一種防治豔山姜葉病害的化學藥劑篩選方法與流程

2023-07-30 08:11:41 2

技術領域

本發明涉及微生物菌株及用於中藥材鑑定技術領域，具體涉及一種防治豔山姜葉病害的化學藥劑篩選方法。

背景技術：

豔山姜為姜科山姜屬植物，其乾燥果實豔山姜，又稱土砂仁，大草蔻，具有溫中燥溼，行氣止痛，截瘧，驅風，健胃，化瘀的功效，作為貴州民族藥被廣泛用於治療心腹冷痛，胸腹脹滿，消化不良，嘔吐腹瀉等症狀，收錄於《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》（2003版）。現代研究表明，豔山姜藥用有效成分為其揮髮油，具有廣泛的抗炎、鎮痛及防治心血管系統疾病等多方面的生物活性。

豔山姜喜高溫多溼環境，不耐寒，一般只能耐22-28℃左右的溫度，不得低於5℃，怕霜雪，喜陽光又耐陰，宜在肥沃而保溼性好的土壤中生長自然分布於海拔400-650 m，我國中高海拔西南地區亦有分布。豔山姜具有溫中燥溼，行氣止痛，截瘧，驅風，健胃，化瘀的功效，作為貴州民族藥被廣泛用於治療心腹冷痛，胸腹脹滿，消化不良，嘔吐腹瀉等症狀，收錄於《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》。現代研究表明，豔山姜藥用有效成分為其揮髮油，具有廣泛的抗炎、鎮痛及防治心血管系統疾病等多方面的生物活性。豔山姜不同部位所含揮髮油含量不一，種子團含揮髮油較多，果皮最少，不同揮髮油成分具有相應藥理作用，其研究尚未完善，藥理作用的研究對豔山姜的合理開發應用具有重要意義[4]豔山姜是極具藥用價值，食用價值，觀賞價值和經濟價值的一種植物，產量可達每畝1000公斤以上。近年來市場需求量不斷增加，價格節節上升。

筆者在貴州省興義市貞豐縣連環鄉對豔山姜病害調查研究發現，一種真菌病害主要危害豔山姜的莖葉和果實，葉片染病出呈現圓形或橢圓形褐色，中間為灰白色或暗白色，有些甚至穿孔，病健交界極為明顯，後期病斑出現輪狀黑色小顆粒，染病豔山姜果實由青轉黃並逐漸枯萎掉落，影響了豔山姜果實的產量。查閱資料，並無相關豔山姜病害的報導,本次是首次對豔山姜葉部病害的報導。

技術實現要素：

本發明人2015-2016年在貴州省興義市貞豐縣連環鄉豔山姜種植基地發現豔山姜出現一種疑似豔山姜炭疽病的病害，這種病害導致豔山姜果實產量下降。病情嚴重的葉片可形成大面積病斑，後期病斑穿孔，葉片枯萎掉落，最終幹萎掉落。通過對豔山姜病株進行篩選，挑選出典型病株，培養病害組織，提取病原菌，然後用健康豔山姜葉片組織進行回接試驗，對病菌分離純化鑑定，判斷病原菌為擬盤多毛孢屬真菌，該菌首次在豔山姜病害中報導。

本發明的發明目的在於:尋找出導致豔山姜出現病害的病因，並尋找到一株豔山姜致病菌株。名稱為擬盤多毛孢屬真菌，菌落氈狀，白色，邊緣規整，後期正面有黑色點分生孢子團，反面從中心向外緣零星變黑。分生孢子由5個細胞組成，成紡錘狀、直狀或稍微彎曲， 21.5.0-26.5× 6.0-7.5 μm，5個細胞由3個有色細胞和兩個無色細胞組成，4個隔膜均為真隔膜，中間為3個褐色細胞，13.0-16.0 μm,兩端為兩個無色細胞， 頂部無色胞為三角錐形，著生1根無色附著絲，底部無色孢為三角錐形，著生3-4根無色附著絲。

本發明另一個目的在於公開了一種用於豔山姜葉病害的鑑定方法。

本發明的第三個目的是提供了該菌株擬盤多毛孢屬真菌作為對照品，在用於鑑定豔山姜葉病害方面的應用。

本發明的技術方案概述如下:

