一種防治農作物細菌性病害的菌劑及其製備方法與應用的製作方法

2023-07-30 08:36:11

專利名稱：一種防治農作物細菌性病害的菌劑及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種防治農作物細菌性病害的菌劑及 其製備方法與應用。
背景技術：
近年來，我國農業迅速發展，隨著集約化種植程度的提高， 一些常見細菌 性病害變得更加流行和頑固起來，過去行之有效的辦法現在效果不佳，甚至以 往所謂的敏感藥物也治療無效。細菌性病害是由細菌病菌侵染所致的病害，如 水稻白葉枯病、軟腐病、潰瘍病、青枯病等，導致了農業生產的重大損失。特
別是水稻白葉枯病是水稻的三大病害之一，我國常年發生面積在1000萬畝以 上， 一般減產10% 20%，嚴重者減產達50%。由於引起農作物細菌性病害的 的病原菌種類多，寄主範圍廣，對環境的適應力強，存活方式多樣，所以防治 難度大。目前，相對於防治真菌性病害的農藥藥劑品種來說，防治農作物細菌 性病害的農藥種類還比較少，現有農藥品種如農用鏈黴素、葉青雙和無機銅製 劑(氫氧化銅、硫酸銅、氧氯化銅、氧化亞銅)等藥劑的防治效果一般也比較 差，抗性產生快，且汙染嚴重，帶來了嚴峻的"3R"問題，農產品安全性難以得 到保證。因此，細菌性病害己經成為農業可持續發展亟待解決的問題之一。
生物農藥是防治農作物細菌性病害的有效方法，通過操縱管理農作物根際 土壤微生態環境，消滅病原菌，形成穩定、平衡的根際土壤生態系統，經過多 年探索，已經發現了用於防治農作物病害的生物農藥，例如利用木黴菌來防治 惡苗病、細菌性谷枯病及細菌性立枯病；利用鏈黴菌產生的抗生素井岡黴素防 治小麥和水稻紋枯病；利用枯草芽孢桿菌防治水稻紋枯病、番茄葉黴病、大豆 根腐病、蘋果黴心病、棉花立枯病和棉花枯萎病等。但是目前生物農藥多用於 防治真菌性病害，而且只對病菌有抑菌作用，而無殺菌作用，因此無法使病害 消失。
具有寄生特性的蛭弧菌是一種近年來研究的用於消除環境病原菌的有效工 具，它以細菌為宿主，能夠裂解消除病原菌，且裂解譜廣泛，定植能力強，繁 殖快，利用它作為環境中的天然生物改良劑和"活性抗生素"，在防治農作物細菌性病害中具有廣闊的發展前景。到目前為止，已經開發出蛭弧菌應用於水產 養殖中病原菌消除的產品，但尚未見蛭弧菌用於防治農作物細菌性病害的有效 方法。

發明內容
為了克服現有技術中未有利用蛭弧菌有效防治農作物細菌性病害的不足之 處，本發明的首要目的在於提供一種高效、無毒無副作用的防治農作物細菌性 病害的菌劑。
本發明的另一目的在於提供上述菌劑的製備方法。 本發明的再一 目的在於提供上述菌劑的應用。
本發明的目的通過下述技術方案實現 一種防治農作物細菌性病害的菌劑， 包含蛭弧菌和寡糖。
所述防治農作物細菌性病害的菌劑，優選每升溶液中含106 1012pfii (plaque-forming units,噬菌斑形成單位)的蛭弧菌和10 30g寡糖；
所述蛭弧菌優選為在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期為2009年8 月7日、保藏編號為CCTCC NO: M 209169的蛭弧菌(S^fe〃ov^n'o sp.)BDSOl、 保藏日期為2009年8月7日、保藏編號為CCTCC NO:M 209170的蛭弧菌 G5Je〃oW6r/osp.)BDS02或保藏日期為2009年8月7日、保藏編號為CCTCC NO:M 209171的蛭弧菌(3^//ov沾n》sp.) BDSM08中的至少一株；
所述蛭弧菌更優選蛭弧菌(BcM/ovAn'osp.) BDS01與蛭弧菌(Btfe/Zov/^/o sp.) BDSM08以細菌數比1:1混合；
所述寡糖優選為殼寡糖、瓊膠寡糖、葡聚寡糖、褐藻膠寡糖或低聚麥芽糖
中的至少一種；
所述防治農作物細菌性病害的菌劑的製備方法，包括以下步驟將蛭弧菌 用DNB培養基、水、生理鹽水或0.2mol/LpH值為7.2 7.6的磷酸鹽緩衝液 調整濃度為1S l(^pfU/L後加入寡糖，寡糖的加入量為10 30g/L，混勻， 得到防治農作物細菌性病害的菌劑；
