高強度絲素骨修復支架材料的製備方法
2023-07-30 17:21:01
專利名稱：高強度絲素骨修復支架材料的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種骨修復支架材料的製備方法，尤其是涉及一種高強度絲素骨修復支架材料的製備方法，是一種製備高強度絲素骨修復支架材料的方法，屬於生物材料領域。
背景技術：
家蠶絲素蛋白、柞蠶絲素蛋白和蜘蛛絲蛋白具有優良的力學性能、生物相容性、無免疫排斥或者炎症反應、可降解性以及本質是天然蛋白質的結構特點，在生物材料領域受到高度的關注。絲蛋白可用作骨組織修復、創面覆蓋材料、藥物緩釋材料、微膠囊、人造器官等不同形狀與功能的生物材料，以滿足人類對生物材料的不同需求。天然絲蛋白在昆蟲體內合成、分泌，並且以高濃度(家蠶中部絲腺蛋白可達30wt%)的絲蛋白溶液的形式貯存在各種絲腺中。然而,一旦經過昆蟲噴出的絲纖維凝固之後，便很難再溶於水中，只能溶於強酸、強鹼、HFA、HFIP、LiBr、LiSCN等化學溶劑中，這些溶劑都屬於材料製備當中的腐蝕性溶液，不僅對生物體有毒副作用，有違於相應的生物安全標準，而且廢棄的溶劑對環境也有很大的汙染性，溶劑的成本高。經過化學試劑處理得到的再生絲蛋白，因為其分子量大為下降，製備得到的生物支架材料機械性能也顯著降低。有研究採用化學交聯法來製備不溶性絲素多孔支架，但也可能帶來交聯劑在生物體內殘留影響生物相容性。這些缺點一直以來都制約著絲蛋白材料在生物材料中的應用，如何消除生物材料中殘留的化學試劑以及如何提高其力學性能，是絲蛋白多孔支架材料製備中亟待解決的難題，並對絲素蛋白在生物醫學材料領域的應用具有重要意義。現在也有一些其他方式來製備絲素蛋白材料，如
公開日為2009年12月09日，公開號為CN101596327的中國專利中，公開了一種三維絲素蛋白多孔支架材料的製備方法，該製備方法是將體積濃度為·2% 50WT%的絲素蛋白水溶液置於容器中，然後在20°C 80°C不斷攪拌的情況下在絲素溶液中加入氯化鈉，其中氯化鈉顆粒的質量(單位為克)與絲素溶液的體積(單位為ML)比為I 20: I ;絲素溶液經凝膠、靜置、沉澱後,取沉澱部分，繼續攪拌將沉澱物混合均勻，然後將其放入所需形狀的模具中，烘乾；最後經蒸餾水洗去支架中的氯化鈉，即得到具有三維多孔結構的絲素支架材料。該方法雖然沒有使用任何有機溶劑，對生物體無毒副作用，但是製備而成的絲素支架材料的力學性能較差。又如
公開日為2010年10月20日，公開號為CN101864177A的中國專利中，公開了一種多孔蠶絲絲素蛋白材料的製備方法，該製備方法將蠶絲脫膠、溶解、透析獲得絲素蛋白溶液；按摩爾比，將等比例的羧酸或羧酸溶液與檸檬酸混合，加熱溶解後再加入聚乙二醇，得到促膠凝劑；將絲素蛋白溶液與促膠凝劑混合後倒入模具中，得到絲素蛋白凝膠，在10 100°C的溫度條件下加熱乾燥後得到多孔絲素蛋白材料。該方法中使用的有機溶劑對生物存在一定的毒副作用。綜上所述，目前還沒有一種加工工藝簡單，製備條件溫和，絲素支架材料的力學性能強，成本低廉，對環境無汙染的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中存在的上述不足，而提供一種加工工藝簡單，製備條件溫和，絲素支架材料的力學性能強，成本低廉，對環境無汙染的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法。本發明解決上述問題所採用的技術方案是:該高強度絲素骨修復支架材料的製備方法的特點在於:該製備方法包括如下步驟:
(1)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白；
(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌1-5次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物；
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，然後置於搖床上輕輕振搖0.3-4個小時得到溶液，再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液；
(4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液加工製備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。由此使得本發明的加工工藝簡單，製備條件溫和，生產過程環保，製備而成的高強度絲素骨修復支架材料的力學性能強，而且成本低廉，對環境無汙染。作為優選，本發明所述步驟(4)中，先用雙蒸水將絲素蛋白水溶液的濃度調整到lwt%-20wt%，然後滴加到細胞培養板中，在25-35°C的條件下保存8-16個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，·以及絲素蛋白的二級結構向β_摺疊轉變，從而得到絲素蛋白；將絲素蛋白放在-30- (-10) °C的條件下冷凍1-3個小時，再經過真空冷凍乾燥14-34個小時，從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料。由此使得本發明製備而成的高強度絲素骨修復支架材料的力學性能更好。作為優選，本發明將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為65-85%的酒精中8-16個小時，此過程作為後處理過程，目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能，以及延緩高強度絲素骨修復支架材料在生物體內的降解速度。作為優選，本發明所述步驟(I)中，含有絲腺蛋白的昆蟲為家蠶、野蠶或蜘蛛。作為優選，本發明所述步驟(3)中，將浸有絲素蛋白膠狀物的雙蒸水置於搖床上輕輕振搖I個小時得到溶液，再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液，該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高於250kDa ;所述步驟(4)中，所述高強度絲素骨修復支架材料的彈性壓縮模量在5Mpa以上。作為優選，本發明所述步驟(4)中，將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍乾燥方式或鹽析法加工製備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。作為優選，本發明所述步驟(2)和(3)均在0°C的環境中進行。作為優選，本發明所述步驟(4)中，先用雙蒸水將絲素蛋白水溶液的濃度調整到lwt%-20wt%,然後滴加到48孔細胞培養板中，每孔加入的量為浸沒48孔板為準，在30°C的條件下保存12個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，以及絲素蛋白的二級結構向β -摺疊轉變，從而得到絲素蛋白；將絲素蛋白放在_20°C的條件下冷凍2個小時，再經過真空冷凍乾燥24個小時，從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料。作為優選，本發明將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為75%的酒精中12個小時。作為優選，本發明所述家蠶為五齡第7天的家蠶幼蟲。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果:1、優良的機械性能:與再生家蠶絲素材料或者混合有家蠶絲素蛋白做成的多孔支架材料相比，其力學性能優良，具有很高的彈性模量。2、良好的生物相容性:材料本身或者降解產物對細胞無毒性反應，水溶性絲素蛋白具有較高的細胞粘附率和增殖率，表現出良好的生物相容性。3、操作簡單，生產周期短:加工工藝簡單，沒有複雜繁瑣的提取材料過程，時間上大為節省。