用於遞送活性劑的乳清蛋白質載體的製作方法

2023-07-30 19:53:56

專利名稱：用於遞送活性劑的乳清蛋白質載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及乳清蛋白質微膠粒(whey protein micelles)，並且尤其涉及其在營養學和/或化妝品領域中作為活性劑的遞送載體(delivery vehicle)的用途。

背景技術：
遞送系統為本領域已知，並且已廣泛用於例如製藥業中藥物在身體內的靶向遞送。遞送系統也經常以微囊形式用於食品加工。
在食品應用中，通過使用遞送系統可以避免所添加的營養藥和食品中的其它組分或其環境之間可能的不期望反應，並且可以控制所添加組分的釋放位置。適當應用遞送系統技術可以最大化食品，而不影響其口味、香味或質地。其可以保護敏感的食品成份，並增加強化食品的儲藏期和穩定性。
遞送系統也可以是具有遞送膳食生物活性化合物和/或化妝品試劑的潛力的關鍵技術。此外，最佳遞送系統也應當滿足根據期望應用在腸胃道、或皮膚、毛髮等內進行位點特異性遞送的需求。
為此目的，通常使用微囊化。事實上，熟知將香料和其它活性劑包囊化在食品聚合物基質中。
例如，EP 0 180 441 B1教導了使用乳清蛋白質將揮發性香料成分包囊化的用途。將水解的乳通過加熱並蒸發至40-50％固體來進行濃縮，這也導致以乳清蛋白質進行的囊化(encapsulate)。
WO 96/38055描述了將香料或活性劑包囊化在乳清蛋白質基質中，產生囊化組合物，其中所述囊化組合物導致香料或活性劑的受控釋放、並且該組合物可以摻入酵母發麵的麵團中而不對麵團的膨脹造成不利影響。
WO 2005/048998涉及胃腸道遞送系統，其中使用由蛋白質和糖製備的微囊。
然而，一般地在生產含有球狀蛋白質，特別是乳清蛋白質的產品時面臨的問題之一是它們有限的可加工性。事實上，當加熱，或者當遇到酸性或者鹼性環境或者存在鹽時，蛋白質分子傾向於失去它們天然的結構並且重組裝為各種隨機結構，例如凝膠。
在1997年10月在芝加哥舉行的第二屆國際乳清大會(SecondInternational Whey Conference)的會議錄中(International DairyFederation，1998，189-196中報導)，Britten M.討論了熱處理可以改善乳清蛋白質的功能特性。公開了在95℃製備乳清蛋白質微粒分散體的方法。
Sato等人在US 5,882,705中通過熱處理水解的乳清蛋白質溶液而獲得了乳清蛋白質微膠粒。該乳清蛋白質微膠粒的特徵為不規則形狀。
因此，已經證明現有技術中的包囊化系統在香料或類似活性劑的受控釋放方面效力較差，因為它們部分地由球狀蛋白質組成、並因此在加熱、暴露於鹽和/或遇到酸性或鹼性環境時傾向於發生結構的改變。
因此，仍然需要能夠受控釋放給定活性劑的遞送系統組合物。此外，現代食品和化妝品技術需要特別設計的產品，以便包含在遞送系統中的活性成分免於環境脅迫例如UV輻射、光、氧氣、溼度和溫度的破壞。
因此，本發明的目的在於提高乳清蛋白質作為遞送系統在廣泛的應用中的可用性。
發明概述 相應地，這個目的通過獨立權利要求的特徵來完成。從屬權利要求對本發明的中心思想作了進一步發展。
為了達到此目的，在第一個方面，提出了製備蛋白質微膠粒和活性劑的聚集體的方法，其包括第一步將乳清蛋白質微膠粒和活性劑分散在溶劑中，和第二步蒸發溶劑。
根據本發明的第二個方面，提供如下方法，所述方法包括步驟將天然的乳清蛋白質和活性劑分散在水性溶液中，將乳清蛋白質變性為乳清蛋白質微膠粒，和形成乳清蛋白質微膠粒和活性劑的聚集體。
本發明的另一方面涉及用於製備白質和活性劑的聚集體的替代方法，包括將乳清蛋白質微膠粒粉末與活性劑混合的步驟。
根據本發明的另一方面，可以通過上述任一種方法獲得的聚集體形成本發明的一部分。
根據再一方面，本發明提供包含乳清蛋白質微膠粒和與所述乳清蛋白質微膠粒結合的活性劑的聚集體。
包含這些聚集體的食品或化妝品產品也屬於本發明的一個方面。
進一步地，乳清蛋白質微膠粒作為遞送活性劑的載體的用途、及其在食品和化妝品應用中的用途構成本發明的其它方面。
最後，本發明提供用於遞送活性劑的複合物，其包含乳清蛋白質微膠粒和所述活性劑。



在下文中，通過參考在附圖中顯示的一些優選實施方案而進一步描述本發明，其中 圖1顯示證實pH和熱處理對β-乳球蛋白的微膠粒化的影響的實驗結果。
圖2顯示通過在500nm的濁度測量來確定用於商業製品(