所述蛭弧菌優選為蛭弧菌BDS01、蛭弧菌BDS02或蛭弧菌BDSM08中的 至少一株；
所述蛭弧菌優選通過申請號"200710031166.X"，名稱為"高密度蛭弧菌遊 泳體的發酵培養技術"國家發明專利申請公開的高密度蛭弧菌遊泳體的發酵方 法進行培養；
5所述的蛭弧菌優選為由蛭弧菌BDS01與蛭弧菌BDSM08分別按照申請號 "200710031166.X",名稱為"高密度蛭弧菌遊泳體的發酵培養技術"國家發明 專利申請公開的高密度蛭弧菌遊泳體的發酵方法進行發酵培養，發酵液按細菌 數l:l混合而得；
所述寡糖為殼寡糖、瓊膠寡糖、葡聚寡糖、褐藻膠寡糖或低聚麥芽糖中的 至少一種；
所述防治農作物細菌性病害的菌劑的應用，是將所述防治農作物細菌性病 害的菌劑噴灑植株的莖、葉、穗、果實或灌根淋根；
所述防治農作物細菌性病害的菌劑中蛭弧菌的含量至少為103pfo/mL，優 選105 109pfo/mL;
所述防治農作物細菌性病害的菌劑噴灑植株的莖、葉、穗或果實，用量最 少為80mL / m2，優選用量為100 200mL / m2;
所述防治農作物細菌性病害的菌劑用於灌根淋根，用量最少為lOOmL /株， 優選用量為150 250mL /株；
所述防治農作物細菌性病害的菌劑用於防治十字花科蔬菜軟腐病、黑腐病、 根腐病，使用方法為灌根淋根或噴灑莖葉；
所述防治農作物細菌性病害的菌劑用於防治黃瓜和豆科植物細菌性角斑 病，使用方法為灌根淋根、噴灑莖、葉或果實；
所述防治農作物細菌性病害的菌劑用於防治茄科蔬菜青枯病、軟腐病、潰 瘍病，使用方法為灌根淋根、噴灑莖、葉或果實；
所述防治農作物細菌性病害的菌劑用於防治禾本科農作物細菌性條斑病、 白葉枯病，使用方法為噴灑莖、葉或穗。
本發明的原理蛭弧菌以細菌為宿主，能夠裂解消除病原菌，且裂解譜廣 泛，定植能力強，繁殖快。寡糖能夠與農作物植株信號轉導分子結合，是植物 獲得性抗病誘導劑，使植株獲得系統、長久、廣譜的抗性。本發明在使用蛭弧 菌消除病原菌的同時，添加能夠提高農作物獲得性抗性的寡糖，使防效更加穩 定持久，解決了過去採用抗菌素防治細菌性病害帶來的藥殘及抗性等問題。
本發明相對於現有技術，具有如下的優點及效果
l.本發明首次將蛭弧菌應用於農作物細菌性病害的防治，填補國內外蛭弧
菌研究開發的空白，增加了生物農藥的新種類。蛭弧菌具有裂解譜廣，生長迅 速的特點，對多種細菌病原菌具有優異的消滅能力。寡糖與之聯用後，增強農 作物抗性，藥效大幅提高，擴大了細菌性病害的防治譜，從而高效防治茄科、十字花科、豆科和單子葉農作物細菌性條斑病、角斑病、潰瘍病、軟腐病、白
葉枯病等病害。試驗表明，用於防治黃瓜角斑病，施藥10天後防效達到87.5%， 優於20%噻森銅防效(如圖3所示)。
2.本發明所製備的菌劑無毒，無汙染，對農作物病蟲害天敵安全，而且病 原菌基本不對其產生抗性。作為生物製劑，不產生藥害，克服了抗生素濫用帶 來"3R"問題，也避免了當前化學農藥汙染嚴重，破壞生態平衡，危害天敵的 弊端。本發明所製備的菌劑在裂解完宿主細菌後，蛭弧菌會因飢餓而自動消亡， 因此對人和動物無毒副作用，提高農產品品質和安全性，符合人民對食品健康 綠色的需求和農業生產可持續發展的要求。


圖1是實施例1製備的菌劑防治水稻白葉枯病效果圖。 圖2是實施例2製備的菌劑防治水稻條斑病效果圖。 圖3是實施例3製備的菌劑防治黃瓜角斑病效果圖。 圖4是實施例4製備的菌劑防治番茄潰瘍病效果圖。 圖5是實施例5製備的菌劑防大白菜軟腐病效果圖。 圖6是實施例6製備的菌劑防茄子青枯病效果圖。 圖7是實施例7製備的菌劑防大白菜黑腐病效果圖。 圖8是實施例8製備的菌劑防西葫蘆根腐病效果圖。
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式 不限於此。
實施例l 防治水稻白葉枯病 (1)蛭弧菌菌液的製備