4、經濟環保:製備過程中未使用其它成本高的化學試劑，製備條件溫和，成本低廉，相對於使用化學試劑製備的材料來說，對環境無汙染。本發明製備而成的高強度絲素骨修復支架材料的內部結構、孔徑尺寸和孔隙大小均勻，連通性好，有利於骨細胞的粘附分化增殖等。而且，隨著水溶性絲素蛋白濃度的增加，其孔隙率逐漸降低。本發明製備而成的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長，將該高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進骨組織的生長。本發明中絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高於250kDa，即得到的水溶性絲素蛋白分子量高於250 kDa，與完整的絲素蛋白重鏈的分子量相近。本發明製備而成的高強度絲素骨修復支架材料的最大抗壓強度可高達6.9±0.4MPa，具有很強的力學性能，不僅沒有細胞毒性，而且對細胞具有粘附和促進作用。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明，以下實施例是對本發明的解釋而本發明並不局限於以下實施·例。實施例1。本實施例中的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法包括如下步驟。(I)用醫用鉗將五齡第7天的家蠶幼蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白。本發明也可以使用含有絲腺蛋白的其他昆蟲，如野蠶或蜘蛛。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物。步驟(2)在0°C的環境中進行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，然後置於搖床上輕輕振搖I個小時得到溶液，再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液。步驟(3)在0°C的環境中進行。(4)先用雙蒸水將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液的濃度調整到lwt%_20wt%，然後滴加到48孔細胞培養板中，每孔加入的量為浸沒48孔板為準，在30°C的條件下保存12個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，以及絲素蛋白的二級結構向摺疊轉變，從而得到絲素蛋白。將絲素蛋白放在-20°C的條件下冷凍2個小時，再經過真空冷凍乾燥24個小時，從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料。將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作為後處理過程，目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能，以及延緩高強度絲素骨修復支架材料在生物體內的降解速度。
本實施例製備而成的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長，將該高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進骨組織的生長。實施例2。本實施例中的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法包括如下步驟。(I)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白。含有絲腺蛋白的昆蟲可以為家蠶、野蠶或蜘蛛。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌1-5次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，然後置於搖床上輕輕振搖0.3-4個小時得到溶液，再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液。(4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液加工製備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。本實施例製備而成的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長，將該高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進骨組織的生長。實施例3。本實施例中的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法包括如下步驟。(I)將含有絲腺蛋白的家蠶中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌三次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，然後置於搖床上輕輕振搖1.5個小時得到溶液，再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液，該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高於250kDa。(4)先用雙蒸水將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液的濃度調整到20wt%，然後滴加到細胞培養板中，在25-35 V的條件下保存8-16個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，以及絲素蛋白的二級結構向β_摺疊轉變，從而得到絲素蛋白。將絲素蛋白放在-30- (-10) 0C的條件下冷凍1-3個小時，再經過真空冷凍乾燥14-34個小時，從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料，該高強度絲素骨修復支架材料的彈性壓縮模量在5Mpa以上。本實施例製備而成的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長，將該高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進骨組織的生長。實施例4。
本實施例中的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法包括如下步驟。(I)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白。本發明中含有絲腺蛋白的昆蟲可以為家蠶、野蠶或蜘蛛，優選為五齡第7天的家蠶幼蟲。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌1-5次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物。步驟(2)在0°C的環境中進行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，將浸有絲素蛋白膠狀物的雙蒸水置於搖床上輕輕振搖I個小時得到溶液，再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液，該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高於250kDa。本發明可以將浸有絲素蛋白膠狀物的雙蒸水置於搖床上輕輕振搖
