用於尿沉渣分析的多層載玻片的製作方法

2023-07-30 08:01:21

專利名稱：用於尿沉渣分析的多層載玻片的製作方法
用於尿沉渣分析的多層載玻片
背景技術：
本發明一般性涉及尿的各種類型的沉渣和顆粒分析。例子包括白血球、紅血球、上皮細 胞、卵形脂肪體、透明管型、粒性管型、白細胞管型、腎細胞管型、蠟樣管型、脂肪管型、尿酸 晶體、草酸鈣晶體、馬尿酸晶體、磷酸鈣晶體、三磷酸鹽晶體等。此類分析可用於確定患者是 否需要醫療照顧。目前，尿沉渣分析可通過手工顯微鏡檢術、流式細胞光度術、流式細胞成象和微流 控載玻片成象來完成。其中，微流控載玻片成象優於其它。手工顯微鏡檢術精確但卻是勞 動密集型的，並且需要經過培訓的技術人員。流式細胞光度術和流式細胞成象雖然需要較 少的手工作業，但不夠精確。往往需要隨後進行手工顯微鏡檢。流式細胞成象和流式細胞 光度術的例子可分別在US6，825，926和US3，826，364中找到。US5, 699，794討述了本領域的許多其它專利，公開了一種用於尿沉渣分析的自動 化系統和測定池(cell)。US3，777，283公開了一種塑料載玻片，其中利用了毛細管力來將 液體試樣吸入透明的觀察室。US4, 441，793公開了一種用於顯微鑑定的載玻片，其具有一或 兩個用於通過移液管將樣品引入觀察區的開口。然而，所述載玻片沒有將觀察室與樣品入 口分離，這使得更加難以在顯微鏡中精確地讀出圖象。在US6，004，821中可找到在載玻片 中進行手工顯微鏡檢術的另一個例子，其中在單個包含樣品的載玻片上進行了幾種類型的 分析。在一類分析中，一部分尿樣被送往用於鑑別尿管型的室。該室包括能從樣品中除去 水的吸水層(例如水凝膠)，固定管型以便目視檢查。在另一類分析中，析出了細菌和紅血 球、白血球並可以在具有可變深度的形成顆粒室中看到它們。近年來，採用微流控技術的分析在包括尿和血液在內的生物樣品中的應用越來越 突出。總的來說，微流控盤或類似的「晶片「通常提供一組互連的室，液體樣品流過它們與 不同的試劑相遇。樣品與試劑的反應提供與分析物在樣品中的存在有關的信息(例如變色 等)。在典型的微流控裝置中，所述室和互連通道形成在基體層(往往為塑性材料)中，且 在所述基體上放置覆蓋物。例子參見US7，094，354。這種微流控裝置可改造成適應尿樣的 沉渣目視分析。然而這種微流控裝置的製造成本相當高，可取的將是成本較低的設計。本 發明的發明人找到了一種成本較低但仍很精確的尿沉渣及其它顆粒的分析方法。US7, 094，354教導了藉助於小的離心力在微流控裝置中分離顆粒，特別是從全血 樣品中分離紅血球。這種分離與主體血液分離中採用的大離心力形成對比。使用了細長的 室以使紅血球可以在底部聚集，而分離的血漿從室的頂部抽出。室壁表面製成具有與紅血 球的表面能相匹配或稍低的表面能。適當的壁表面能和毛細管力的結合使得不使用大離心 力就能實現紅血球的分離。如果需要在尿樣中鑑別顆粒並加以研究，則這些顆粒應當是相對靜止的。上 述US6，004，821中公開了一種定位顆粒的手段，即通過從樣品中吸收水使顆粒固定。 US6, 004, 821還公開了使用傾斜室，它能將顆粒按其大小進行表觀分類。在本發明中，通過 提供具有適當表面能的觀察室來分離和固定顆粒和沉渣，如下面所詳述的。發明概述本發明提供一種執行尿顆粒和沉渣的目視分析裝置。一方面，本發明涉及一種目視檢 查尿樣的所述顆粒和沉渣的方法。將尿樣引入到包含用於從移液管接受所述樣品的入口的 載玻片中。尿液流入封閉的入口室中，然後通過毛細管通道流入封閉的觀察室中。通過相 對於樣品適當選擇觀察室壁的表面能，在所述壁上分離和固定固體物質。然後可通過適當 手段例如顯微鏡或自動化儀器在觀察室中目視檢查所述樣品。另一方面，本發明涉及一種適合目視檢查尿樣的顆粒(例如紅血球)或沉渣(如 尿管型和草酸鈣晶體)的載玻片。該載玻片包括三個層，即光學透明的基體層，包含至少一 個入口室和觀察室的中間層，其中所述兩室通過毛細管通道相連，以及包含用於引入尿樣 的入口開口和用於從觀察室中釋放空氣的排氣口的光學透明頂層。相對於樣品的表面能所 述光學透明層具有高表面能，使得為便於檢查僅藉助於表面能分離和固定顆粒和沉渣。一 般而言，所述光學透明層應當是高度親水性的。當表面相對於樣品主體液體的表面能大於 顆粒和沉渣相對於該表面的表面能減去顆粒和沉渣相對於主體液體的表面能時，顆粒和沉 渣將會附著在所述光學透明層上。此關係的數學表達式在下文中給出。附圖簡要說明