蛭弧菌液的發酵方法採用申請號"200710031166.X",名稱為"高密度蛭弧 菌遊泳體的發酵培養技術"國家發明專利申請公開的高密度蛭弧菌遊泳體的發 酵方法進行分別在3個裝有100mL LB (Luria-Bertani)液體培養基的錐形 瓶中接種嗜水氣單胞菌(^eramom^ ^&op/^7fl，購於廣東省微生物所菌種保藏 中心，編號GIMU72) ， 200rpm、 28匸搖床培養18小時，培養液分別於4。C、 8000rpm離心10min，棄上清。分別將沉澱加入到3個裝有lOOraLDNB液體培 養基(營養肉湯0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物O.lg， NaC130g，溶
7於lOOOmL蒸餾水中，pH值為7.2 7.6)的錐形瓶中，再分別接入蛭弧菌BDS01 (從雙層平板上挑菌斑接入)、蛭弧菌BDS02 (從雙層平板上挑菌斑接入)和 蛭弧菌BDSM08 (從雙層平板上挑菌斑接入)恆溫搖床250 rpm、 28 。C培養36 h。培養液分別於《C 6000卬m離心20min，取上清液，再將上清液分別於4°C 16000rpm離心20min，保留沉澱，加入無菌的DNB重新懸浮蛭弧菌沉澱物， 製成濃度為109 pfii / mL的蛭弧菌液。
蛭弧菌BDS01自泥樣中分離得到，於2009年8月7日保藏於中國武漢市 武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M209169。對 其進行負染後於電子顯微鏡下形態觀察蛭弧菌BDS01呈單細胞，弧形，大小 為0.9x0.25pm，端生鞭毛，鞭毛長度為4Mm;將其以雙層平板法於28"C培養四 天可形成直徑l-2mm的透明圓形噬菌斑。
蛭弧菌BDS02自泥樣中分離得到，於2009年8月7日保藏於中國典型培 養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO: CCTCCM 209170。對其進行負染後 於電子顯微鏡下形態觀察蛭弧菌BDS02呈單細胞，弧形，大小為0.65x0.2pm， 端生鞭毛，鞭毛長度至少1.8tai;將其以雙層平板法於28'C培養四天可形成直 徑l-2mm的透明圓形噬菌斑。
蛭弧菌BDSM08由蛭弧菌BDS01進行紫外誘變得到，於2009年8月7曰 保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M209171。對其進行負染後於電子顯微鏡下形態觀察蛭弧菌BDSM08呈 單細胞，弧形，大小為1.8xl.0)im,端生鞭毛，鞭毛長度為3.2pm;將其以雙層 平板法於28'C培養三天可形成直徑2-3mm的透明圓形噬菌斑。
(2) 防治農作物細菌性病害的菌劑的製備
將蛭弧菌BDSOl、蛭弧菌BDS02和蛭弧菌BDSM08的菌液分別用水調節 至107pfb / mL，分別加入殼寡糖使之濃度為30g / L，用磁力攪拌器震蕩30s， 得到防治農作物細菌性病害的菌劑A、 B和C。
(3) 應用步驟(2)製備的防治農作物細菌性病害的菌劑防治水稻白葉枯
病
施用菌劑對水稻白葉枯病進行防治試驗田位於廣州市天河區岑村水稻田， 肥力中等，試驗所用水稻品種為晚稻協優85。水稻處於拔節期，試驗田塊為常 發病田塊。試驗期間日平均氣溫22.1 29.5。C，相對溼度90 95%。隨機選擇小 區，每個小區2m2，每小區種植水稻20穴。清水設三個小區，作為空白對照，對 照藥劑為20%噻森銅稀釋500倍液。在白葉枯病發病初期，即稻田出現零星病斑時按小區分別施用步驟(3)製備的防治農作物細菌性病害的菌劑A、 B、 C和對 照藥劑，用量分別為120mL/m2，使用手壓噴霧器噴霧莖葉，葉面和葉背都均 勻噴到，每個處理2個重複小區。以後每隔10d噴灑l次，連續3次。第3次施藥 後第7d、 14d和21d査防治效果。五點取樣，每個取樣點選取2株水稻，每株選取 旗葉及旗葉以下兩片葉，參照農藥田間藥效試驗準則進行試驗調查和計算防效。 防效計算公式為