，批號JE032-1-420)的微膠粒化的pH。
圖3為在pH7.4的乳清蛋白質微膠粒(2wt.％，WPI 95，Lactalis)的透射電子顯微鏡顯微照片。比例尺為200nm。
圖4顯示評估在恆定pH7.0下離子強度(鹽酸精氨酸)對蛋白質微膠粒形成的影響的實驗結果。
圖5顯示與未微粒化的β-乳球蛋白相比，在pH7.0以及存在60mM鹽酸精氨酸時由1wt.％ β-乳球蛋白微膠粒(Davisco)穩定的泡沫的體積穩定性(FVS)。
圖6顯示通過在pH 2-8和85℃加熱處理1wt％ β-乳球蛋白分散體15分鐘獲得的乳清蛋白質的基於強度的等效流體力學直徑(equivalenthydrodynamic diameter)。乳清蛋白質微膠粒在pH 4.25(帶正電荷，具大約+25mV的ζ電位)和pH 6.0(帶負電荷，具大約-30mV的ζ電位)獲得。微膠粒的Z-平均流體力學直徑在pH 4.25為229.3nm、在pH 6.0為227.2nm。顯示負染後通過TEM獲得的微膠粒的相應顯微照片。比例尺為1μm。
圖7高度示意性地顯示乳清蛋白質微膠粒的結構。
圖8顯示乳清蛋白質微膠粒粉末的SEM(掃描電子顯微鏡)的顯微照片，該乳清蛋白質微膠粒粉末通過在微量過濾後對蛋白質含量為20％的分散體實行噴霧乾燥而獲得。
圖9為以4％的蛋白質含量獲得的乳清蛋白質微膠粒分散體的負染TEM顯微照片。
圖10是微量過濾後以20％的蛋白質含量獲得的乳清蛋白質微膠粒分散體的負染TEM顯微照片。
圖11顯示微量過濾後以10％的蛋白質含量獲得的乳清蛋白質微膠粒分散體在pH 7.0、存在NaCl的情況下在85℃加熱15分鐘後的熱穩定性。
圖12顯示以4％的蛋白質含量獲得的乳清蛋白質分散體在pH 7.0及存在NaCl的情況下在85℃加熱15分鐘後的熱穩定性。
圖13是50℃分散於去離子水中之後基於純的乳清蛋白質微膠粒噴霧乾燥粉末的4％乳清蛋白質微膠粒分散體的負染TEM顯微照片。
圖14為通過本發明方法在pH 5.9處理4％ Prolacta 90乳清蛋白質分離物而獲得的微膠粒的大小分布圖。
圖15是在將圖8所示噴霧乾燥的粉末顆粒切開後顯示內部結構的SEM顯微照片。
圖16是在室溫分散於去離子水中之後基於純的冷凍乾燥的乳清蛋白質微膠粒粉末的4％乳清蛋白質微膠粒分散體的負染TEM顯微照片。
圖17為在pH 3.0隨著增加混合比例而被SBO(硫酸化油酸丁酯)包被的WPM的示意圖。灰色圓具表面正電荷的WPM。黑色頭部+尾部來自SBO的帶負電荷的頭部和疏水尾部。
圖18是其中添加了4％NaCl的、於蒸發之後獲得的20％乳清蛋白質微膠粒濃縮物的照片。
圖19是乳清蛋白質微膠粒粉末半薄切片在甲苯胺藍染色之後的明視野光學顯微鏡照片。比例尺是50微米。
圖20是中空乳清蛋白質微膠粒粉末顆粒切開之後的SEM顯微照片。左圖內部結構。右圖組成粉末顆粒基質的乳清蛋白質微膠粒的細節。比例尺分別是10微米和1微米。
發明詳述 根據本發明，提供了製備蛋白質和活性劑的聚集體的方法，其中所述的聚集體然後可以構成營養學和/或化妝品領域中的遞送系統。本發明的聚集體為乳清蛋白質微膠粒與活性劑結合的結果。
圖7是可以用於本發明方法的乳清蛋白質微膠粒的示意圖，其中乳清蛋白質以這樣的方式排列，即蛋白質的親水部分朝向聚集體的外部而蛋白質的疏水部分朝向微膠粒的內部「核心」。這種能量有利的構型賦予這些結構在親水環境中良好的穩定性。
此特定的微膠粒結構可以從附圖中、特別是圖3、9、10、13和15中看到，其中本發明中使用的微膠粒基本上由變性乳清蛋白質的球形聚集體組成。本發明微膠粒的特徵尤其在於其規則的球形形狀。
由於其雙重特徵(親水和疏水)，該蛋白質的此變性狀態看起來允許與疏水相(例如脂肪滴或者空氣)和親水相相互作用。因此，該乳清蛋白質微膠粒具有完美的乳化和起泡特性。
另外，可以製備微膠粒，使其具有非常銳利的大小分布(見圖14)，以便大於80％的所製備的微膠粒具有小於1微米的大小，優選具有100nm-900nm的大小，更優選具有100nm-770nm的大小，最優選具有200nm-400nm的大小。
可以使用透射電子顯微鏡(TEM)測定微膠粒的平均直徑。為此，將液態微膠粒樣品在瓊脂凝膠管中囊化。通過浸沒在於0.1M、pH 7.4二甲次砷酸鹽緩衝液中的2.5％戊二醛溶液中進行固定，並用在相同緩衝液中的2％四氧化鋨進行後固定，其中所述的兩種溶液都含有0.04％的釕紅。在梯度的乙醇系列(70、80、90、96、100％乙醇)中脫水以後，將樣品包埋在Spurr樹脂(Spurr/乙醇1:1、2:1、100％)中。在樹脂聚合(70℃，48小時)以後，用Leica ultracut UCT超薄切片機切取半薄和超薄切片。用含水的乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色超薄切片，然後用透射電子顯微鏡(PhilipsCM12，80kV)檢查。
不希望受理論的局限，但認為在微膠粒形成過程中，微膠粒將由於其總體靜電荷而排斥任何額外的蛋白質分子，導致微膠粒的大小不再能夠增大，而達到其「最大」大小。這可以解釋觀察到的狹窄的大小分布(參見圖14)。
上述微膠粒可以例如通過下文詳細公開的方法獲得。
至於可以用於製備乳清蛋白微膠粒的乳清蛋白質，可以使用任何商售的乳清蛋白質分離物或者濃縮物，即，通過本領域已知的任何乳清蛋白質製備方法獲得的乳清蛋白質以及從其製備的乳清蛋白質級分，或者可以使用蛋白質例如β-乳球蛋白(BLG)、α-乳白蛋白和血清白蛋白。特別地，下述物質可以用作乳清蛋白質，即，在乾酪生產中作為副產物獲得的甜乳清(sweet whey)、在酸性酪蛋白生產中作為副產物獲得的酸性乳清(acidwhey)、通過乳的微量過濾獲得的天然乳清、或者在酶凝酪蛋白生產中作為副產物獲得的酶凝乳清(rennet whey)。乳清蛋白質可以來自單一的來源或者來自任何來源的混合物。優選在微膠粒形成之前，乳清蛋白質不經過任何的水解步驟。因此，在微膠粒化(micellisation)之前，乳清蛋白質不接受任何的酶處理。根據本發明，重要的是在該微膠粒形成方法中使用乳清蛋白質而不是其水解物。
用於製備微膠體的乳清蛋白質來源不局限於來自牛的乳清分離物，而是涉及來自所有哺乳動物物種(例如綿羊、山羊、馬和駱駝)的乳清分離物。製備方法也可以應用於礦化的、脫礦化的或者輕微礦化的乳清製品。「輕微礦化」指除去可透析的或者可滲濾的游離礦物質之後的任何乳清製品，該乳清製品保留在例如製備乳清蛋白質濃縮物或者分離物之後通過天然礦化作用與其結合的礦物質。這些「輕微礦化」的乳清製品沒有特定的礦物質富集。
乳清蛋白質是必需胺基酸(AA)(45％)的優良來源。與酪蛋白(含有0.3g半胱氨酸/100g蛋白質)相比，甜乳清蛋白質含有多7倍的半胱氨酸，並且酸性乳清含有多10倍的半胱氨酸。半胱氨酸是穀胱甘肽(GSH)合成的限速胺基酸，其中穀胱甘肽為由穀氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，其在應激情況下在身體防禦中具有首要重要的作用。在應激情況和老年人中，對這些胺基酸的需求可能增加。此外，也已經證明，具有乳清蛋白質的穀胱甘肽口服增補劑可以增加HIV-感染患者的血漿GSH水平(Eur.J.Clin.Invest.2001；31，171-178)。