發明所提供的豔山姜致病菌株，其特徵在於該菌株的名稱為擬盤多毛孢屬真菌Neopestalotiopsis zerumbet,已保藏於「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏號CGMCC 12776。在2016年7月14日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（China General Microbiological Cultuer Collection Centre）進行保藏，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101。

（1）該菌株已從豔山姜葉部病斑處中分離純化得到，經基因測序，屬於Neopestalotiopsis zerumbet。該菌菌落氈狀，白色，邊緣規整，後期正面有黑色點分生孢子團，反面從中心向外緣零星變黑。分生孢子由5個細胞組成，成紡錘狀、直狀或稍微彎曲， 21.5.0-26.5× 6.0-7.5 μm，5個細胞由3個有色細胞和兩個無色細胞組成，4個隔膜均為真隔膜，中間為3個褐色細胞，13.0-16.0 μm,兩端為兩個無色細胞， 頂部無色胞為三角錐形，著生1根無色附著絲，底部無色孢為三角錐形，著生3-4根無色附著絲。菌落形態如圖1(h,i)。

本發明進一步公開了一種防治豔山姜葉病害的化學藥劑篩選方法，其特徵在於按如下的步驟進行:

(1)病株採集:在貴州省興義市連環鄉豔山姜種植基地採集典型病株，並描述病株形態（菌落氈狀，白色，邊緣規整，後期正面有黑色點分生孢子團，反面從中心向外緣零星變黑。分生孢子由5個細胞組成，成紡錘狀、直狀或稍微彎曲， 21.5.0-26.5× 6.0-7.5 μm，5個細胞由3個有色細胞和兩個無色細胞組成，4個隔膜均為真隔膜，中間為3個褐色細胞，13.0-16.0 μm,兩端為兩個無色細胞， 頂部無色胞為三角錐形，著生1根無色附著絲，底部無色孢為三角錐形，著生3-4根無色附著絲）。

(2) 病原菌分離純化:將病變部位接種到培養基中，通過多次接種分離得到病原菌菌株;

(3)病原菌回接實驗:選取健康的豔山姜葉片組織，將分離菌株接種到健康豔山姜葉片組織上，放入培養皿中保溼培養，所用的培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA），之後將接種葉片與採集的病害葉片病症進行對比，篩選出致病菌，形態學鑑定:將篩選出的病原菌進行培養，待菌落產孢，挑取菌落邊緣菌絲，於顯微鏡下觀察病原菌形態特徵；

(5) DNA提取:根據DNA提取試劑盒的步驟提取病原菌DNA，設立兩組實驗a和b;其中a指的是BIOMIGA Fungus Genomic DNA Extraction Kit (GD2416)試劑盒提取；b指的是CTAB法；

(6) PCR擴增:將提取的DNA進行PCR擴增，用凝膠成像系統顯色，之後將DNA測序;測序結果見SEQ ID No.1.

(7) 測DNA序列:測序之後，構建系統發育樹，判斷病原菌種屬為擬盤多毛孢屬真菌。

附圖說明：

圖1為菌落形態圖；

其中a :田間病葉症狀；b,c：回接結果；d-g:病原菌分生孢子形態；h,i：病原菌菌落形態；

圖2為基於ITS基因的Mp系統發育樹；

圖3為藥效結果，其中A為70%甲基託布津系列溶度抑制效果 B為25%咪鮮胺系列溶度抑菌效果。

具體實施方式：

下面結合實施例說明本發明，這裡所述實施例的方案，不限制本發明，本領域的專業人員按照本發明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發明的範圍內，本發明的範圍和實質由權利要求來限定；其中所用試劑均有市售；