病情指數-[i:(各級病葉數x相對級數值)/(調查總數x9)]x100 防治效果(％)=[(空白對照區病情指數-處理區病情指數)/空白對照區 病指指數]xlOO
試驗顯示，對照組水稻白葉枯病蔓延迅速，沿葉脈一側或兩側或中脈發展 成波紋狀的黃綠或灰綠色病斑；5 7d後病斑轉為灰白色，葉片向內巻曲。14d 後少數嚴重者全株枯死。使用蛭弧菌防治水稻白葉枯效果顯著，施用蛭弧菌-寡 糖後僅在第一天出現少量病斑，2d後，病斑不再擴大，病情得到控制，以後病 害幾乎不再發展。蛭弧菌BDSOl、蛭弧菌BDS02和蛭弧菌BDSM08分別與殼 寡糖聯用噴藥21d後的防效分別為72.3%、 68.7%、 74.1%，均優於20%噻森銅 500倍液的防效(60.4%)，防治效果如圖l所示。所有處理均不見藥害產生， 植株挺拔健壯，葉子舒展，長勢良好，生長狀況優於噴灑20%噻森銅500倍液。
實施例2防治水稻條斑病
(1) 蛭弧菌菌液的製備，同實施例l步驟(1)。
(2) 防治農作物細菌性病害的菌劑的製備
將蛭弧菌BDSOl、蛭弧菌BDS02和蛭弧菌BDSM08分別按細菌數1:1兩 兩(即BDS01與BDS02， BDS01與BDSM08， BDS02與BDSM08)混合，並 向每升混合菌液中分別加入15g瓊膠寡糖與15g葡聚寡糖，用磁力攪拌器震蕩 30s，得到防治農作物細菌性病害的菌劑A、 B和C;
將蛭弧菌BDSOl、蛭弧菌BDS02和蛭弧菌BDSM08按細菌數1:1:1混合， 在每升混合菌液中加入15g瓊膠寡糖與15g葡聚寡糖，用磁力攪拌器震蕩30s, 得到菌劑D。
(3) 應用步驟(2)製備的防治農作物細菌性病害的菌劑防治水稻條斑病 施用菌劑對水稻條斑病進行防治試驗田位於廣州市天河區岑村水稻田，
肥力中等，試驗所用水稻品種為晚稻協優85。水稻處於拔節期，試驗田塊為常 發病田塊。試驗期間日平均氣溫22.1 29.5。C，相對溼度90 95%。隨機選擇小區，每個小區2m2，每小區種植水稻20穴。清水設三個小區，作為空白對照。對 照藥劑為20%噻森銅500倍液，在條斑病發病初期，即稻田出現零星病斑時按小 區分別施用步驟(3)製備的防治農作物細菌性病害的菌劑A、 B、 C、 D和對照 藥劑，用量分別為120mL/m2，使用手壓噴霧器噴霧莖葉，葉面和葉背都均勻 噴到，每個處理2個重複小區。以後每隔7d噴灑1次，連續3次。第3次施藥後第 7d、 14d和21d査防治效果。五點取樣，每個取樣點選取2株水稻，每株選取旗葉 及旗葉以下兩片葉，參照農藥田間藥效試驗準則進行試驗調査和計算防效。
試驗顯示，對照組水稻條斑病病蔓延迅速，葉脈間病斑增多，5-10d內病 斑初呈暗綠色水漬狀，後呈黃褐色至紅褐色，長度從0.5mm擴大到lcm。 14d 後少數嚴重者出現菌膿。使用蛭弧菌-寡糖防治水稻條斑病效果顯著，所有處理 僅在第一天出現少量病斑，2d後，病斑不再擴大，病情得到控制，以後病害幾 乎不再發展。如圖2所示，菌劑D (即BDSOl、 BDS02與BDSM08三種菌液 1:1:1混合，並添加瓊膠寡糖、葡聚糖各15g/L)在噴藥21d後的防效為81.8%， 優於20%噻森銅500倍液(75.3%)，菌劑B (即BDS01與BDSM08菌液1:1 混合，並添加瓊膠寡糖、葡聚糖各15g/L)在噴藥14d後的防效為82.4"5/。，噴藥 21d後防效為84.6。/。，優於其他三種菌劑及20%噻森銅500倍液，防效最好。菌 劑A、 B、 C、 D對水稻的處理均不見藥害產生，植株挺拔健壯，葉子舒展，長 勢良好，生長狀況優於噴灑20%噻森銅500倍液。
實施例3 防治黃瓜細菌性角斑病
(1) 蛭弧菌菌液的製備，同實施例l步驟(1)。
(2) 防治農作物細菌性病害的菌劑的製備