圖1是本發明載玻片的頂層的俯視圖。圖2是本發明載玻片的中間層的俯視圖。圖3是本發明的三層載玻片的剖視圖。優選實施方案說明
總的來說，本發明提供一種使用載玻片進行尿分析的裝置，其中尿樣通過移液管引入， 然後通過毛細管通道流入一個區域，在該區域可對樣品進行光學檢查以確定顆粒和沉渣 (如上述的那些)的存在。圖1-3顯示了一個優選實施方案。該載玻片結合了三個層(圖3中的10、20和30) 並可以容納25個獨立樣品。基體層30為相對於樣品具有高表面能的光學透明的材料，如 醋酸纖維素，頂層10為另一片相對於樣品具有高表面能的光學透明的材料(例如醋酸纖維 素)，其經過切割以提供用於在引入液體時除去空氣的排氣縫14和用於通過移液管引入樣 品的開口 12。中間層20是一片聚對苯二甲酸乙二醇酯，其經過切割以提供入口室22和觀 察室觀，所述兩室通過毛細管通道M相連。所述中間層在兩側都具有丙烯酸塗層膠帶(例 如3M9494)以將中間層粘合到頂層和底層。圖1顯示了如載玻片使用者所看到的頂層10。使用者將從移液管向入口 12中分 配被測數量的尿，空氣將通過排氣縫14排出。圖2顯示了中間層20及其構成兩個室和互 連毛細管通道的切口。液體將流入入口室22，然後通過毛細管M流入觀察室觀以供檢查。 第三層30(參見圖幻為基體層，其是光學透明的，使得可以從觀察室的上面和下面，即透過 所述透明頂層或所述透明基體層，進行檢查。儘管所示載玻片包含25組形成用於容納和觀察25個樣品的位置的切口，但應當 清楚本發明並不局限於任何具體的測試位置組數。根據用於觀察樣品的設備的能力，其可 為從1到任何適當的數字。在圖1-3所示的載玻片中，長為5英寸(127mm)，寬為3. 8英寸(96. 5mm)，頂層和基 體層的厚度為0. 005英寸(0. 127mm)，而中間層包括一對膠帶在內為0.014英寸(0. 356mm)
厚。請注意，由於所述三個層十分薄，所以在圖3中各層的厚度比實際尺寸要大得多。樣品量將由入口室、毛細管和觀察室的總合容積確定。樣品量的選擇並不重要，因為觀察室 的容積是已知的，因此固體物質的量會與實際樣品的量有關。一般，樣品量將由期望的顆 粒數決定，可以為約0. 1到200 μ L。在此實施例中，入口通常為直徑大約2mm的圓，排氣 口為1.5X 15. 8mm的狹縫，入口室的容積為1. 53 μ L，觀察室的容積為約90 μ L。觀察室寬 14. 53mm，長17. 78mm，高0. 35mm。如果需要也可採用其它尺寸。例如，觀察室可以是細長的， 從而樣品被鋪展在狹長的區域上。這可以實現更好的顆粒分離和簡化觀察裝置(例如用於 記錄分離的沉渣的出現的攝像機)的運動。由此，對於90yL的樣品，觀察室可以為約80mm 長，3. 2mm寬，而非附圖中顯示的大致正方形的觀察區。通常，觀察室的深度是特別重要的， 因為將目視檢查樣品，而鋪展樣品能使限制可見性的顆粒和沉渣分層最小化。在其它實施 方案中，中間層的厚度可以與頂層和底層的厚度相等或相似，從而觀察室的容積為約45 μ L 而非90 μ L。通過淺的觀察室來促進顆粒和沉渣在頂層和底層表面上的分離。在某些實施 方案中，將添加染料以幫助區別不同類型的沉渣，例如透明管型和蠟樣管型。同樣重要的是用於將尿樣從入口室向觀察室傳輸的毛細管通道的尺寸。