乳清蛋白質提供的其它健康益處包括在兒童、成年人或老年人中增強肌肉的發育和建設以及肌肉的維持、增強免疫功能、改善認知功能、控制血液葡萄糖，由此它們適用於糖尿病、體重控制和過飽感(satiety)、抗炎作用、傷口癒合以及皮膚修復、降低血壓等。
乳清蛋白質具有比例如酪蛋白(PER＝100)更好的蛋白質功效比(PER＝118)。PER是通過測定蛋白質在支持體重增加方面如何好而進行評估的蛋白質質量的量度。其可以通過下述公示計算 PER＝身體體重生長(g)/攝入的蛋白質重量(g)。
實例PER ％酪蛋白 酪蛋白3.2 100 雞蛋 3.8 118 乳清 3.8 118 完整大豆 2.5 78 小麥麵筋 0.3 9。
對於微膠粒化過程，乳清蛋白質可以以如下量存在於水溶液中，其中所述量為按該溶液的總重量計0.1wt.％-12wt.％，優選0.1wt.％-8wt.％，更優選0.2wt.％-7wt.％，甚至更優選0.5wt.％-6wt.％，最優選1wt.％-4wt.％。
存在於微膠粒化步驟之前的乳清蛋白質製品的水溶液也可以包含其它化合物，例如相應乳清製備方法的副產物，其它蛋白質，膠(gum)或者碳水化合物。溶液還可以含有其它食物成分(脂肪、碳水化合物、植物提取物等等)。這些其它化合物的含量優選不超過溶液總重量的50wt.％，優選20wt.％，並且更優選不超過10wt.％。
乳清蛋白質，以及其級分和/或主要蛋白質可以以純化的形式或者同樣地也可以以粗產物的形式使用。優選地，為製備乳清蛋白質微膠粒濃縮物，二價陽離子在乳清蛋白質中的含量小於2.5％，更優選小於2％，甚至更優選小於0.2％。最優選，乳清蛋白質是完全脫礦化的。
pH和離子強度是乳清蛋白質微膠化的重要因素。因此，對於實質上無或者耗盡了游離陽離子(例如Ca、K、Na、Mg)的充分透析的樣品，已經發現當在小於5.4的pH情況下實施10秒至2小時的熱處理時，獲得凝乳，然而在大於6.8的pH情況下，得到可溶性乳清蛋白質(見圖1)。因此，僅僅在這個非常狹窄的pH窗中，才可以獲得直徑小於lμm的乳清蛋白質微膠粒。這些微膠粒將具有總體負電荷。對稱地，也可以在小於等電點pH的情況下，即在pH 3.5-5.0、更優選pH 3.8-4.5的情況下，獲得相同的微膠粒形式，導致微膠粒帶正電荷(見圖6)。
因此，為了獲得帶正電荷的微膠粒，乳清蛋白質的微膠粒化可以根據該蛋白質來源的礦物質含量在調整至3.8-4.5的pH情況下在無鹽溶液中進行。
優選地，所獲得的微膠粒具有總體負電荷。因此，對於在乳清蛋白質粉末中佔0.2％-2.5％的二價陽離子含量，將pH調整至6.3-9.0的範圍。
更特別地，為了獲得帶負電荷的微膠粒，對於低二價陽離子含量(例如小於起始乳清蛋白質粉末的0.2％)，將pH調整為5.6-6.4，更優選5.8-6.0。取決於乳清蛋白質來源(濃縮物或者分離物)的礦物質含量，pH可以被升高到最多8.4。特別地，在存在大量游離礦物質的情況下，pH可以為7.5-8.4，優選7.6-8.0，以便獲得帶負電荷的微膠粒，並且在存在中等量的游離礦物質的情況下，pH可以為6.4-7.4，優選6.6-7.2，以便獲得帶負電荷的微膠粒。作為一般規律，起始乳清蛋白質粉末中鈣和/或鎂的含量越高，微膠粒化的pH也越高。
為了標準化乳清蛋白質微膠粒的形成條件，最優選通過任何已知的脫礦質化技術(透析，超濾，反向滲透，離子交換層析......)對具有如下蛋白質濃度的、任何來源的液體天然乳清蛋白質進行脫礦質化，所述蛋白質濃度介於甜乳清、乳的微量過濾透過物(permeate)或者酸性乳清(0.9％蛋白質含量)的蛋白質濃度至30％蛋白質含量的濃縮物的蛋白質濃度之間。透析可以在水(蒸餾水、去離子水或者軟水)中進行，但是由於這種方法將僅僅允許去除與乳清蛋白質弱結合的離子，故更優選在pH小於4.0的酸(有機酸或者無機酸)中進行透析，以更好地控制乳清蛋白質的離子組成。通過這樣做，乳清蛋白質微膠粒形成的pH將低於pH7.0，更優選5.8-6.6。
加熱乳清蛋白質水溶液之前，一般通過添加酸而調整pH，該酸優選是食品級的，例如鹽酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、葡糖酸或者乳酸。當礦物質含量高時，一般地通過添加鹼溶液而調整pH，該鹼溶液優選為食品級的，例如氫氧化鈉，氫氧化鉀或者氫氧化銨。
備選地，如果期望無pH調節步驟，則可以調節乳清蛋白質製品的離子強度而保持pH恆定。由此，可以以允許在7的恆定pH值的情況下進行微膠粒化的方式，通過有機或者無機離子調節離子強度。圖4顯示，通過添加70-80mM的精氨酸鹽酸改變離子強度，微膠粒可以在7.0的恆定pH值的情況下形成。
還可以向乳清蛋白質的水溶液添加緩衝劑，以避免pH值在乳清蛋白質的熱處理過程中發生實質性改變。原則上，緩衝劑可以選自任何食品級的緩衝體系，即，乙酸及其鹽、例如乙酸鈉或者乙酸鉀，磷酸及其鹽、例如NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4，或者檸檬酸及其鹽，等。
通過調節水溶液的pH和/或離子強度，可以導致可控的方法，從而產生具有100nm-900nm、優選100-700nm、最優選200-400nm的大小的微膠粒。優選地，當實施本文公開的微膠粒化方法時，具有100-700nm尺寸的微膠粒的分布大於80％(見圖14)。
優選乳清蛋白質在微膠粒形成之前不經過任何水解步驟。因此，乳清蛋白質在微膠粒化之前不接受任何酶處理。根據本發明，在微膠粒形成方法中使用乳清蛋白質而非其水解產物是重要的。
在第二個步驟中，起始乳清蛋白質水性溶液然後接受熱處理。在這個方面，已經發現，為了獲得乳清蛋白質微膠粒，重要的是具有大約70至低於95℃的溫度，優選大約82至大約89℃，更優選大約84至大約87℃，最優選大約85℃。也已經發現，在工業規模上重要的是溫度優選低於95℃，更優選為80℃-90℃，最優選大約85℃。
一旦達到期望溫度，將起始乳清蛋白質水溶液保持在此溫度最少10秒且最多2小時。優選地，將乳清蛋白質水溶液保持在該期望溫度的時間段為12-25分鐘，更優選為12-20分鐘，或者最優選為大約15分鐘。
加熱處理也可以在微波爐或者任何相似儀器中進行，從而允許以對於4wt％蛋白質溶液在1500W裝置中加熱至沸騰溫度(海拔833米為98℃)而言10s/10mL的時間/數量比，通過微波實施加熱。也可以通過圍繞玻璃管(其可以通過holding tube延長)添加8個或8個以上的磁控管而使用連續性程序，以增加孵育時間。
如圖2所示，濁度測量可以指示微膠粒的形成。通過在500nm的吸光度檢測到的濁度對於1％蛋白質溶液而言可以為至少3個吸光度單位，但是當微膠粒化的產率大於80％時，可以達到16個吸光度單位(見圖2)。
為了進一步從物理化學的角度來說明微膠粒形成的效果，將