將蛭弧菌BDS01菌液和蛭弧菌BDSM08菌液按細菌數1:1混合，用生理 鹽水稀釋，濃度分別為103pfU/mL、 105pfti/mL、 107pfb / mL和109pfU / mL 四個濃度等級，接著分別在不同濃度的蛭弧菌溶液中，每升混合菌液加入10g 殼寡糖和20g葡聚寡糖，用磁力攪拌器震蕩30s，得到防治農作物細菌性病害的 菌劑A、 B、 C和D;將蛭弧菌BDSOl 、 BDS02、和BDSM08菌液按細菌數1:1:1 混合，用生理鹽水稀釋，濃度分別為103pfu/mL、 105pfU/mL、 107pfo/mL 和10、fU/mL四個濃度等級，接著分別在不同濃度的蛭弧菌溶液中，每升混合 菌液中加入10g瓊膠寡糖和20g褐藻膠寡糖，用磁力攪拌器震蕩30s，得到防 治農作物細菌性病害的菌劑E、 F、 G和H。
(3) 應用步驟(2)製備的防治農作物細菌性病害的菌劑防治黃瓜角斑病
10施用菌劑對黃瓜苗期角斑病進行防治試驗試驗在廣州白雲區良田鎮大棚 內進行，供試品種為寶楊五號老黃瓜。隨機選擇小區，每個小區3m2，每小區 種植黃瓜10株。當黃瓜長至3 4片真葉時，正值陰雨天氣，大棚內溫度高溼 度大，試驗期平均溫度22.8 26.3T:，相對溼度為97 100%，大棚內黃瓜苗開 始有零星角斑病出現。清水設三個小區，作為空白對照。對照藥劑為20%噻森 銅200倍液，在角斑病發病初期，即出現零星病斑時按小區分別施用步驟(3) 製備的防治農作物細菌性病害的菌劑A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H和對照藥劑， 用量分別為120mL / m2，使用使用手壓噴霧器噴霧莖葉，葉面和葉背都均勻噴 到，每個處理2個重複小區。以後每隔10d灌施1次，連續3次。第3次噴 藥後5d、 10d和15d後調查防效。五點取樣，每個取樣點選取一株黃瓜幼苗， 每株黃瓜選取上、中兩片葉子，參照農藥田間藥效試驗準則進行試驗調查和計 算防效。
施藥後，對照組發病率持續上升，病斑增加擴大，沿葉脈蔓延呈六角形， 葉背部出現菌膿，嚴重者葉片穿孔，乾枯脫落，植株死亡。而第2次施用蛭弧菌 混合液2d後，施用混合蛭弧菌液組病斑不再擴大，新病斑產生少，黃瓜苗長勢 良好，僅是低濃度(蛭弧菌含量10 fo/mL)的混合液產生相對多的新病斑， 但病斑發展緩慢，病情不嚴重。且蛭弧菌濃度為10ifb/mL的高濃度混合液施 用兩次後未見藥害產生。試驗表明，效果最優的為菌劑C，菌劑C施用10d和15d 後防效分別為87.5%和85.3%，防效略高於菌劑G和2(P/。噻菌銅200倍液，如圖3 所示。
實施例4 防治番茄潰瘍病
(1) 蛭弧菌菌液的製備，同實施例l步驟(1)。
(2) 防治農作物細菌性病害的菌劑的製備
將蛭弧菌BDS01菌液和蛭弧菌BDSM08菌液按細菌數1:2混合，用磷酸 鹽緩衝液(0.2 mol/L， pH7.2 7.6)調整菌液濃度為107pfii/mL，在每升混 合菌液中加入12g殼寡糖和18g褐藻膠寡糖，用磁力攪拌器震蕩30s，得到防 治農作物細菌性病害的菌劑A;將蛭弧菌BDSOl、 BDS02、和BDSM08菌液按 細菌數1:1:2混合，用磷酸鹽緩衝液調整菌液濃度為107pfo/mL，在每升混合 菌液中加入12g瓊膠寡糖和18g葡聚寡糖，用磁力攪拌器震蕩30s，得到防治 農作物細菌性病害的菌劑B。
(3) 應用歩驟(2)製備的防治農作物細菌性病害的菌劑防治番茄潰瘍病用金氏B (KB)固體培養基培養番茄潰瘍病病原菌密執安棍狀桿菌 (C/av化acfer m!'cWga"erafs)(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC， 菌株號CGMCC 1.1909)，在27'C培養24h後將菌苔刮下，稀釋成濃度為107 1ScfU/mL單位的菌懸液，待用。
施用菌劑對番茄潰瘍病進行防治試驗試驗在廣州白雲區良田鎮大棚內進 行，供試品種為佳紅4號。試驗期平均溫度22.8 26.3-C，相對溼度為100%。隨 機選擇小區，每個小區3m2，每小區種植番茄10株。對照藥劑為20%噻菌銅300 倍液，清水設三個小區，為空白對照。番茄坐果期將0.5 lcm完好幼果用保鮮 袋套住，袋口用細繩系牢。待番茄長至直徑2 3cm時，解開保鮮袋。用手壓噴 霧器噴灑植株密執安桿菌菌懸液100mL/m2，使整個植株表面溼潤，自然晾乾 後將步驟(3)製備的防治農作物細菌性病害的菌劑A、 B和對照藥劑按小區用 手壓噴霧器均勻噴灑植株，用量分別為180mL/m2。隔8天再噴藥一次，連噴2 次。第2次噴藥後7d、 14d和21d調査病果率和發病程度，參照農藥田間藥效試驗 準則進行試驗調査和計算防效。