0.3-4個小時得到溶液。步驟(3)在0°C的環境中進行。(4)先用雙蒸水將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液的濃度調整到lwt%，然後滴加到48孔細胞培養板中，每孔加入的量為浸沒48孔板為準，在30°C的條件下保存12個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，以及絲素蛋白的二級結構向摺疊轉變，從而得到絲素蛋白；將絲素蛋白放在_20°C的條件下冷凍2個小時，再經過真空冷凍乾燥24個小時，從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料，該高強度絲素骨修復支架材料的彈性壓縮模量在5Mpa以上。再將步驟(4)製得的·多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作為後處理過程，目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能，以及延緩高強度絲素骨修復支架材料在生物體內的降解速度。本發明可以將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為65-85%的酒精中8-16個小時。本實施例製備而成的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長，將該高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進骨組織的生長。當然，本發明可以先用雙蒸水將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液的濃度調整到lwt%-20wt%，然後滴加到細胞培養板中，可以在25-35°C的條件下保存8-16個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，以及絲素蛋白的二級結構向摺疊轉變，從而得到絲素蛋白。可以將絲素蛋白放在-30- (-10) °C的條件下冷凍1-3個小時，再經過真空冷凍乾燥14-34個小時，從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料。本發明可以將步驟(3 )得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍乾燥方式或鹽析法加工製備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。實施例5。本實施例中的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法包括如下步驟。(I)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白。含有絲腺蛋白的昆蟲可以為家蠶、野蠶或蜘蛛。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌1-5次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物。步驟(2)可以在-5°C至5°C的低溫環境中進行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，然後置於搖床上輕輕振搖0.3-4個小時得到溶液，再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液，該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高於250kDa。步驟(3)可以在-5°C至5°C的低溫環境中進行。(4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍乾燥方式或鹽析法加工製備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。再將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為65-85%的酒精中8-16個小時，此過程作為後處理過程，目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能，以及延緩高強度絲素骨修復支架材料在生物體內的降解速度。本實施例製備而成的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長，將該高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進骨組織的生長。實施例6。本實施例中高強度絲素骨修復支架材料製備方法依次包括如下步驟。(I)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖後取出中部絲腺。除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環境中進行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當解剖的家蠶數量為20條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.1小時，所得溶液經過離心分離去除不溶物後，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環境中進行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高於250kDa。(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到2wt%濃度，滴加到48孔細胞培養板中，每孔加入的量為浸沒48孔板。30°C保存12小時，使絲素蛋白水溶液中的水分減少，及絲素蛋白的二級結構向摺疊轉變。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白放在_20°C冰箱中冷凍2個小時，之後真空冷凍乾燥24小時，得到高強度絲素骨修復支架材料。(7)將步驟(6)中的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作用為後處理過程，目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能，及延緩支架材料在生物體內的降解速度。(8)步驟(7)得到的高強度絲素骨修復支架材料的彈性壓縮模量達5Mpa以上。實施例7。(I)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖後取出中部絲腺。除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌三次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在0°C環境中進行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當解剖的家蠶數量為20條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖I小時，所得溶液經過離心分離去除不溶物後，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環境中進行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高於250kDa。(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到2wt%濃度，滴加到48孔細胞培養板中，每孔加入的量為浸沒48孔板。30°C保存12小時，使絲素蛋白水溶液中的水分減少，及絲素蛋白的二級結構向摺疊轉變。(6)將步 驟(5)中的絲素蛋白放在_20°C的冰箱中冷凍2個小時，之後真空冷凍乾燥24小時，得到高強度絲素骨修復支架材料。(7)將步驟(6)中的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作用為後處理過程，目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能，及延緩支架材料在生物體內的降解速度。