的1wt％分散體在MilliQ水中，85℃，於pH 6.0和6.8加熱15分鐘。通過動態光散射測量在加熱處理之後獲得的聚集體的流體力學直徑。使用所謂的Debye曲線通過靜態光散射測量聚集體的表觀分子量。使用疏水ANS探針探測表面疏水性，並通過DTNB法利用半胱氨酸作為標準胺基酸探測游離的可接近的巰基。最後，通過負染TEM研究聚集體的形態。結果在表1中給出。
表1通過在有或無NaCl存在的情況下熱處理(85℃，15分鐘)1wt％蛋白質分散體而獲得的可溶性乳清蛋白質聚集體的物理化學特性 表1清楚地表明，與在相同條件、但pH為6.8下加熱的未微膠粒化的乳清蛋白質相比，在pH 6.0形成的乳清蛋白質微膠粒允許蛋白質降低其ANS比表面疏水性(specific ANS surface hydrophobicity)至1/2。此外，相比較於未微膠粒化的蛋白質的分子量0.64×106g.mol-1而言，可以在非常高的分子量27×106g.mol-1上觀察到微膠粒的形成，表明微膠粒中物質的極為濃縮的狀態(少量水)。有趣的是，微膠粒的ζ-電位甚至比未微膠粒化的蛋白質更負，即使後者在比微膠粒更加鹼性的pH形成。這是由於微膠粒有更大的親水表面暴露於溶劑的結果。最後，應當注意到，由於熱處理的pH不同，微膠粒的巰基反應性比未微膠粒化的蛋白質的巰基反應性低得多。
已經發現，當在pH調節和熱處理之前增加起始蛋白質的濃度時，將降低天然乳清蛋白質向微膠粒轉化的轉化率。例如，當以乳清蛋白質分離物Prolacta 90(批號673，來自Lactalis)起始時，乳清蛋白質微膠粒形成的產率從85％(以4％蛋白質起始)降低為50％(以12％蛋白質起始)。為了最大化乳清蛋白質微膠粒的形成(大於起始蛋白質含量的85％)，可能比較好的是開始於具有低於12％、優選低於4％的蛋白質濃度的乳清蛋白質水溶液。取決於預期的終用途，可以在熱處理之前調節蛋白質的濃度，以便達成最佳乳清蛋白質微膠粒產率。
根據上述方法可獲得的乳清蛋白質微膠粒應具有直徑小於lμm的大小，優選該直徑為100-990nm，更優選100-700nm，最優選200-400nm。
取決於所期望的應用，微膠粒的產率可以是至少50％，優選至少80％，並且殘留的可溶性聚集體或者可溶性蛋白質的含量優選低於20％。該平均微膠粒大小的表徵在於低於0.200的多分散指數。已經觀察到乳清蛋白質微膠粒可以在大約pH 4.5形成聚集體，但是在4℃至少12個小時之後，沒有宏觀相分離的跡象。
通過檢測殘留可溶性蛋白質的量，可以獲得根據本文所述方法生產的乳清蛋白質微膠粒的純度。通過在20℃以26900g離心15分鐘而除去微膠粒。上清液用於在石英小杯(1cm光路長度)中以280nm檢測蛋白質的含量。數值表示為熱處理之前的初始數值的百分數。
微膠粒的比例＝(起始蛋白質的量-可溶性蛋白質的量)/起始蛋白質的量 可以根據本文公開的方法獲得的乳清蛋白質微膠粒在形成過程中尚沒有接受過任何會導致顆粒大小減小的機械應力。本方法誘導乳清蛋白質在無剪切力的情況下在熱處理過程中自發微膠粒化。
本發明使用的乳清蛋白質微膠粒可以根據上述微膠粒化方法製備，但不局限於該方法。
根據本發明的一個實施方案，上述整個微膠粒化方法可以在天然乳清蛋白質和活性劑的分散體上進行，以便當微膠粒形成時，產生乳清蛋白質微膠粒和活性劑的聚集體。
因此，該方法包括下列步驟在水溶液中分散天然乳清蛋白質和活性劑，將乳清蛋白質變性為乳清蛋白質微膠粒，和形成乳清蛋白質微膠粒和活性劑的聚集體。微膠粒化可以根據上述方法進行。優選地，通過將天然蛋白質水溶液的pH調整至5-8的範圍、並在80℃至95℃之間的溫度、優選在低於95℃的溫度、更加優選在80℃至90℃之間、最優選在大約85℃，加熱所述溶液至少10秒來進行微膠粒化。
因此，微膠粒化之前分散體中存在的活性劑的量為0.1％-50％之間。
根據本發明的另一方法，活性劑分散在含乳清蛋白質微膠粒的溶劑中。乳清蛋白質微膠粒可以就此使用，或者可以以其濃縮物和/或粉末的形式使用。此外，乳清蛋白質微膠粒可以用乳化劑(例如磷脂)或者其它包衣劑(coating agent)(例如蛋白質、肽、蛋白水解物或者膠，例如阿拉伯樹膠)包被，以便調節乳清蛋白質微膠粒的功能性。當蛋白質用作包衣劑時，其可以選自具有比乳清蛋白質顯著更高或者更低的等電點的任何蛋白質。例如，魚精蛋白、乳鐵蛋白和一些稻蛋白質。當蛋白水解物用作包衣劑時，優選來自蛋白質例如魚精蛋白，乳鐵蛋白、稻蛋白質、酪蛋白、乳清蛋白質、小麥蛋白質、大豆蛋白質或者其混合物的水解物。優選包衣是乳化劑，其選自硫酸化油酸丁酯，單和二脂醯甘油酯的二乙醯基酒石酸酯、甘油單酯的檸檬酸酯、硬脂醯乳酸鹽及其混合物。圖17為用硫酸化油酸丁酯進行的此類包被的示意圖。另外，如本文進一步公開的，共噴霧乾燥也可以導致乳清蛋白質微膠粒的包被。
微膠粒的濃縮物可以例如通過蒸發、離心、沉降、超濾和/或微量過濾來產生。
可以通過將熱處理之後獲得的微膠粒懸浮物投入真空下溫度為50℃至85℃的蒸發器中，對微膠粒實施蒸發。通過蒸發獲得的乳清蛋白質微膠粒濃縮物傾向於具有膏樣、半固態質地(如圖18所示)，其可以用於本發明的方法。
可以在低於5，優選4.5的pH酸化乳清蛋白質微膠粒分散體後，以高加速度(大於2000g)或低加速度(小於500g)進行離心。
也可以通過酸化作用來對乳清蛋白質微膠粒分散體進行自發沉降。優選地，pH為4.5，並且沉降時間大於12小時。
備選地，可以通過微量過濾熱處理後獲得的微膠粒懸浮物來實現乳清蛋白質微膠粒的濃縮。此富集技術不僅能夠通過除去溶劑而濃縮乳清蛋白質微膠粒，而且能除去未微膠粒化的蛋白質(例如天然蛋白質或者可溶性聚集體)。因此，終產物僅僅由微膠粒組成(如可以通過透射電子顯微鏡檢測的——參見圖9和10)。在這種情況下，在透過物通過膜的初始流速降低至其初始值的20％之後，可以獲得可達到的濃縮倍數。
通過微量過濾獲得的乳清蛋白質濃縮物可以具有至少12％的蛋白質濃度。另外，該濃縮物可以含有至少50％、優選至少80％的微膠粒形式的蛋白質。
有趣的是，注意到，如果將濃縮物調整到蛋白質含量為10％，那麼其具有耐受後續在pH 7.0以及存在例如高達0.15M氯化鈉的情況下85℃熱處理15分鐘的能力(如圖11所示)。作為比較，在存在0.1M氯化鈉時，蛋白質濃度僅為4％的天然乳清蛋白質分散體(Prolacta90，批號500658，來自Lactalis)形成凝膠(參見圖12)。這證實了本發明所用乳清蛋白質微膠粒對外部因素的高穩定性。
在本發明中，微膠粒可以以液體形式(作為分散體)、或者半固體形式、或者乾燥形式的乳清蛋白質微膠粒或乳清蛋白質微膠粒濃縮物提供。乳清蛋白質微膠粒濃縮物可以就此使用，或者根據用途進行稀釋。
可以通過任何已知的技術獲得乾燥形式的微膠粒，所述技術例如噴霧乾燥、冷凍乾燥、滾筒乾燥等，可以對乳清蛋白質微膠粒或其濃縮物實施這些技術。因此，乾燥可以在添加或者不添加其它成分的情況下進行。
圖8顯示在沒有添加任何其它成分的情況下噴霧乾燥獲得的粉末，由於在噴霧乾燥過程中發生微膠粒團聚，粉末具有大於1微米的平均顆粒直徑大小。這些粉末的典型平均體積中值直徑(D43)為45-55微米，優選51微米。此類粉末的表面中值直徑(surface median diameter)(D32)優選為3-4微米，更優選為3.8微米。
噴霧乾燥之後所獲粉末的含溼量優選小於10％，更優選小於4％。
乳清蛋白質微膠粒粉末可以用於本發明。優選地，這些粉末為「純的」。「純的粉末」表示粉末包含至少90％的乳清蛋白質。所述乳清蛋白質微膠粒粉末的特徵在於非常高的流動性。這些粉末的行為表現得幾乎與液體一樣，並且呈現出易於使用和轉移的優點。這些粉末的休止角(angle of repose)優選低於35度，更加優選低於30度。這種低的休止角使得粉末可以作為流動劑用於例如化妝品應用或食品應用中。
此外，乳清蛋白質微膠粒粉末對溶劑，例如水、甘油、乙醇、油、有機溶劑等，具有高的結合量(binding capacity)。粉末對油的結合量為至少30％，對水的結合量為至少50％、優選至少90％、最優選至少100％。對於諸如甘油和乙醇的溶劑，結合量為至少50％。乳清蛋白質微膠粒粉末的這個特性使得可以用其它活性劑對粉末進行噴霧或者充填，所述活性劑選自肽、植物提取物、蛋白質水解物、生物活性劑、維生素、礦物質、藥物、化妝品組分等及其混合物。然後形成的複合物可以用作本發明的遞送劑。
乳清蛋白質微膠粒的一個重要特徵是乳清蛋白質的基本微膠粒結構在加工或於溶劑中復原(reconstitution)時得以保存。圖15顯示切片的乳清蛋白質微膠粒粉末顆粒，由此可以觀察到單個的乳清蛋白質微膠粒。此外，此微膠粒結構可以容易地在溶劑中復原。已經證明從乳清蛋白質微膠粒濃縮物獲得的粉末可以在室溫或者50℃容易地再分散於水中。相比較於初始濃縮物，該乳清蛋白質微膠粒的大小和結構被完全保留。例如，在圖13中，以20％蛋白質濃度噴霧乾燥的乳清蛋白質濃縮物在50℃以50％的蛋白質濃度重分散於去離子水中。通過TEM探測了該微膠粒的結構，該結構可以與圖10相當。獲得了相似的微膠粒形狀。通過動態光散射發現微膠粒的直徑為315nm，多分散指數為0.2。圖16也顯示冷凍乾燥的乳清蛋白質微膠粒粉末的分散體，其中微膠粒得以復原。