接種ld-2d，各組均出現新的潰瘍病病斑，但是處理組明顯少於對照組，5d 後，對照組病情蔓延加重，幼果上病部溢出菌膿，病斑向幼果內部擴展，少數 病果早落。施用菌劑組抗病力與20%噻菌銅200倍液相當，僅有少數病斑，2d 後病斑不再擴大，罕見病斑連片危害果肉。實驗結果表明，菌劑A第二次施藥 後14d防效為71.4%,與20%噻菌銅200倍液防效相近，且未見藥害發生。在 番茄生長過程中繼續使用菌劑，病害極少發生，成熟時品質優良，色澤碧綠光 滑，極少有病斑。施用菌劑的平均單果重量重於清水對照組，比清水對照組增 產32.5%。同時實驗顯示，菌劑B對番茄潰瘍病也具有良好的防治效果，具體 防效如圖4所示。
實施例5 防治大白菜軟腐病
(1) 蛭弧菌菌液的製備，同實施例l步驟(1)。
(2) 防治農作物細菌性病害的菌劑的製備
將蛭弧菌BDS01菌液與蛭弧菌BDSM08菌液按細菌數1:3混合。在每升 混合菌液中加入10g殼寡糖、10g瓊膠聚糖和10g低聚麥芽糖，用磁力攪拌器 震蕩30s，得到防治農作物細菌性病害的菌劑A;在每升混合菌液中加入3.3g 殼寡糖、3.3g瓊膠聚糖和3.3g低聚麥芽糖，用磁力攪拌器震蕩30s，得到防治 農作物細菌性病害的菌劑B。(3)應用步驟(2)製備的防治農作物細菌性病害的菌劑防治大白菜軟腐
病
含有歐文氏菌土壤的製備用普通營養肉湯(NB)培養基，160rpm28 °C培養12 16h，增殖歐文氏菌(五rWm》sp.)(購於中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，菌株號CGMCC1.1215)使菌液濃度為105cfb / mL， NB懸浮，按菌懸液與無菌土壤按重量比為l:4的比例混勻。
對大白菜軟腐病進行防治試驗在廣州市天河區岑村進行，試驗期間平均溫度為22.8 26.3'C、相對溼度為100%。實驗所用大白菜品種為山東2號。對照藥劑為75%百菌清可溼性粉劑500倍液，清水做空白對照。採用無菌土壤溫室盆栽白菜幼苗，待大白菜培育至5 6片葉時將白菜移入上述含有歐文氏菌的土壤中進行試驗，每小區0.5m2，每小區20株。移栽後立即按小區用手壓噴霧器噴灑步驟(3)製備的防治農作物細菌性病害的菌劑A、 B和對照藥劑，每個處理2個重複小區，用量分別120mL/m2。 10d後再重複施藥一次。第2次施藥7d、 14d和21d後觀察發病情況，參照農藥田間藥效試驗準則進行試驗調査和計算防效。
施藥後，對照組3d後開始出現軟腐病病症，基部先發病，出現水漬狀微黃色病斑，隨後葉柄基部或根莖處潰爛，流出粘液，嚴重者腐爛死亡。處理組的發病率顯著低於對照組，該組大白菜發病少，莖葉茁壯，色澤碧綠，長勢良好。實驗結果表明，菌劑A的效果最佳，第2次施藥21d後達到82.6n/。，如圖5所示。菌劑B的效果稍次，但是在大白菜生長過程中繼續使用菌劑B，病害極少發生，成熟時品質優良，平均單株重量重於對照組和蛭弧菌單獨使用組，與對照組相比平均單棵增重23.7%。
實施例6 防治茄子青枯病
(1) 蛭弧菌菌液的製備，同實施例l步驟(1)。
(2) 防治農作物細菌性病害的菌劑的製備
將BDS01蛭弧菌液和BDSM08蛭弧菌液按細菌數2:3混合。在每升混合菌液中加入5g殼寡糖、10g瓊膠寡糖和15g褐藻膠寡糖，用磁力攪拌器震蕩30s，得到防治農作物細菌性病害的菌劑。
(3) 應用步驟(2)製備的防治農作物細菌性病害的菌劑防治茄子青枯病施用菌劑對茄子青枯病進行防治試驗在廣州市天河區岑村進行，所用茄