本發明所用到的菌株來源：

實施例1

1.情況介紹

近年來引入種植的豔山姜逐漸開始出現病害並逐漸加重，其中真菌病害是導致豔山姜果實產量下降，品質降低的主要因素之一。2015-2016年筆者在貴州省興義市貞豐縣連環鄉對豔山姜病害調查研究發現，一種真菌病害主要危害豔山姜的莖葉和果實，葉片染病出呈現圓形或橢圓形褐色，中間為灰白色或暗白色，有些甚至穿孔，病健交界極為明顯，後期病斑出現輪狀黑色小顆粒，染病豔山姜果實由青轉黃並逐漸枯萎掉落。採集當地豔山姜病株進行病菌分離純化，形態和症狀描述，並進行豔山姜葉片組織回接試驗，對比回接病斑與標本病斑一致，確定病原為擬盤多毛孢屬真菌。然後通過進行室內化學藥劑篩選，以期篩選出能夠有效抑制豔山姜病害的殺菌劑，有效控制豔山姜病害，從而減少作物損失，保障農民收入。室內藥劑篩選試驗結果表明：25%咪鮮胺乳油和70%甲基託布津可溼性粉劑的抑制效果最好，EC50分別為0.1503μg/ml，0.8723μg/ml,250g/L嘧菌酯次之。故25%咪鮮胺乳油可作為防治豔山姜擬盤多毛孢葉斑病的最佳化學藥劑。

2.材料與方法

2.1材料

2.1.1病原菌鑑定

供試培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：39g PDA，5g瓊脂粉配製成1L，(PDA上海博微生物科技有限公司生產，瓊脂粉為北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）

供試儀器：主要儀器有Nikon光學顯微鏡，Nikon圖像分析系統，BIO-BRI PCR熱循環儀，BIO-RAD 凝膠成像系統，Biometra高速冷凍離心機

供試試劑： PCR Master Mix, PBS緩衝液，引物為ITS1，ITS4

2.1.2藥效實驗

表1 供試化學藥劑

2.2方法

2.2.1病原菌分離純化

筆者於2015-2016年在貴州省興義市貞豐縣連環鄉豔山姜種植基地對病害進行調查，同時進行症狀描述，並採集典型病株，備用。

將採集的豔山姜病害處衝洗乾淨、晾乾，在病健交界處剪取3-5mm×3-5mm山姜病害處的組織塊，先用75%酒精消毒20s左右，然後用無菌水漂洗2-3次後用滅菌濾紙吸乾，置於馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)中，每個培養皿接種2-4塊，置於27℃下培養2-3天。待菌落生長過後，從第一次接種生長的菌落中挑選幾株生長較好，雜菌汙染小的菌落，從該菌落邊緣挑取菌絲，置於平板PDA培養基中進行純化培養，每個位置接種兩塊平板作為對照，27℃下培養3-4天，獲得分離菌株，菌落形態觀察，並製作玻片在顯微鏡下進行分生孢子形態觀察。

2.2.2柯赫氏法則

運用柯赫氏法則進行驗證。挑選健康的豔山姜葉片進行回接實驗，截取健康的葉片組織清洗乾淨，晾乾，用75%乙醇對葉片組織消毒，用無菌處理的針刺葉片，並將分離的生長的菌塊菌絲面貼在葉片針刺處，放在無菌處理的吸水紙上，放入培養皿中，加入無菌水保溼27℃下培養6-7天，每片葉片組織接種4個位置，同時設置對照培養皿，隨時注意觀察發病情況。之後對比接種葉片組織病症與採集的經典病株對比，挑選出回接試驗病症與病株一致的菌落，並將該菌落接種10個培養皿作為藥效實驗用菌。

2.2.3形態學鑑定

挑取分離純化的單株菌落菌絲接種到PDA培養基中，培養3-4天，觀察菌落性狀，挑取菌絲製做玻片觀察分生孢子的形態特徵，包括菌絲顏色，分生孢子的形態，利用目鏡測微尺測定孢子大小，用顯微鏡成像系統拍照。

2.2.4分子系統學鑑定（DNA提取，PCR擴增，系統發育樹構建）

DNA提取：運用改良的Gene TLETM提取方法：將待測菌株置於PDA培養基中28℃振蕩培養3-5天,取1ml培養液，用無菌去離子水洗滌後，收集菌絲體；加入SolutionⅠ540μL，振蕩混勻後放置10min，加入SolutionⅡ60μL,在95℃金屬浴中加熱10min，再加入SolutionⅢ300μL,置於冰上兩分鐘；12000r/min、4℃離心5min,上清液移至新管，加入異丙醇600μL，12000r/min、4℃離心震蕩5min，棄去上清液，加入體積分數70%冷乙醇200μL洗滌沉澱，12000r/min、4℃離心5min，沉澱為DNA，用離心濃縮乾燥儀乾燥DNA；將DNA溶於50μL無菌去離子水，-20℃保存備用。