為了執行本發明的方法，可以使用任意形式的乳清蛋白質微膠粒、其濃縮物或其粉末。它們可以在懸浮物中、在半固體形式中、或者在乾燥形式中。因此，在第一步中，形成在溶劑中包含乳清蛋白質微膠粒和活性劑的分散體。溶劑可以是任意溶劑。例如，其可以是水、有機溶劑、乙醇、丙三醇、油等。
活性劑可以是選自以下的任何試劑維生素、礦物質、抗氧化劑、多聚-不飽和脂肪酸、肽、植物提取物、蛋白質水解物、生物活性劑、香味劑、甜味劑、糖、多糖、蔗糖、增補物、藥劑、藥物、化妝品成分、對熱、UV射線、光、氧氣、金屬、溼度、溫度等敏感的成分。活性劑可以是不穩定的化合物，例如多酚類(來自咖啡，綠茶等的)、番茄紅素和其它類胡蘿蔔素。其可以包括化合物，例如咖啡因、橙皮苷、可溶或者不可溶鹽、益生菌、著色劑、麥芽糖糊精、脂肪、乳化劑、配體等。
活性劑也可以是在食品食用和/或藥物或化妝品組合物應用時被控釋的礦物質，例如Mg2+、Fe2+、Mn2+等。
活性劑可以以單一活性劑的形式或者以活性劑的混合物的形式提供。其可以以佔聚集體總重量0.1％-50％的量提供。
活性劑可以是將添加到乳清蛋白質微膠粒在溶劑中的分散體中的乾燥形式。
備選地，活性劑可以是可以直接噴霧到乳清蛋白質微膠粒上的液體形式。液體形式可以是活性劑的實際形式，或者其可以由活性劑溶解或懸浮在液體中產生。所述液體可以與根據本發明方法用於分散乳清蛋白質微膠粒和活性劑的溶劑相同。其也可以不同。
備選地，液體形式的活性劑可以與乳清蛋白質微膠粒粉末混合。
然後對分散體溶劑進行蒸發來產生聚集體。這可以通過本領域已知的任何蒸發處理來完成。根據一個實施方案，可以通過噴霧乾燥進行蒸發，以便噴霧乾燥後的聚集體為包含與活性劑聚集的乳清蛋白質微膠粒的混合粉末形式。所獲得的混合的乳清蛋白質微膠粒聚集體包含重量比為1:1至1:1000的乳清蛋白質微膠粒和活性劑。
這種共噴霧乾燥導致由附聚(agglomerate)或者包被有額外成分的乳清蛋白質微膠粒組成的粉末。
由本發明獲得的乳清蛋白質微膠粒粉末的特徵在於主要由中空球組成但也有塌陷球的內部結構(參見圖19)。中空球結構可以容易地由在噴霧乾燥過程中在WPM濃縮物小滴中蒸汽小滴的形成來解釋。當蒸汽小滴由於溫度高於100℃而離開WPM小滴時，剩下中空球。「骨形(boneshape)」是由水自小滴的蒸發加上小滴中受到的外部壓力相結合導致的。
在接近其直徑的位置切開顆粒之後，通過SEM觀察球形中空球的內部結構(圖20，左圖)。顆粒的壁厚大約5μm，並且看起來非常光滑，而內部結構具有更為多粒狀的外觀。增加的放大倍率顯示這種多粒狀事實上是由於存在初始WPM所致的，這些初始WPM融合以形成粉末顆粒的內部基質。有趣的是，在噴霧乾燥過程中保持了微膠粒的球形形狀以及均一的顆粒大小分布(圖20，右圖)。
因此，在微觀基礎上，乳清蛋白質微膠粒粉末的特徵是中空球或者塌陷球的獨特顆粒形態，該中空球或者塌陷球含有完整和個體化(individualized)的乳清蛋白質微膠粒。
當使用乳清蛋白質微膠粒粉末時，由於這些粉末能夠一定程度地吸收溶劑而保持粉末形式，所以可以避免蒸發。因此，提供了製備乳清蛋白質微膠粒和活性劑聚集體的方法，其中活性劑與乳清蛋白質微膠粒粉末混合。優選地，粉末包含至少50％的乳清蛋白質微膠粒。
乳清蛋白質微膠粒粉末對溶劑，例如水、有機溶劑、甘油、乙醇、油類等，具有高的結合量。乳清蛋白質微膠粒粉末對油的結合量為至少30％，對水的結合量為至少50％、優選至少90％、最優選至少100％。對於諸如甘油和乙醇的溶劑，結合量為至少50％。
這提供了如下優點活性劑可以通過混合、噴灑等以液體形式添加到乳清蛋白質微膠粒粉末中、並且所得聚集體為粉末形式，無需進一步加工。
活性劑可以以0.1-50％、優選2-20％的量包括在乳清蛋白質微膠粒粉末中。因此，粉末可以作為這些活性劑的遞送載體。
由於其疏水和親水的雙重特徵，乳清蛋白質微膠粒能夠吸收疏水性以及親水性的化合物和溶劑。
本發明的聚集體由此可以包含至少一種與乳清蛋白質微膠粒結合的活性劑。這些聚集體可以為摻入至少一種活性劑的乳清蛋白質基質形式。所述乳清蛋白質基質可以為無定形的聚合物形式。
因此，本發明提供用於遞送活性劑的複合物，其包含乳清蛋白質微膠粒和所述活性劑。
聚集體可以用於期望緩釋活性成分的應用中。事實上，乳清蛋白質微膠粒表現出可以控釋活性劑的優點。此外，乳清蛋白質微膠粒可以充當可以改善活性劑的生物利用度的通用遞送載體。事實上，微膠粒可以作為脂質遞送載體用於脂溶性維生素、抗氧化劑、長鏈多不飽和脂肪酸。此外，一方面，它們可以通過釋放脂溶性抗氧化劑，賦予水溶性化合物例如兒茶精類化合物、多酚類化合物等穩定性。另一方面，它們也可以通過釋放水溶性抗氧化劑穩定脂溶性化合物，例如長鏈多不飽和脂肪酸、維生素E等。這種通用性構成了優於已知遞送系統的極大優點。
本發明聚集體的其它優點包括其調節味覺感受的能力。例如，當咖啡因作為活性劑與本發明的乳清蛋白質微膠粒結合併用於例如含有咖啡因的營養棒中時，可以降低咖啡因的苦味感。另一方面，這些聚集體可以增加鹹/甜感覺。
此外，由於存在乳清蛋白質微膠粒，本發明的聚集體也理想地適用作乳化劑、脂肪替代物、微膠粒酪蛋白的替代物或者起泡劑，因為其能夠長期地在水性系統中穩定脂肪和/或空氣。
圖5中顯示使用未微膠粒化的乳清蛋白質相比本發明的微膠粒化乳清蛋白質的泡沫穩定性。
因此，本發明的聚集體可以用作乳化劑，對於此，該材料是理想的，因為其具有中性味道，並且使用該材料時不產生異味。它們也可以用作酪蛋白微膠粒的替代物。
另外，本發明聚集體還能夠用作增白劑，以致於可以以一種化合物完成幾種任務。由於乳清是可以大量獲得的材料，其應用降低了需要乳化劑、填充劑、增白劑或者起泡劑的產品的成本。當用於營養性應用時，聚集體因此也可以對添加它們的食品的營養價值產生貢獻。
此外，乳清蛋白質微膠粒聚集體具有等價於起始乳清蛋白質的蛋白質功效比，即，至少100，優選至少110，這使其成為重要的營養成分。
因此，根據本發明任何方法獲得的聚集體可以用於製備需要穩定乳狀液或泡沫的任何類型產品，例如存在於木斯(mousse)或冰淇淋中、咖啡稀奶油(coffee creamer)中、或低脂或基本上無脂的乳製品中、或可以用作酪蛋白微膠粒替代物的地方。在化妝品應用中，這些聚集體可以用於泡沫體、髮膠、體乳、霜膏、洗髮劑等中。
此外，聚集體可以單獨使用或者與其它物質(例如多糖，例如阿拉伯樹膠或者角叉菜聚糖)聯合使用以有助於穩定基質，例如乳樣泡沫基質(milky foam matrix)。由於它們的中性味道、它們的增白力及其穩定性，這些聚集體可以用於增加脫脂奶的白度和口感。
除了針對相同的總蛋白質含量而言增加乳品系統的增白力，通過使用本發明的聚集體還可以降低食品基質中的脂肪含量。因為乳清蛋白質微膠粒聚集體可以用作脂肪替代物而同時維持期望的結構特徵、質地特徵和感官特徵，所以可以獲得更多樣的低脂產品。
因此，本發明提供了一種系統，該系統在提供和遞送活性劑的同時還提供了上述所有優點。這些效果的組合構成了優於本領域已知遞送系統的巨大優勢。此外，本發明的遞送系統可以用於營養、製藥和化妝品領域。
作為結果，本發明的聚集體可以廣泛應用。例如，可以通過使用該乳清蛋白質微膠粒聚集體，容易地製備包含活性劑的富蛋白消費品，例如，巧克力、功能營養棒(performance nutrition bars)、脫水烹調產品、口香糖等。
此外，本發明的聚集體可以包含在任何類型的食品和/或化妝品組合物和/或藥物組合物中，例如乳製品、蛋黃醬、色拉調味料、巴氏殺菌UHT奶、甜煉乳、酸奶、發酵乳、沙司、低脂沙司例如béchamel沙司、乳基發酵產品、牛奶巧克力、木斯、泡沫體、乳液、冰淇淋、發酵的基於穀物的產品、基於乳的粉末、速溶食品/飲料粉末、嬰兒配方食品、強化食品(dietfortifications)、寵物食品、片劑、糖漿劑、霜劑、軟膏劑、噴霧劑、身體護理產品、液體細菌懸浮物、幹口服增補物、溼口服增補物等。
其它應用包括皮膚護理和口腔護理，例如牙膏、口香糖或牙齦清潔劑(gum-cleaning agent)。
在本發明中，任何公開的成分列表都旨在公開所述成分以任何可能比率的任何可能組合。
下述實施例舉例說明本發明，而非對其進行限定。
實施例 本發明進一步通過參考下列詳細描述本發明微膠粒製備的實施例進行定義。在此描述和要求保護的本發明的範圍不受此處公開的這些具體實施方案的限制，這些實施方案旨在作為本發明一些方面的舉例說明。任何相當的實施方案都在本發明的範圍內。事實上，除了本文描述和公開的那些外，本領域技術人員基於前述描述將明了本發明的各種變化形式。這些變化形式也旨在落入後附權利要求的範圍內。
實施例1β-乳球蛋白的微膠粒化 從Davisco(Le Sueur，MN，USA)獲得β-乳球蛋白(批號JE002-8-922，13-12-2000)。通過超濾和離子交換層析，從甜乳清中純化該蛋白質。該粉末的組成是89.7％的蛋白質，8.85％的水分，1.36％的灰分(0.079％ Ca2+，0.013％ Mg2+，0.097％ K+，0.576％ Na+，0.050％ CI-)。使用的所有其它試劑都是分析級的試劑(Merck Darmstadt，Germany)。
通過將β-乳球蛋白溶解在