(8)將步驟(7)得到的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長。實施例8。(I)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖後取出中部絲腺。除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環境中進行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當解剖的家蠶數量為20條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.2小時，所得溶液經過離心分離去除不溶物後，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環境中進行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高於250kDa。(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到2wt%濃度，滴加到48孔細胞培養板中，每孔加入的量為浸沒48孔板。30°C保存12小時，使絲素蛋白水溶液中的水分減少及絲素蛋白的二級結構向摺疊轉變。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白放在_20°C冰箱中冷凍2個小時，之後真空冷凍乾燥24小時，得到高強度絲素骨修復支架材料。(7)將步驟(6)中的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作用為後處理過程，目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能，及延緩支架材料在生物體內的降解速度。(8)將步驟(7)得到的高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進骨組織的生長。實施例9。(I)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖後取出中部絲腺，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌三次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環境中進行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當解剖的家蠶數量為21條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖I小時，所得溶液經過離心分離去除不溶物後，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環境中進行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高於250kDa。(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到5wt%濃度，將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻，滴加到48孔細胞培養板中，每孔加入的量為浸沒48孔板，20°C風乾24小時。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中，將氯化鈉溶解到去離子水中，得到高強度絲素骨修復支架材料。(7)將步驟 (6)中的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作用為後處理過程，目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能，及延緩支架材料在生物體內的降解速度。(8)步驟(7)得到的高強度絲素骨修復支架材料的彈性壓縮模量達5Mpa以上。
實施例10。(I)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖後取出中部絲腺，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環境中進行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當解剖的家蠶數量為22條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.1小時，所得溶液經過離心分離去除不溶物後，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環境中進行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高於250kDa。(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到5wt%濃度，將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻，滴加到48孔細胞培養板中，每孔加入的量為浸沒48孔板，20°C風乾24小時。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中，將氯化鈉溶解到去離子水中，得到高強度絲素骨修復支架材料。(7)將步驟(6)中的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作用為後處理過程，目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能，及延緩支架材料在生物體內的降解速度。(8)將步驟(7)得到的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長。實施例11。(I)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖後取出中部絲腺，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環境中進行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當解剖的家蠶數量為21條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.2小時，所得溶液經過離心分離去除不溶物後，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環境中進行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高於250kDa。(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到5wt%濃度，將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻，滴加到48孔細胞培養板中，每孔加入的量為浸沒48孔板，20°C風乾24小時。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中，將氯化鈉溶解到去離子水中，得到高強度絲素骨修復支架材料。(7)將步驟(6)中的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作用為後處理過程，目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能，及延緩支架材料在生物體內的降解速度。(8)將步驟(7)得到的高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進骨組織的生長。
