述的九味獐牙菜片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑佔總萃取溶劑 的體積百分比為5%。
[0008] 上述的九味獐牙菜片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25 MPa。
[0009] 上述的九味獐牙菜片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
[0010] 上述的九味獐牙菜片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中CO 2流量2!111/^生 藥? min〇
[0011] 上述的九味獐牙菜片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取時間為150min。
[0012] 上述的九味獐牙菜片的製備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0013] 上述的九味獐牙菜片的製備方法中，所述微波萃取每次萃取時間為8分鐘。
[0014] 上述的九味獐牙菜片在製備抑制小鼠淋巴瘤細胞YAC-I細胞增殖藥物中的應用。
[0015] 現有技術中，九味獐牙菜膠囊口服，一次4-5粒，一日2-3次。九味獐牙菜膠囊服 藥量大。採用本發明方法製備成的九味獐牙菜片每片重〇. 3g，每次僅需2片，一日服用2-3 次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結論可以通過下述試驗證明。
[0016] 試驗一、不同方法製備的九味獐牙菜片中鹽酸小檗鹼含量的比較 1、儀器及試藥本發明九味獐牙菜片：按實施例1方法製備，使用300g原料藥，經提取 製成200片，每片重0. 3g。原九味獐牙菜膠囊，按照WS-11182 (ZD-1182)-2002標準方法 製備，作為對照。Agilentl200高效液相色譜儀；AE240電子分析天平；鹽酸小檗鹼對照品 (中國藥品生物製品檢定所)。
[0017] 2、方法 照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VI D)測定。
[0018] 色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；乙 腈-0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調節pH值至3) (22:78)為流動相；檢測波長為 347nm。理論板數按鹽酸小檗鹼峰計算應不低於5000。
[0019]對照品溶液的製備精密稱取鹽酸小檗鹼對照品適量，加甲醇製成每Iml含鹽酸 小檗鹼28呢的溶液，即得。
[0020] 本發明產品供試品溶液的製備取本發明的九味獐牙菜片，研細，取0. lg，精密稱 定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超聲處理50分鐘，放冷，再稱定重量， 用甲醇補足減失的重量，搖勻，取上清液，用微孔濾膜（〇. 45Mm)濾過，取續濾液，即得。
[0021] 對照品供試品溶液的製備取本對照的九味獐牙菜膠囊，研細，取〇. 5g，精密稱 定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超聲處理50分鐘，放冷，再稱定重量， 用甲醇補足減失的重量，搖勻，取上清液，用微孔濾膜（〇. 45Mm)濾過，取續濾液，即得。
[0022] 測定法分別精密吸取對照品溶液、本發明產品供試品溶液與對照品供試品溶液 各5卩1，注入液相色譜儀，測定，即得。
[0023] 3、結果 結果表明，本發明九味獐牙菜片中鹽酸小檗鹼的含量為3. 6-7mg/片；而原九味獐牙菜 膠囊中鹽酸小檗鹼的含量為〇. 71mg/粒，每片鹽酸小檗鹼含量相當於原膠囊劑含量的5-10 倍，在服用量減少的情況下，鹽酸小檗鹼含量有很大提高。
[0024] 上述研究表明，採用本發明製備方法製備的九味獐牙菜片，有效成分含量遠遠高 於WS-11182 (ZD-1182) -2002標準記載的方法製備的九味獐牙菜膠囊。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合具體實施例對本發明作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解 本發明，但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例，凡基於本發明上述 內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
[0026] 實施例1 取猜牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香35. 7g、兔耳草35. 7g、苦蕒菜42. 9g、 角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波稜瓜子14. 2g :取木香、角茴香，粉碎成細粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa， 溫度40°C，C(V流量2ml/g生藥min,萃取時間150min，得超臨界萃取物，備用；萃取後的木 香、角茴香殘渣與其他七味藥材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波 萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合併萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸 附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮並乾燥，得微波 提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，60%乙醇制顆粒，乾燥，壓片，製成200 片，每片重0. 3g。
[0027] 經檢測，成品中鹽酸小檗鹼的含量為7. 05mg/片。
[0028] 實施例2 取猜牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香35. 7g、兔耳草35. 7g、苦蕒菜42. 9g、 角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波稜瓜子14. 2g :取木香、角茴香，粉碎成細粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa， 溫度50°C，C(V流量3ml/g生藥min,萃取時間130min，得超臨界萃取物，備用；萃取後的木 香、角茴香殘渣與其他七味藥材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波 萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分鐘，合併萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸 附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮並乾燥，得微波 提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，60%乙醇制顆粒，乾燥，壓片，製成200 片，每片重0. 3g。
[0029] 經檢測，成品中鹽酸小檗鹼的含量為3. 60mg/片。
[0030] 實施例3 取猜牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香35. 7g、兔耳草35. 7g、苦蕒菜42. 9g、 角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波稜瓜子14. 2g :取木香、角茴香，粉碎成細粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力20MPa， 溫度30°C，CO 2流量lml/g生藥? min，萃取時間170min，得超臨界萃取物，備用；萃取後的 木香、角茴香殘渣與其他七味藥材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微 波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合併萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大 孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮並乾燥，得 微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，60%乙醇制顆粒，乾燥，壓片，製成 200片，每片重0. 3g。