子品種為新龍紫長茄，試驗期間平均溫度為22.8 26.3'C，相對溼度為100%，對照藥劑為75°/。百菌清可溼性粉劑500倍液，清水為空白對照。採用無菌土壤溫室盆栽茄子幼苗，待茄子育至5 6片葉時移入大棚中，每個小區lm2，種植茄子20株。移栽後立即按小區分別用步驟(3)製備的防治農作物細菌性病害的菌劑和對照藥劑灌根，每株用量150ml，每個處理2個小區。隔10d再重複施藥一次。第2次施藥7d、 14d和21d後調查每小區病株數。參照農藥田間藥效試驗準則進行試驗調查和計算防效。
施藥後，對照組3d後開始出現軟腐病病症，發病植株葉片呈現萎垂，後逐漸擴展到整株枝條上。初呈淡綠色，變褐焦枯，病葉脫落或殘留在枝條上。將莖部皮層剝開木質部呈褐色。嚴重者褐變延伸到上面枝條的木質部。枝條裡面的髓部大多腐爛空心。處理組的發病率顯著低於對照組，該組茄子幼苗發病少，莖葉茁壯，色澤碧綠，長勢良好。實驗結果表明，菌劑第2次施藥21d防效達到73.5%,如圖6所示。在茄子生長過程中繼續使用菌劑，病害極少發生，成熟時品質優良，平均單個重量重於對照組和蛭弧菌單獨使用組，與對照組相比平均單個增重10.8%。
實施例7 防治大白菜黑腐病
(1) 蛭弧菌菌液的製備，同實施例1步驟(1)。
(2) 防治農作物細菌性病害的菌劑的製備
將BDS01蛭弧菌液和BDSM08蛭弧菌液按細菌數1:4混合。在每升混合菌液中加入5g殼寡糖、5g瓊膠寡糖、5g褐藻膠寡糖和5g低聚麥芽糖，用磁力攪拌器震蕩30s，得到防治農作物細菌性病害的菌劑A;在每升混合菌液中加入5g殼寡糖、5g瓊膠寡糖、5g葡聚寡糖、5g低聚麥芽糖，用磁力攪拌器震蕩30s，得到防治農作物細菌性病害的菌劑B。
(3) 應用步驟(2)製備的防治農作物細菌性病害的菌劑防治大白菜黑腐
病
施用菌劑大白菜黑腐病進行防治本試驗設在歷年發病較重的廣州市天河區岑村，白菜品種為山東2號。試驗區的土壤類型為沙壤土， 土質肥沃。試驗期平均溫度21.5 25.3匸，相對溼度為91 95%。對照藥劑為72%農用鏈黴素4000倍液，清水為空白對照。試驗設每小區lm2，種植大白菜15株。大白菜定植時分別按小區用手壓噴霧器噴灑步驟(3)製備的防治農作物細菌性病害的菌劑A、B和對照藥劑，用量120mL/m2。之後隔10天1次，連續防治2次。第2次藥後5d、10d和15d後觀察發病情況，參照農藥田間藥效試驗準則進行試驗調査和計算防效。
14參照農藥田間藥效試驗準則進行試驗調査和計算防效。
實驗顯示清水組在白菜生長期出現黑腐病的症狀，染病子葉呈水浸狀，發
病後2-5d葉斑從葉緣向內擴展，7d後根髓部變黑，10d後發現幼苗枯死。處理組的發病率顯著低於對照組，該組大白菜只有零星發病，病情不嚴重，無枯死的幼苗。實驗結果顯示，施用菌劑A的植株色澤碧綠，長勢良好。菌劑A第2次施藥15d後防效達到79.2。/。。在大白菜生長過程中繼續使用蛭弧菌-寡糖，病害極少發生，成熟時品質優良，平均單株重量重於對照組和農用鏈黴素4000倍液組，與對照組相比平均單棵增重15.1%。
實施例8防治西葫蘆根腐病
(1) 蛭弧菌菌液的製備，同實施例l步驟(1)。
(2) 防治農作物細菌性病害的菌劑的製備
將BDS01蛭弧菌液和BDSM08蛭弧菌液按細菌數1:1混合，用磷酸鹽緩衝液(0.2 mol/L， pH7.2 7.6)調節菌體數至107pfh/mL，在每升混合菌液中加入5g殼寡糖、5g瓊膠寡糖、5g葡聚寡糖、5g褐藻膠寡糖和5g低聚麥芽糖，用磁力攪拌器震蕩30s，得到防治農作物細菌性病害的菌劑。
(3) 應用步驟(2)製備的防治農作物細菌性病害的菌劑防治西葫蘆根腐
病
施用菌劑對西葫蘆根腐病進行防治本試驗設在歷年發病較重的廣州市天河區岑村，試驗區的土壤類型為沙壤土， 土質肥沃。試驗期平均溫度21.5-25.3°C，相對溼度為91%-95%。西葫蘆品種為寒玉。試驗設每小區3m2，種植西葫蘆12株。對照藥劑為75%百菌清可溼性粉劑500倍液，清水設三個小區，作為空白對照。大田定植時分別按小區用以上蛭弧菌寡糖混合液和百菌清溶液均勻灌於植株根部，每株灌150mL，每個處理三個重複小區。以後每隔15d灌施l次，連續2次。第2次施藥後5d、 10d和15d後統計每小區病株數，參照農藥田間藥效試驗準則進行試驗調査和計算防效。