實施例12。(I)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖後取出中部絲腺，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環境中進行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當解剖的家蠶數量為18條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖0.95小時，所得溶液經過離心分離去除不溶物後，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環境中進行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高於250kDa。(5 )將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到10wt%濃度，將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻，滴加到48孔細胞培養板中，每孔加入的量為浸沒48孔板，20°C風乾24小時。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中，將氯化鈉溶解到去離子水中，乾燥後得到高強度絲素骨修復支架材料。(7)將步驟(6)得到的高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進骨組織的生長。實施例13。(I)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖後取出中部絲腺，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環境中進行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當解剖的家蠶數量為20條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖I小時，所得溶液經過離心分離去除不溶物後，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環境中進行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高於250kDa。(5 )將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到10wt%濃度，將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻，滴加到48孔細胞培養板中，每孔加入的量為浸沒48孔板，20°C風乾24小時。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中，將氯化鈉溶解到去離子水中。乾燥後得到高強度絲素骨修復支架材料。(7)將步驟(6)得到的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長。實施例14。本實施例中的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法包括如下步驟。(I)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白。含有絲腺蛋白的昆蟲可以為家蠶、野蠶或蜘蛛。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌3次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物，此過程在0.1°C環境中進行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物 ，然後置於搖床上輕輕振搖1.3個小時得到溶液，再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液，該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高於250kDa。此過程在0.1°C環境中進行。(4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍乾燥方式加工製備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料，再將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為70%的酒精中12.5個小時，此過程作為後處理過程，目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能，以及延緩高強度絲素骨修復支架材料在生物體內的降解速度。本實施例製備而成的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長，將該高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位，能促進骨組織的生長。實施例15。本實施例中高強度絲素骨修復支架材料製備方法依次包括如下步驟。(I)用醫用鉗將野蠶幼蟲解剖後取出中部絲腺，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌一次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環境中進行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當解剖的家蠶數量為25條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.1小時，所得溶液經過離心分離去除不溶物後，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在1°C環境中進行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高於250kDa。(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到13wt%濃度，滴加到48孔細胞培養板中，每孔加入的量為浸沒48孔板。30°C保存12.2小時,使絲素蛋白水溶液中的水分減少，及絲素蛋白的二級結構向摺疊轉變。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白放在_20°C冰箱中冷凍2個小時，之後真空冷凍乾燥24小時，得到高強度絲素骨修復支架材料。(7)將步驟(6)中的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為75%的酒精中12個小時，此過程作用為後處理過程，目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能，及延緩支架材料在生物體內的降解速度，得到的高強度絲素骨修復支架材料的彈性壓縮模量達5Mpa以上。實施例16。(I)用醫用鉗將蜘蛛解剖後取出中部絲腺，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，即為絲腺蛋白。(2)將步驟(I)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌兩次，以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白，得到絲素蛋白膠狀物，此過程在o°c環境中進行。