[0031] 經檢測，成品中鹽酸小檗鹼的含量為4. 88mg/片。
[0032] 實施例4 :九味獐牙菜片抑制小鼠淋巴瘤細胞YAC-I細胞增殖的實驗研究資料 1.實驗材料 I. 1實驗用細胞株 小鼠淋巴瘤細胞YAC-I細胞，山東大學實驗室細胞庫，DMEM+10%FBS常規培養。
[0033] 1. 2實驗藥物 研究藥物：本發明九味獐牙菜片：按實施例1方法製備。
[0034] 藥液儲液：稱取IOOmg九味獐牙菜片，溶於5ml無水乙醇中，0. 2Mm濾器過濾， 500Wdoff管分裝，-20°C存儲，同時0. 2Mm濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0035] I. 3實驗試劑 DMEM ( GIBCO公司Cat. No. 12100-061 Lot. No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技 有限公司Lot. No. 100419) ;NaHC03(上海久億化學試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot. No. 1088387) Jrypsin (AMRESC0 公司）;EDTA (AMRESC0 公司）;Penicillin G Sodium Salt (AMRESC0公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇（溜博亞杜蘭經貿有限公 司）；MTT (Biosharp 批號：0793) :PBS (實驗室自配）； 1. 4實驗器材 萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號：DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型 號：SPECTRAMX 190);C02培養箱（FORMA型號：3111);超淨臺（蘇淨集團安泰公司製造型號： SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號：S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司型 號：P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號：BT323S);全自動高壓滅菌鍋（日本SANYO 公司型號：MLS-3020);臺式電熱鼓風乾燥箱（上海精密實驗設備公司型號：DHG9123A);冰 箱（西門子公司型號：KG18V21TI);液氮罐（CBS型號：2001);低速離心機(上海安亭科學儀 器廠型號：KA-1000) ;0.2Mm 濾器（MILLIP0RE 型號：SLGP033RB) ; Icm 培養皿（NEST 公司）、 96孔培養板（NEST公司）；細胞計數板；離心管、移液管、Tips若干。
[0036] 2.實驗方法 DYAC-I細胞用DMEM+10%FBS於37°C、5%C02進行常規培養（10cm培養皿)，當細胞生長 至對數期時，收集細胞，棄去培養液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0. 25%胰蛋白酶-0. 04%EDTA， 37°C消化2min後，向其中加入5ml完全培養基中和反應，吹打細胞後將其轉入離心管中， IOOOrpm離心5min，調整細胞懸液濃度3 X IO4個/ml。
[0037] 2)將細胞種入96孔培養板中，每孔加入細胞懸液180M1，培養板放入細胞培養箱 中（37°C，5%C0 2)常規培養。
[0038] 3)根據細胞生長情況，一般長至50%_70%，加入九味獐牙菜片溶液，繼續培養24h。
[0039] 4) 24h 後加入 20W MTT 溶液（5mg/ml，即 0? 5%MTT)，繼續培養 4h。
[0040] 5) 4h後扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍幹，每孔如入200W二甲基亞碸，置搖床 上低速振蕩l〇min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0041] 6)同時設置本底(不加細胞，只加培養液)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介 質、培養液、MTT、二甲基亞碸)，每組設定6個復孔。
[0042] 7)結果以藥物對細胞的抑制率表示：細胞增值抑制率（%)=(對照孔OD值-給藥 孔OD值)、對照孔OD值X 100%。實驗重複3次。
[0043] 3.統計處理 採用MicrosoftExcel2007軟體中的相關分析和Studentt檢驗，數據以mean土S. D .表不。
[0044] 4.實驗結果 MTT法實驗後統計結果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對YAC-I細胞 增殖抑制有差異（P〈〇. 05)，劑量在lOmg/ml時該差異具有顯著性（P〈0. 01)，當劑量達到 15_20mg/ml時有極顯著性差異（P〈0. 001)。
[0045] 表1九味獐牙菜片對YAC-I細胞增殖抑制影響研究（X土 SD)
【權利要求】
1. 一種九味獐牙菜片的製備方法，由獐牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香 35. 7g、兔耳草35. 7g、苦蕒菜42. 9g、角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波稜瓜子14. 2g作為原料 藥製成，其特徵在於，所述的製備方法由下列步驟組成：取木香、角茴香，粉碎成細粉，加入 到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取 壓力 20-30MPa，溫度 30-50°C，CO2 流量1-31111/^生藥，111111，萃取時間13〇-17〇111111，得超臨界 萃取物，備用；萃取後的木香、角茴香殘渣與其他七味藥材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入 微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合併萃取液， 濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓 回收乙醇，濃縮並乾燥，得微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，60%乙 醇制顆粒，乾燥，壓片，製成200片，每片重0. 3g。
2. 根據權利要求1所述的九味獐牙菜片的製備方法，其特徵在於，所述CO2超臨界萃取 中夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3. 根據權利要求1所述的九味獐牙菜片的製備方法，其特徵在於，所述CO2超臨界萃取 中萃取壓力為25MPa。
4. 根據權利要求1所述的九味獐牙菜片的製備方法，其特徵在於，所述CO2超臨界萃取 中萃取溫度為60°C。
5. 根據權利要求1所述的九味獐牙菜片的製備方法，其特徵在於，所述CO2超臨界萃取 中CO2流量2ml/g生藥? min。
6. 據權利要求1所述的九味獐牙菜片的製備方法，其特徵在於，所述CO2超臨界萃取中 萃取時間為150min。
7. 根據權利要求1所述的九味獐牙菜片的製備方法，其特徵在於，所述微波萃取功率 為 7001
8. 根據權利要求1所述的九味獐牙菜片的製備方法，其特徵在於，所述微波萃取每次 萃取時間為8分鐘。
9. 權利要求1所述的九味獐牙菜片在製備抑制小鼠淋巴瘤細胞YAC-I細胞增殖藥物 中的應用。
【文檔編號】A61K9/20GK104306724SQ201410638364
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月13日 優先權日:2014年11月13日
【發明者】權棟棟, 朱立平, 陳雲, 李加美, 王麗麗 申請人:山東中大藥業有限公司