PCR擴增用BIO-BRI PCR熱循環儀對DNA擴增，用BIO-RAD 凝膠成像系統顯色，按《分子克隆試實驗指南》相關步驟操作，進行菌落PCR鑑定，測序，測序結果如下：

系統發育樹構建。 將測得的序列與用Blastn軟體從GenBank搜索到的相關序列，CLUSTALW軟體對位排列後再手工校正。系統發育分析採用PAUP4.0版beta10中的簡約法進行最大簡約性分析，對於由序列長度多態性所造成的空位，在運算處理中為缺失狀態。利用bootstrap(1000次重複)檢驗各分支的置信度。

2.2.5藥效實驗

藥劑對菌絲的抑制效果測定，採用含藥平板法：

第1步：將上述7種藥劑分別配製成含有有效成分1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg/ml 6種質量濃度(1)80%多菌靈：取1.250 g多菌靈（80%）稀釋10000倍配製成100 μg/ml濃液，依次取0.125 ml、0.250 ml、0.50 ml、1.000 ml、2.000 ml、4.000 ml配製成10 ml濃液即得；同f法（2）75%百菌清：取1.333 g百菌清（75%)稀釋10000倍配製成100 μg/ml濃液；70%甲基託布津取1.42857 g稀釋10000倍配製成100 μg/ml濃液；80%代森錳鋅取1.250g稀釋10000倍配製成100 μg/ml濃液；57.6%冠菌清取1.736g稀釋10000倍配製成100 μg/ml濃液；250 g/L嘧菌酯：取40 μl配製成100 ml則濃度為100 μg/ml；25%咪鮮胺：取0.040 g配製成100 ml即的100 μg/ml濃液。同上法依次配製成系列濃度。

第2步：在無菌操作臺中，用滅菌過液槍槍頭和10 ml量筒，在培養皿中加入1 ml配好的藥劑，外加已滅菌並降溫的PDA培養基9 ml，混勻，配成共10 ml的培養基，以加入1 ml無菌水和9 ml滅菌PDA培養基的平板作為空白對照。

第3步：待培養皿混勻冷凝後，在分離純化培養好的病原菌菌落沿邊緣用滅菌過的0.5 cm打孔器取直徑0.5c m的菌塊，接種到含有藥劑和對照組分的培養皿中央，每個培養皿放一塊菌塊，並且每種藥劑的各個濃度設立3個重複試驗。將接種好的培養皿放在27℃恆溫培養箱中培養5d後採用十字交叉發測量生長菌落直徑，並計算抑制率[10]。

抑制率=(對照菌落直徑—處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

測得的數據以濃度取自然對數e的對數為橫坐標(X)，以抑制率對應的機率值作為縱坐標（Y)，應用統計學方法，擬合出試驗濃度對數-抑制率百分率機率值的回歸方程和相關係數R等相關數據。並且以抑制率為50%時對應的機率值代入毒力方程求出X，再轉化成抑菌中濃度EC50的值，EC50越小，說明該藥劑對菌絲的抑制作用越好，最後用EC50值來衡量化學藥劑對病原菌菌絲毒力的大小。

3結果

3. 1病原菌分離純化及病斑描述

第一次接種，從病株上截取的病健交界處3-5mm×3-5mm大小病害組織接種到PDA培養基中，菌落長出絮狀菌絲，呈白色絨毛狀，在後期生長中出現黑色分生孢子盤，生長迅速，長滿整個培養皿。有些培養皿中菌落出現綠色，黑色和淡黃色菌落（如圖1）。第2次接種的菌落雜菌肉眼幾乎無法看到，生長初期菌落為純白色絨毛狀，出現黑色小顆粒，背面為橘黃色（如圖2），共獲得純菌株6株。