水(Millipore)中，並在20℃攪拌2小時而製備0.2％濃度的蛋白質溶液。然後通過添加HCl將等分試樣的pH調整為5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0。將溶液裝入20ml玻璃小瓶(Agilent Technologies)中，並使用含有矽/PTFE封口的鋁瓶蓋進行密封。在85℃將溶液加熱15min(達到該溫度的時間是2.30-3.00min)。熱處理之後，將樣品在冰水中冷卻到20℃。
產品的肉眼可見外觀(圖1)表明微膠粒化的最適pH是5.8。
實施例2乳清蛋白質分離物的微膠粒化 從Davisco(Le Sueur，MN，USA)獲得乳清蛋白質分離物(WPI)(

，批號JE032-1-420)。粉末的組成記錄在表2中。
通過將乳清蛋白質粉末溶解在

水(Millipore)中，並在20℃攪拌2小時而製備3.4％蛋白質的蛋白質溶液。起始pH是7.2。然後通過添加0.1N的HCl將等分試樣的pH調整為5.6、5.8、6.0、6.2、6.4和6.6。
將溶液裝入20ml玻璃小瓶(Agilent Technologies)中，並使用含有矽/PTFE封口的鋁瓶蓋進行密封。在85℃將溶液加熱15分鐘(達到該溫度的時間是2.30-2.50分鐘)。加熱之後，將樣品在冰水中冷卻到20℃。
加熱後乳清蛋白質的濁度在25℃，500nm測定，稀釋樣品以使得測量結果在0.1-3Abs單位的範圍內(Spectrophotometer Uvikon 810，Kontron Instrument)。針對3.4％的起始蛋白質濃度，計算值。
如圖2所示，一旦相同樣品在10分鐘間隔期中在500nm測定到的吸光度是穩定的(小於起始值5％的變化)，則認為達到微膠粒化作用的pH。對於此產物，微膠粒化的最適pH是6.0-6.2。對於在加熱處理之前調整的此pH，穩定的濁度是21，並且通過離心後在280nm的吸光度評估的殘留可溶蛋白質是1.9％。我們可以得出結論，即在pH 6.0，45％的起始蛋白質轉化為微膠粒。
表2WPI的組成和微膠粒化之後的樣品特徵 實施例3微膠粒的顯微鏡觀察 微膠粒的製備 通過將乳清蛋白質粉末(WPI 90批號989/2，Lactalis，Retier，France)溶解在

水(Millipore)中、並在20℃攪拌2小時來製備2％蛋白質的蛋白質溶液。然後使用0.1N的HCl或0.1N的NaOH調整等分試樣的pH。
將溶液裝入20ml玻璃小瓶(Agilent Technologies)中，並使用含有矽/PTFE封口的鋁瓶蓋進行密封。在85℃將溶液加熱15分鐘(達到該溫度的時間是2.30-2.50分鐘)。熱處理之後，將樣品在冰水中冷卻到20℃。對於該產品，微膠粒化的最適pH為7.4。
顯微鏡觀察 將液體微膠粒樣品在瓊脂凝膠管中進行囊化。通過浸沒在於0.1M、pH 7.4的二甲次砷酸鹽緩衝液中的2.5％戊二醛溶液中進行固定，並用在相同緩衝液中的2％四氧化鋨進行後固定，其中所述的兩種溶液都含有0.04％的釕紅。在梯度的乙醇系列(70、80、90、96、100％的乙醇)中脫水以後，將樣品包埋在Spurr樹脂(Spurr/乙醇1:1、2:1、100％)中。在樹脂聚合(70℃，48小時)以後，用Leica ultracut UCT超薄切片機切取半薄和超薄切片。超薄切片用含水的乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，然後用透射電子顯微鏡(Philips CM12，80kV)進行觀察。
TEM顯微照片在圖3中給出。獲得的微膠粒呈現出具200nm直徑的球形。
顆粒大小分布 測定微膠粒基於強度的大小分布，其中所述的微膠粒通過在pH4.25(帶正電荷的，具大約+25mV的ζ電位)和pH 6.0(帶負電荷的，具大約-30mV的ζ電位)、85℃加熱處理1wt％ β-乳球蛋白分散體15分鐘而獲得。微膠粒的Z-平均流體力學直徑在pH 4.25為229.3nm、在pH 6.0為227.2nm。使用動態光散射跟蹤β-LG和乳清蛋白質聚集體。使用配有633nm發射和4.0mW功率的雷射的Nanosizer ZS設備(Malvern Instruments，UK)。儀器用於反向散射配置(backscattering configuration)，其中以173°的散射角進行檢測。這使得可以顯著地減少在混濁樣品中發現的多個散射信號。將樣品置於正方形石英杯(Hellma，光路長度1cm)中。光束的光路長度由儀器根據樣品濁度(衰減(attenuation))自動設定。從散射強度的波動計算自相關函數。結果在圖6中給出。其表明，平均顆粒具有非常狹窄的多分散性指數(<0.200)的特徵。
實施例4β-乳球蛋白在恆定pH的微膠粒化 在使用2％ β-乳球蛋白水溶液的條件下，重複實施例1中所述的方法。在添加鹽酸精氨酸溶液以獲得5-200mM的最終鹽濃度以及1％的最終β-乳球蛋白濃度之後，將該溶液的pH調整為7.0。隨後進行加熱處理(80℃，10分鐘，大約2分鐘的升溫)來產生微膠粒。
結果在圖4中顯示，其清楚地表明，僅在大約50-70mM的離子強度範圍中能觀察到實質性的混濁，表明存在乳清蛋白質微膠粒。
實施例5製備增白劑 根據實施例2處理天然乳清蛋白質(WPI 95批號848，Lactalis；8wt-％水溶液)。使用配有2mm測量小杯的MacBeth CE-XTH D65 10°SCE裝置以倒反射率(trans-reflectance)模式測定所得的產物亮度(L)。所得亮度為L＝74.8，這可以與全脂牛奶的值L＝74.5相當。
實施例6製備咖啡稀奶油 將天然的乳清蛋白質(