定植後，大田西葫蘆開始發生根腐病。在本試驗中，清水組發病較重，發病植株最初呈現水浸狀，莖縮小乾枯，8d後病處開始有腐爛現象，維管束變褐，後期嚴重的萎蔫枯死。處理組西葫蘆長勢良好，少見染病。發病株病斑沒有蔓延，並且有逐漸消失跡象。實驗顯示，第2次施用15d後防效為82.0^，優於75%百菌清可溼性粉劑500倍液。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
1權利要求
1、一種防治農作物細菌性病害的菌劑，其特徵在於所述菌劑包含蛭弧菌和寡糖。
2、 根據權利要求1所述的防治農作物細菌性病害的菌劑，其特徵在 於每升所述菌劑中含106 1012pfU的蛭弧菌和10 30g寡糖。
3、 根據權利要求2所述的防治農作物細菌性病害的菌劑，其特徵在 於所述蛭弧菌為蛭弧菌(^fe//ov/6n'osp.) BDSOl、蛭弧菌(B&〃ov/6n'o sp.) BDS02或蛭弧菌(^fe〃oW6n'osp.) BDSM08中的至少一株。
4、 根據權利要求2所述的防治農作物細菌性病害的菌劑，其特徵在 於所述蛭弧菌為蛭弧菌BDSOl與蛭弧菌BDSM08以細菌數比1:1混合。
5、 根據權利要求2所述的防治農作物細菌性病害的菌劑，其特徵在 於所述寡糖為殼寡糖、瓊膠寡糖、葡聚寡糖、褐藻膠寡糖或低聚麥芽糖 中的至少一種。
6、 權利要求2 5任一項所述防治農作物細菌性病害的菌劑的製備方 法，其特徵在於將蛭弧菌用DNB培養基、水、生理鹽水或0.2 mol / LpH 值為7.2 7.6的磷酸鹽緩衝液調整至菌液濃度為106 1012pfU/L後加入 寡糖，寡糖的加入量為10 30g/L，混勻，得到防治農作物細菌性病害的 菌劑。
7、 權利要求1 5任一項所述防治農作物細菌性病害的菌劑的應用， 其特徵在於將所述防治農作物細菌性病害的菌劑噴灑植株的莖、葉、穗、 果實或灌根淋根；所述防治農作物細菌性病害的菌劑中蛭弧菌的含量至少 為103pfU/mL。
8、 根據權利要求7所述防治農作物細菌性病害的菌劑的應用，其特 徵在於所述防治農作物細菌性病害的菌劑噴灑植株的莖、葉、穗或果實； 或者所述防治農作物細菌性病害的菌劑用於灌根淋根。
9、 根據權利要求8所述防治農作物細菌性病害的菌劑的應用，其特 徵在於所述防治農作物細菌性病害的菌劑噴灑植株的莖、葉、穗或果實， 用量最少為80rnL / m2;所述防治農作物細菌性病害的菌劑用於灌根淋根，用量最少為100mL /株。
10、 根據權利要求7所述防治農作物細菌性病害的菌劑的應用，其特徵在於所述防治農作物細菌性病害的菌劑用於防治十字花科蔬菜軟腐病、黑 腐病、根腐病，使用方法為灌根淋根或噴灑莖或葉；所述防治農作物細菌性病害的菌劑用於防治黃瓜和豆科植物細菌性角斑病，使用方法為灌根淋根、噴灑莖、葉或果實；所述防治農作物細菌性病害的菌劑用於防治茄科蔬菜青枯病、軟腐 病、潰瘍病，使用方法為灌根淋根、噴灑莖、葉或果實；所述防治農作物細菌性病害的菌劑用於防治禾本科農作物細菌性條 斑病、白葉枯病，使用方法為噴灑莖、葉或穗。
全文摘要
本發明公開了一種防治農作物細菌性病害的菌劑及其製備方法與應用。本發明通過蛭弧菌液中加入寡糖，混勻，得到防治農作物細菌性病害的菌劑。本發明首次將蛭弧菌應用於農作物細菌性病害的防治，填補國內外蛭弧菌研究開發的空白，增加了生物農藥的新種類。由於蛭弧菌具有裂解譜廣，生長迅速的特點，對多種細菌病原菌具有優異的消滅能力。寡糖與之聯用後，增強農作物抗性，藥效大幅提高，擴大了細菌性病害的防治譜。本發明所製備的菌劑無毒，無汙染，對農作物病蟲害天敵安全，而且病原菌基本不對其產生抗性，克服了抗生素濫用帶來「3R」問題，也避免了當前化學農藥汙染嚴重，破壞生態平衡的弊端。
文檔編號A01N63/02GK101637186SQ20091004226
公開日2010年2月3日 申請日期2009年8月28日 優先權日2009年8月28日
發明者蔡俊鵬, 韓曉寧 申請人:華南理工大學