病斑描述：病斑橢圓形到不規則形，生於植株葉片上表面，初期斑點小，圓，為淺紅色，後期病斑擴大，病斑中央葉肉減少，顯示出明顯的葉脈，中央變白，邊緣仍保留淺紅色。

3. 2致病性測定

挑取典型純化後的菌株，針刺接種到健康的豔山姜葉片組織6-7d後，接種部位出現輪狀病斑，並出現黑色孢子盤，與病株上的病斑一致（如圖3)。將回接的菌落挑取上次接種位置的菌絲重新接種到新的培養基中，共10個組分，生長出來的菌落正面為白色絨毛狀，有大量黑色分生孢子盤，反面呈橘黃色。

3. 3形態學鑑定

在顯微鏡下觀察分生孢子盤和形態，觀察發現，分生孢子由5個細胞組成，成紡錘狀、直狀或稍微彎曲，18.0-24.0× 5.0-8.0 μm，5個細胞由3個有色細胞和兩個無色細胞組成，4個隔膜均為真隔膜，中間為3個褐色細胞，14.0-20.0 μm兩端為兩個無色細胞，16.0-22.0 μm 頂部無色胞為三角錐形，著生一根無色附著絲，底部無色孢為三角錐形，著生2-4根無色附著絲。

3. 4分子系統學鑑定

系統發育樹構建 根據系統發育結果顯示本實驗菌株GZMU001與Pestalotiopsis trachicarpicola聚為一支，支持率為87%，結合形態學數據我們初步將GZMU001鑑定為Pestalotiopsis trachicarpicola。

3. 5藥效實驗

將病原菌接種在含有各系列濃度的化學藥劑及對照組實驗的培養皿中，在27℃的條件下培養5天，統計菌落生長情況由表2可知，在本次提供實驗的7種化學藥劑及其一系列濃度範圍內，不同的供試藥劑對病原菌絲生長的抑制作用存在明顯差異，在0.125-4.000μg/ml的濃度範圍內，7種藥劑中，80%多菌靈對病原菌的生長無明顯抑制效果，其他6種化學藥劑對病原菌生長的抑制作用存在相似的規律，即隨著濃度的增大，對病原菌的抑制作用越強，菌落生長直徑越小（表2）。在本次實驗中，在最高質量濃度4.000 μg/ml下，抑制率達到65%以上的藥劑有2種，即70%甲基託布津可溼性粉末和25%咪鮮胺乳油抑制率分別達到了78.73%和91.01%，培養15d後抑制生長效果。250 g/L嘧菌酯對病原菌的抑制有一定效果，但在本實驗的系列濃度中抑菌效果不佳，其6個濃度的抑制率為21.36%，24.24%，26.03%，28.73%，32.50%，34.11%，抑制率相對甲基託布津和咪鮮胺較低。而75%百菌清，80%代森錳鋅和57.6%冠菌清對病原菌的抑制效果不明顯。

將70%甲基託布津和25%咪鮮胺組分培養皿測得的菌落直徑，以化學藥劑有效含量（μ g/ml）以e為底的對數值（X）為橫坐標，以抑制率對應的機率值（Y）為縱坐標，用PBT軟體處理數據，求出相應的回歸曲線方程，及在抑制率為50%時的濃度（EC50）如表3。25%咪鮮胺的EC50為0.1503 μg/ml,70%甲基託布津的EC50為

0.8723 μg/ml 。在本次藥劑篩選試驗中，25%咪鮮胺其EC50值最低，其次是70%甲基託布津，故25%咪鮮胺的抑菌效果最好。

表2 1：80%多菌靈 2：75%百菌清 3：70%甲基託布津 4：80%代森錳鋅

5：57.6%冠菌清6：250g/L嘧菌酯 7：25%咪鮮胺 對照：無菌水

表3 化學藥劑毒力回歸曲線

試驗方法：生長速率法 試驗日期2016-04-12 統計方法： 機率值法

4討論

目前，關於豔山姜的研究還處在發展階段，尤其是豔山姜病害的研究在國內還是很少。本次試驗對導致豔山姜出現病害的病原菌分離純化，回接試驗，再對病原菌進行形態學和分子系統學鑑定，最終確定病原菌為擬盤多毛孢菌，之後進行化學藥劑對病原菌毒力篩選試驗，以期能找到有效防治豔山姜擬盤多毛孢葉斑病的化學藥劑。