如 US7, 094，354中所述，毛細管的尺寸不能太小以至於阻滯顆粒進入觀察室或限制液體傳輸。 因此，最小的毛細管尺寸應當不小於約100 μ m。優選地，最小尺寸應為約130 μ m。此外，還 應限制毛細管的長度以避免顆粒在毛細管中分離。在附圖所示的設計中，毛細管是高度等 於中間層20的寬度即0. 35mm (350 μ m)，寬度等於200 μ m的縫。毛細管的側壁是中間層20 的聚對苯二甲酸乙二醇酯，上下壁是層10和30的醋酸纖維素。儘管在分配尿樣時移液管 會施加一些壓力，但毛細管應當提供足以快速輸送尿樣的毛細管力。因此毛細管壁將本質 上是親水性的。還發現用於頂層和基體層的優選的醋酸纖維素出乎意料地能有效地在觀察室 中分離尿。在用附圖所示類型的載玻片所進行的測試中，所用醋酸纖維素是從Grafix Plastics, Cleveland, Ohio獲得的高性能OC-VLB級薄膜。如前所述，紅血球或其它顆粒 和沉渣被吸引到醋酸纖維素觀察室的壁上，其被認為具有適於分離和固定紅血球及其它顆 粒和沉渣以便進行檢查的表面能。如果選擇其它光學透明材料，則可能需要通過本領域技 術人員所熟知的技術，如添加適合的塗層，來調節它們的表面能。據發現，尿中的顆粒和沉渣具有相似的表面能，當附著能與尿和沉渣的相匹配或 比之稍低時附著在透明的觀察表面上。這可以用以下公式表示
附著自由能=Y沉渣-表面一 Y沉渣-液體一 Y表面-液體。當該自由能為至少零或更低時發生附著。在以下情形 Y表面-液體(Y沉渣-表面一 Y沉渣-液體，
其中
Y表面-液體=所述表面的表面能與主體液體的表面能之差； Y沉渣-表面=沉渣及其它顆粒的表面能與所述表面的表面能之差； Y沉渣-液體=沉渣及其它顆粒的表面能與主體液體的表面能之差。無論是表面與液體、表面與沉渣、還是液體與沉渣，兩相之間的差異取決於各個相 的表面能(爾格/cm)。測得的尿的表面能一般為55-58爾格/cm，最大範圍為50-65爾格 /cm。據發現，所述尿中的尿沉渣的表面能一般等於尿，因此附著主要取決於Y表面-液體， 且當所述表面的表面能大於或等於尿時是有利的。
因此，據發現當觀察表面的表面能(爾格/cm)大於50達因/cm時，由細胞、管型、 晶體及其它顆粒組成的尿沉渣牢牢附著在該觀察表面上，如以下對比表中所示
(1)表面能由以水作為參照使用測角計測量的液體接觸角確定。當在高倍放大率(例如> IOOx)下觀察沉渣及其它顆粒時，它們受布朗運動影響 且只有牢固附著時才可對其進行適當的檢查。顯微鏡的分辯率應至少為1 μ m，優選地能夠 辨別0. 1 μ m大小的顆粒。隨著所述光學層的表面能的增大和所述光學層之間距離的減小， 沉渣在附著後變得靜止。令人驚訝的是，隨著所述層的表面能的增大，細胞在附著時更不容 易改變其自然形狀。紅血球在強附著條件下尤其不容易將細胞狀改變到圓鋸齒狀。優選沉 渣儘可能處於其自然形狀以便正確分類。觀察區的大小取決於所用的觀察裝置，還取決於待檢查的顆粒和沉渣的濃度和大 小。觀察裝置如顯微鏡一般使用高倍視域(HPF)來檢查沉渣。400X的放大率能顯示所述室 上 330微米X330微米大小的區域。當頂光學層與中間光學層之間的距離為100微米的 毛細管間隙時，觀察的尿體積為0. 011 μ L。尿沉渣的臨床解釋所認為的陽性結果是指一般 包含3-5000個沉渣對象的HRP。用分離的圖象測量多個HRP，以提供充分的取樣。HRP數通 常為俘獲10-100個圖象以使0. 1-10 μ L的樣品量被測量。可通過自動化掃描階段來測量 多個圖象，其使得能夠覆蓋分布在觀察區不同位置的許多HPF。觀察的尺寸和形狀必須充分 自由以包含待測圖象的數量。圖象以易於被觀察裝置測量的模式以最小的重疊和範圍誤差 排列。實施例顯示了特別有用的樣品尺寸。所述多個圖象可以小於樣品尺寸。應當注意， 儘管所示淺室深的觀察室基本為正方形或長方形，但其它尺寸和形狀也是可以的。