，批號JE 032-1-420，0.5wt-％水溶液)在50℃與10wt.-％部分氫化的棕櫚油、14wt.％麥芽糖糊精(DE 21)混合，並針對該

在存在50mM磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液的情況下調整至6.0的微膠粒化pH。混合物使用Rannie勻漿器在400/50巴勻漿，並隨後在85℃加熱處理15分鐘。
所獲得的乳狀液表現出在4℃的儲存條件下超過至少一個月的高穩定性，並且給出L＝78的白度，所述白度與具有15％的脂肪含量和L＝75.9的亮度的參照液體稀奶油(Crème à Café，Emmi，Switzerland)相當。
實施例7製備含水泡沫 將天然β-乳球蛋白(Biopure，Davisco，批號JE 002-8-922，2wt-％水溶液)與120mM鹽酸精氨酸溶液混合以便最終的β-乳球蛋白濃度為1wt.％、並且鹽酸精氨酸為60mM。然後通過添加1N HCl將pH調整為7.0。然後將混合物在80℃加熱處理10分鐘以便90％的最初β-乳球蛋白轉變為具有130nm z-平均直徑的微膠粒。在這種情況中，使用Nanosizer ZS裝置(Malvern Instruments，UK)測定微膠粒的直徑。將樣品倒入石英杯，並自動記錄散射光的變化。使用cumulants法擬合所獲得的自相關函數，以便可以計算顆粒的擴散係數，並在此後用Stokes-Einstein法則計算z-平均流體力學直徑。對於這項測試，溶劑的折射指數取為1.33，並且微膠粒的為1.45。然後使用標準化的FoamscanTM(ITConcept)設備，通過將氮氣經由燒結的玻璃進行鼓泡以產生12-16μm的氣泡，使50ml體積的所得β乳球蛋白微膠粒分散體起泡，產生180cm3的泡沫體積。然後使用圖像分析在26℃跟蹤泡沫隨時間的體積穩定性，並與在相同條件但沒有鹽酸精氨酸的情況下處理β-乳球蛋白獲得的泡沫(其中未形成微膠粒)的穩定性進行比較。圖5顯示，β-乳球蛋白微膠粒的存在極大地提高了泡沫體積的穩定性。
實施例8基於乳清的發酵乳製品——發酵試驗 材料 乳清蛋白質分離物(WPI)(

)從Davisco(Le Sueur，MN，USA)獲得(蛋白質濃度92.7％)。
噴霧乾燥的乳清透過物(Variolac 836)乳糖濃度83％-礦物質8％ 乳酸50％ 可食用乳糖(Lactalis) 去離子水 方法 將

粉末溶解在去離子水中以便具有4.6％的蛋白質濃度，即，對於3升溶液，154.5g的WPI粉末和2845.5g的水。水合時間為3小時。水合之後，將該溶液分成200ml的樣品來準備不同試驗 表3 對於每個溶液，在加熱前已經添加50％的乳酸來調節pH。
樣品用雙層鍋(double boiler)加熱到85℃，並保持在該溫度15分鐘。加熱之後，將溶液冷卻至40℃，並接種保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)。將樣品在41℃蒸汽室中放置5h30，然後放置在6℃的冷室中。
結果在表4中給出。
表4 實施例9具低脂含量的乳清蛋白質強化冰淇淋(whey protein boosted icecream) 材料 蛋白質含量為90％的乳清蛋白質分離物(WPI，

，得自Lactalis，Rétiers，France) 蛋白質含量為35％的脫脂奶粉 蔗糖 麥芽糖糊精DE39 無水乳脂肪 乳化劑 去離子水 可食用鹽酸1M 方法 使用雙層夾套80L罐，在50℃以及為了避免形成泡沫而溫和攪拌的條件下，將

粉末分散在去離子水中，蛋白質濃度為9.67wt％，即將3.3kg的

分散在31.05kg的去離子水中。分散1小時之後，通過添加HCI將分散體的pH調整為微膠粒化作用的pH。將分散體的溫度升高到85℃並維持15分鐘，以便產生乳清蛋白質微膠粒。15分鐘之後，將溫度降低到50℃，並將其它的成分順序添加到微膠粒分散體中(即脫脂奶粉，麥芽糖糊精DE39，蔗糖，乳化劑和無水乳脂肪)。混合物的最終量為50kg，其具有39.5％的總固體含量以及5wt％的脂肪含量。水合作用30分鐘之後，該混合物進行兩步均質化處理(80/20bars)，並且在過夜存熟之前進行巴氏殺菌(86℃/30秒)。
第二天，使用Hoyer MF50設備，以100％的膨脹度冷凍冰淇淋混合物，並且在-20℃儲存之前在-40℃硬化。最終冰淇淋含有基於冰淇淋混合物計8wt％蛋白質(20％酪蛋白，80％乳清蛋白質)和5wt％脂肪。
實施例10通過噴霧乾燥獲得的粉末狀乳清蛋白質微膠粒 材料 蛋白質含量為90％的乳清蛋白質分離物(WPI，

得自Lactalis，Rétiers，France) 可食用乳糖 麥芽糖糊精DE39 去離子水 可食用鹽酸1M 方法 使用雙層夾套100L罐，在50℃以及為了避免形成泡沫而溫和攪拌的條件下，將

粉末分散在去離子水中，蛋白質濃度是10wt％，即，將11kg

分散在89kg去離子水中。分散1小時之後，通過添加HCl將分散體的pH調整為微膠粒化作用的pH(在此情況下是大約6.3)。將分散體的溫度升高到85℃並維持15分鐘，以便產生乳清蛋白質微膠粒。15分鐘之後，將溫度降低到50℃，並且將10wt％乳清蛋白質微膠粒分散體分為50kg的兩份。在第一個試驗中，在50℃將20kg乳糖分散在50kg的微膠粒分散體中並攪拌30分鐘。相似地，將20kg麥芽糖糊精DE39加入到剩下的50kg乳清蛋白質微膠粒分散體中。
然後使兩個混合物以15L/小時的流速進入NIRO SD6.3N塔中噴霧乾燥。進氣溫度是140℃並且出氣溫度是80℃。獲得的粉末的含水量低於5％。
在噴霧乾燥之前和之後，使用動態光散射測定在水中存在乳糖和麥芽糖糊精(DE39)時乳清蛋白質微膠粒的大小。通過在噴霧乾燥或者粉末復原之前稀釋分散體，將總蛋白質濃度設置在0.4wt％，以便乳清蛋白質微膠粒處於稀釋的粘性狀態中。使用Nanosizer ZS設備(Malvern Instruments)並且從20次測量得到微膠粒的平均直徑。
存在乳糖和麥芽糖糊精(DE39)時對乳清蛋白質微膠粒測定到的顆粒直徑分別是310.4nm和306.6nm。粉末復原之後，發現直徑分別是265.3nm和268.5nm。這些測量證實乳清蛋白質微膠粒就噴霧乾燥而言是物理穩定的。該結果被水中0.1wt％乳清蛋白質微膠粒分散體的TEM顯微術觀察結果所證實，該顯微術在pH 7及存在1％磷鎢酸的情況下利用負染進行。使用在80kV操作的Philips CM12透射電子顯微鏡。在噴霧乾燥之前和噴霧乾燥的粉末復原之後於溶液中觀察到乳清蛋白質微膠粒。沒有檢測到在形態和結構上的差異。
實施例11通過蒸發濃縮 來自Lactalis(批號500648)的乳清蛋白質分離物Prolacta 90在15℃，以4％的蛋白質濃度在軟化水中復原，達到2500kg的最終批量。通過添加1M的鹽酸而調整pH，以便終pH值為5.90。以500L/小時的流速將乳清蛋白質分散體泵壓通過板-板APV-mix換熱器。在60℃預熱，然後在85℃熱處理15分鐘。通過使用動態光散射測量顆粒大小以及在500nm測量濁度而檢測乳清蛋白質微膠粒的形成。獲得的4％乳清蛋白質微膠粒分散體的特徵是顆粒的流體力學半徑是250nm，多分散指數是0.13以及濁度是80。然後使用乳清蛋白質微膠粒分散體以500L/小時的流速進料到Scheffers蒸發器中。調整蒸發器中的溫度和真空狀態，以便產生具有20％蛋白質濃度的大約500kg乳清蛋白質微膠粒濃縮物，並冷卻到4℃。
實施例12通過微量過濾富集 來自Lactalis(批號500648)的乳清蛋白質分離物Prolacta 90在15℃，以4％的蛋白質濃度在軟化水中復原，達到2500kg的最終批量。通過添加1M的鹽酸而調整pH，以便終pH值為5.90。以500L/小時的流速將乳清蛋白質分散體泵壓通過板-板APV-mix換熱器。在60℃預熱，然後在85℃熱處理15分鐘。通過使用動態光散射測量顆粒大小以及在500nm測量濁度而檢測乳清蛋白質微膠粒的形成。獲得的4％乳清蛋白質微膠粒分散體的特徵是顆粒的流體力學半徑為260nm，多分散指數是0.07以及濁度是80。蛋白質的微膠粒形式也通過TEM進行檢測，並且可以清楚地看到具有平均直徑為150-200nm的微膠粒結構(圖9)。乳清蛋白質微膠粒分散體可以在4℃冷卻儲存，或者可以直接使用以180L/小時的流速進料到配有6.8m2 Carbosep M14膜的過濾裝置中。在這種情況下，在10-70℃實施乳清蛋白質微膠粒的濃縮直到透過物流速達到70L/小時。在這種情況下，終乳清蛋白質濃縮物含有20％的蛋白質。通過TEM檢測濃縮物中微膠粒的結構，相比較於微量過濾之前4％的乳清蛋白質分散體，清楚地沒有可見的顯著改變(圖10)。
實施例13包含至少90％乳清蛋白質的乳清蛋白質微膠粒粉末 通過微量過濾獲得的蛋白質濃度為20％的200kg乳清蛋白質微膠粒濃縮物(參見上文實施例)使用噴霧噴嘴(