病原菌鑑定結果，豔山姜致病菌為擬盤多毛孢屬真菌Pestalotiopsis trachicarpicola。

室內藥劑篩選試驗結果表明，7種供試化學試劑對病原菌生長的抑制作用存在較大差異，25%咪鮮胺乳油和70%甲基託布津可溼性粉劑的抑制效果最好，EC50分別為0.1503μg/ml，0.8723μg/ml,250g/L嘧菌酯次之，其他4種藥劑在本次試驗濃度下幾乎沒有抑制效果。故25%咪鮮胺乳油可作為防治豔山姜擬盤多毛孢葉斑病的最佳化學藥劑。

觀察發現豔山姜病害出現原因還與種植密度有關，豔山姜種植基地種植密度較大，而且對死亡，病株和往年種植的豔山姜植株沒有及時正確清理，害蟲的啃咬也增加了豔山姜交叉感染的機率。

本次化學藥劑篩選所用試劑在市場上均有銷售，屬於常用抗病藥劑，成本較低，適於病害防治用藥。但使用化學藥劑對豔山姜會造成汙染，對中藥材的品質造成影響，在使用時應注意這不容忽視的問題。故在日常管理中，對豔山姜種植應該有更嚴格的規範要求，合理控制種植密度，及時清理病株，清理病害菌源，降低豔山姜交叉感染機率，防止病害大規模出現。

實施例2

一種防治豔山姜葉病害的化學藥劑篩選方法：

第1步：將70%甲基託布津或25%咪鮮胺分別配製成含有有效成分1.25 μg/ml質量濃度的10 ml濃液；

第2步：在無菌操作臺中，用滅菌過液槍槍頭和10 ml量筒，在培養皿中加入1 ml配好的第1步濃液，外加已滅菌並降溫的PDA培養基9 ml，混勻，配成共10 ml的培養基，以加入1 ml無菌水和9 ml滅菌PDA培養基的平板作為空白對照；所述的PDA培養基的組成為馬鈴薯200g,瓊脂20g,葡萄糖20g，配成1000ml；

第3步：待培養皿混勻冷凝後，在分離純化培養好的病原菌菌落沿邊緣用滅菌過的0.5 cm打孔器取直徑0.5c m的菌塊，接種到含有濃液和對照組分的培養皿中央，每個培養皿放一塊菌塊，將接種好的培養皿放在27℃恆溫培養箱中培養5d後採用十字交叉發測量生長菌落直徑，並計算抑制率；所述的濃液指的是不同藥劑配製成1.25μg/ml，2.50μg/ml，5.00μg/ml,10.00μg/ml,20.00μg/ml，40.00 μg/ml的濃液；

所述的對照組分的培養皿指的是以無菌水作為對照藥劑的培養皿；對照組分指的是：擬盤多毛孢屬真菌。

防治豔山姜葉病害的化學藥劑篩選方法，其中70%甲基託布津指的是：取1.42857 g稀釋10000倍配製成100 μg/ml濃液； 25%咪鮮胺指的是：取0.040 g配製成100 ml即的100 μg/ml濃液。配製成母液，通過稀釋將70%甲基託布津配製終濃度為含有有效成分1.25μg/ml質量濃度的10 ml濃液，將25%咪鮮胺配製終濃度為含有有效成分1.25μg/ml質量濃度的10 ml濃液。

SEQUENCE LISTING

貴州醫科大學

一種防治豔山姜葉病害的化學藥劑篩選方法

1

PatentIn version 3.5

1

440

DNA

人工序列

1

tcttcttata gctgctgccg gtggaccatt aaactcttgt tattttatgt aatctgagcg 60

tcttatttta ataagtcaaa actttcaaca acggatctct tggttctggc atcgatgaag 120

aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt 180

gaacgcacat tgcgcccatt agtattctag tgggcatgcc tgttcgagcg tcatttcaac 240

ccttaagcct agcttagtgt tgggaatcta cttcttttat tagttgtagt tcctgaaata 300

caacggcgga tttgtagtat cctctgagcg tagtaatgtt tttctcgctt ttgttaggtg 360

ctataactcc cagccgctaa acccccaatt ttttgtggtt gacctcggat caggtaggaa 420

tacccgctga acttaagcat 440