(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有IOmL雙蒸水的燒杯中，當解剖的家蠶數量為20條時，作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.3小時，所得溶液經過離心分離去除不溶物後，即得到絲素蛋白水溶液，此過程在0°C環境中進行。(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高於250kDa。(5 )將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到13wt%濃度，將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶 液混合均勻，滴加到48孔細胞培養板中，每孔加入的量為浸沒48孔板，20°C風乾24小時。(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中，將氯化鈉溶解到去離子水中，乾燥後得到高強度絲素骨修復支架材料，得到的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長。 雖然本發明已以實施例公開如上，但其並非用以限定本發明的保護範圍，任何熟悉該項技術的技術人員，在不脫離本發明的構思和範圍內所作的更動與潤飾，均應屬於本發明的保護 範圍。
權利要求
1.一種高強度絲素骨修復支架材料的製備方法，其特徵在於:該製備方法包括如下步驟: (1)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，可見一段清澈透明的條帶，該條帶即為絲腺蛋白； (2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸潰在雙蒸水中洗滌1-5次，以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白膠狀物； (3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，然後置於搖床上輕輕振搖0.3-4個小時得到溶液，再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液； (4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液加工製備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。
2.根據權利要求1所述的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法，其特徵在於:所述步驟(4)中，先用雙蒸水將絲素蛋白水溶液的濃度調整到lwt%-20wt%，然後滴加到細胞培養板中，在25-35°C的條件下保存8-16個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，以及絲素蛋白的二級結構向摺疊轉變，從而得到絲素蛋白；將絲素蛋白放在-30- (-10) °〇的條件下冷凍1-3個小時，再經過真空冷凍乾燥14-34個小時，從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料。
3.根據權利要求1或2所述的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法，其特徵在於:將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為65-85%的酒精中8-16個小時，此過程作為後處理過程，目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能，以及延緩高強度絲素骨修復支架材料在生物體內的降解速度。
4.根據權利要求1所述的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法，其特徵在於:所述步驟(I)中，含有絲腺蛋白的昆蟲為家蠶、野蠶或蜘蛛。
5.根據權利要求1所述的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法，其特徵在於:所述步驟(3)中，將浸有絲素蛋白膠狀物的雙蒸水置於搖床上輕輕振搖I個小時得到溶液，再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物，從而得到絲素蛋白水溶液，該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高於250kDa ;所述步驟(4)中，所述高強度絲素骨修復支架材料的彈性壓縮模量在5Mpa以上。
6.根據權利要求1所述的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法，其特徵在於:所述步驟(4)中，將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍乾燥方式或鹽析法加工製備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。
7.根據權利要求1所述的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法，其特徵在於:所述步驟(2 )和(3 )均在O V的環境中進行。
8.根據權利要求2所述的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法，其特徵在於:所述步驟(4)中，先用雙蒸水將絲素蛋白水溶液的濃度調整到lwt%-20wt%，然後滴加到48孔細胞培養板中，每孔加入的量為浸沒48孔板為準，在30°C的條件下保存12個小時，使得絲素蛋白水溶液中的水分減少，以及絲素蛋白的二級結構向摺疊轉變，從而得到絲素蛋白；將絲素蛋白放在_20°C的條件下冷凍2個小時，再經過真空冷凍乾燥24個小時，從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料。
9.根據權利要求3所述的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法，其特徵在於:將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡於體積百分比為75%的酒精中12個小時。
10.根據權利要求4所述的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法，其特徵在於:所述家蠶為五齡第7天的 家蠶幼蟲。
全文摘要
本發明涉及一種高強度絲素骨修復支架材料的製備方法。目前還沒有一種製備條件溫和，對環境無汙染的高強度絲素骨修復支架材料的製備方法。本發明的特點在於該製備方法包括如下步驟(1)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出，除去中部絲腺外部的上皮組織，得絲腺蛋白；(2)將絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌1-5次，除去可溶性的絲膠蛋白，得絲素蛋白膠狀物；(3)將絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中，雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物，置於搖床上振搖0.3-4個小時得到溶液，將溶液經離心分離以去除不溶物，得絲素蛋白水溶液；(4)將絲素蛋白水溶液加工製備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。本發明製備條件溫和，對環境無汙染。
文檔編號A61L27/22GK103223193SQ20131012295
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月10日 優先權日2013年4月10日
發明者楊明英, 帥亞俊, 周官山, 朱良均, 閔思佳 申請人:浙江大學