通常，樣 品觀察室為正方形、橢圓形、圓形或長方形，俘獲的圖象為正方形或矩形圖像，但不排除其 它形狀。上述的本發明的載玻片適用於適合接受和檢查這種載玻片的自動化儀器。這種儀 器通常能夠定位載玻片和將光學系統聚焦在各個觀察室上。本發明的載玻片還可以使用具 有適合放大倍數的顯微鏡手動地檢查。用於光學層的材料可包括親水性的玻璃和塑料。這些材料便宜、光學透明、平坦且 不彎曲，極為適合底層。據發現，如果提供足夠的時間來達到靜態平衡，細胞和尿沉渣會在 任何離心力下主要附著到底層。優選達到靜態平衡的時間儘可能短(<3分鐘)以使系統能 夠快速完成分析。當層的表面能增大或層間的毛細管間隙減小時，所有尿沉渣附著到底層 上的時間(到達靜態平衡的時間)縮短，如以下對比表中所示
權利要求
1.用於目視檢查尿樣顆粒和沉渣的樣品載玻片，包括(a)光學透明材料的基體層；(b)包含至少一組構成測試位置的切口的中間層，所述切口形成至少一個用於接收尿 樣的入口室、至少一個觀察室和至少一個在所述入口室與所述觀察室之間流體連通的親水 性的毛細管通道；(c)光學透明材料的頂層，所述頂層包含構成用於向所述入口室中引入所述尿樣和用 於從所述觀察室中排出空氣的開口的切口 ；其中(a)和(c)的所述光學透明材料具有相對於所述尿樣的表面能使得在所述光學透 明材料表面上分離和固定所述顆粒和沉渣的表面能。
2.權利要求1的樣品載玻片，其中所述光學透明材料具有至少50達因/cm的表面能。
3.權利要求2的樣品載玻片，其中(a)和(c)的所述光學透明材料為醋酸纖維素。
4.權利要求1的樣品載玻片，其中所述中間層由聚對苯二甲酸乙二醇酯製成。
5.權利要求1的樣品載玻片，其中所述中間層(b)通過雙面膠帶粘合和密封到所述頂 層(a)和所述底層(c)上。
6.權利要求1的樣品載玻片，包含25組構成一組測試位置的切口。
7.權利要求1的樣品載玻片，其中所述樣品為約2-200μL。
8.權利要求1的樣品載玻片，其中所述中間層的厚度為約0.100-0. 35mm，所述頂層的 厚度使得能提供至少0. 9mm的工作距離。
9.權利要求1的樣品載玻片，其中所述毛細管通道尺寸不小於ΙΟΟμπι。
10.權利要求1的樣品載玻片，其中所述觀察室的容積為約0.1-200 μ L0
11.目視檢查尿樣顆粒和沉渣的方法，包括(a)獲得尿樣；(b)將所述(a)的樣品引入樣品載玻片中；和(c)檢查所述樣品載玻片中的所述(a)的樣品；其中所述樣品載玻片包括相對於所述尿樣的表面能具有高表面能的光學透明材料的 基體層；包含至少一組構成測試位置的切口的中間層，所述切口構成至少一個用於接收所 述尿樣的入口室、至少一個觀察室和至少一個在所述入口室與所述觀察室之間流體連通的 親水性的毛細管通道；和所述光學透明材料的頂層；所述頂層包含構成用於向所述入口室 中弓丨入所述尿樣和用於從所述觀察室中排出空氣的開口的切口。
12.權利要求11的方法，其中所述光學透明材料具有約38-50達因/cm的表面能。
13.權利要求11的方法，其中所述光學透明材料為醋酸纖維素。
14.權利要求11的方法，其中所述中間層由聚對苯二甲酸乙二醇酯製成。
15.權利要求11的方法，其中所述中間層通過雙面膠帶粘合和密封到所述頂層和所 述基體層上。
16.權利要求11的方法，其中所述載玻片包含25組切口。
17.權利要求11的方法，其中所述顆粒和沉渣被固定在所述光學透明的頂層和底層 的表面上。
全文摘要
藉助於由三個層構成的包含封閉的觀察室的載玻片進行了尿樣的目視分析，其中所述觀察室接收由移液管移入載玻片外層上的開口中的尿樣。樣品從所述入口開口進入中間層中的入口室並穿過毛細管通道進入觀察室，在觀察室中進行顆粒和沉渣檢查。
文檔編號C02F1/44GK102131737SQ200980132188
公開日2011年7月20日 申請日期2009年8月18日 優先權日2008年8月21日
發明者H·盧, M·J·普吉亞 申請人:西門子醫療保健診斷公司