，噴霧角度＝65°，壓力＝40bars)，以25kg/小時的產物流速注射入Niro SD6.3N塔中。產物的進口溫度是150℃、並且出口溫度是75℃。塔中的氣流是150m3/小時。粉末的含水量小於4％，並且粉末具有非常高的流動性的特徵。粉末的掃描電子顯微鏡術顯示了極為球形的顆粒，其具有10-100μm的表觀直徑(圖8)。
實施例14混合的乳清蛋白質微膠粒粉末 20kg乳清蛋白質微膠粒濃縮物與1.7kg具有DE39的麥芽糖糊精混合，以便使得粉末中乳清蛋白質微膠粒與麥芽糖糊精的最終比例是70/30。使用噴霧噴嘴(

，噴霧角度＝65°，壓力＝40bars)，以25kg/小時的產物流速，將該混合物注射入Niro SD6.3N塔中。產物的進口溫度是150℃、並且出口溫度是75℃。塔中的氣流是150m3/小時。粉末的含水量小於4％，並且粉末具有非常高的流動性的特徵。
當實施例13和14的粉末於水中復原時，基本上包含具有與乳清蛋白質微膠粒濃縮物一樣結構和形態的微膠粒。
實施例15通過冷凍乾燥獲得的乳清蛋白質微膠粒粉末 材料 實施例12中通過微量過濾以20％蛋白質產生的乳清蛋白質微膠粒濃縮物，其具有90％的蛋白質含量。
方法 將100g乳清蛋白質微膠粒濃縮物裝入塑料燒杯，並在-25℃冷凍一星期。然後將該燒杯放置在實驗室規模的、配備有真空泵的冷凍乾燥儀Virtis中。將樣品留置7天，直到冷凍乾燥儀中壓力保持恆定在大約30mbar。大約回收20g冷凍乾燥的乳清蛋白質微膠粒。
實施例16無蔗糖的富含乳清蛋白質的黑巧克力 材料 方法 將可可液塊與可可脂、乳脂肪、乳清蛋白質微膠粒粉末、三氯蔗糖、香蘭素和卵磷脂混合。該混合在65℃進行巧克力精煉過夜，直到獲得勻質糊狀物。然後將該巧克力塊在巧克力板中成形，並冷卻。該黑巧克力的特徵在於最終的乳清蛋白質含量為45-50％。
實施例17富含乳清蛋白質的白巧克力 材料 方法1 混合乳清蛋白質微膠粒、乳清粉末、蔗糖和香蘭素，並研磨直到獲得期望的顆粒大小分布。然後在65℃用可可脂、無水乳脂肪和卵磷脂對該混合物進行巧克力精煉處理(conche)過夜，直到獲得勻質糊狀物。然後將該巧克力塊在巧克力板中成形，並冷卻。這種白巧克力的特徵在於最終的乳清蛋白質含量為20％。
方法2 混合乳清蛋白質微膠粒、乳清粉末、蔗糖和香蘭素，並研磨直到獲得期望的顆粒大小分布。然後在65℃用可可脂、無水乳脂肪和卵磷脂對該混合物進行巧克力精煉處理過夜，直到獲得勻質糊狀物。然後將該巧克力塊在巧克力板中成形，並冷卻。這種白巧克力的特徵在於最終的乳清蛋白質含量為30％。
方法3 混合乳清蛋白質微膠粒、蔗糖和香蘭素，並研磨直到獲得期望的顆粒大小分布。然後在65℃用可可脂、無水乳脂肪和卵磷脂對該混合物進行巧克力精煉處理過夜，直到獲得勻質糊狀物。然後將該巧克力塊在巧克力板中成形，並冷卻。這種白巧克力的特徵在於最終的乳清蛋白質含量為30-35％。
實施例18以硫酸化油酸丁酯(SBO)或者任何其它帶負電荷的乳化劑包被的乳清蛋白質微膠粒的水性分散體 材料 來自實施例13的乳清蛋白質微膠粒(WPM)粉末，其具有90％的蛋白質含量 SBO 鹽酸(1M) 方法 將實施例13公開的WPM粉末分散在MilliQ水中以獲得0.1wt％的最終蛋白質濃度。將此分散體過濾通過0.45μm濾器以便除去可能的WPM聚集體。通過添加1M鹽酸而將此WPM分散體的pH降低到3.0。在pH3.0製備1wt％的SBO分散體。
使用Nanosizer ZS裝置(Malvern Instruments Ltd.)測定這些WPM的流體力學半徑和ξ電位。直徑是250nm，並且電泳遷移率為+2.5μm.cm.V-1.s-1。在pH 3.0，SBO分散體的流體力學半徑和電泳遷移率分別是4nm和-1.5/-2.0μm.cm.V-1.s-1。
進行此初步表徵之後，使用SBO分散體滴定WPM分散體，同時跟蹤該混合物的流體力學半徑和電泳遷移率的演變。發現流體力學半徑恆定在大約250-300nm，直到WPM/SBO重量-混合比例達到5:1。在此點，流體力學半徑急劇地偏離到20000nm，並且遭遇複合物WPM SBO的沉澱。一旦再添加SBO，超過混合比5:1，流體力學(半徑)進行性降低到250nm(正如開始時針對WPM觀察到的)，從比例4:1開始持平。跟蹤混合物的電泳遷移率，顯示其隨著SBO的添加而降低，在混合比例5:1時達到零值。然後，隨著SBO的添加，其繼續降低，從比例4:1開始持平在-3.0μm.cm.V-1.s-1。
對這些結果的解釋是，帶正電荷的WPM在第一步通過靜電作用被SBO的帶負電荷頭部包被，直到中和所有電荷(混合比例5:1)。在此點，SBO的疏水性尾能夠自我結合，導致具有非常大的流體力學直徑的過度聚集和複合物的沉澱。一旦再添加SBO，疏水性尾進一步結合以形成雙層包衣，從而將其帶負電荷的頭部暴露於溶劑。這導致具有雙層SBO包衣的帶負電荷的WPM(參考圖17)，相當於一個完整的蛋白質核心脂質體。
已經使用其它食品級的酸性乳化劑例如DATEM，CITREM，SSL(來自Danisco)，在pH 4.2於水性溶液中獲得相似的結果，在該pH，這些乳化劑主要離子化為以其陰離子形式(-COO-化學官能團)。
實施例19富含蛋白質的béchamel沙司 材料 來自實施例14的混合的乳清蛋白質微膠粒粉末，其具有70％的蛋白質含量 奶油 麵粉 脫脂乳 鹽 方法 在加熱下將30g混合的乳清蛋白質粉末分散在1升脫脂乳中。然後一起加入30g奶油、80g麵粉和2.85g鹽。然後煮沸混合物來產生具有大約3g/100g乳清蛋白質含量的béchamel沙司。
實施例20用於功能棒(performance bar)的富含乳清蛋白質的基料 材料 方法 將糙米糖漿在25℃與麥芽糖醇和丙三醇混合。然後加入乳清蛋白質微膠粒粉末，並混合10分鐘。然後獲得用於功能棒的富含乳清蛋白質的基料，其可以與其它成分(礦物質、維生素、香料)混合。這種製劑比乳(38％)含有更多的蛋白質。
實施例21測定噴霧乾燥的乳清蛋白質微膠粒粉末、混合的乳清蛋白質微膠粒粉末、乳清蛋白質分離物粉末以及低熱脫脂乳粉的休止角 材料 得自實施例12、具有90％蛋白質含量的乳清蛋白質微膠粒粉末(溼度3.5％) 得自實施例13、具有90％蛋白質含量的混合的乳清蛋白質微膠粒粉末(溼度3.5％) 乳清蛋白質分離物粉末Prolacta 90(批號500658，得自Lactalis，France；溼度4％) 低熱脫脂乳粉(批號334314，得自Emmi，Switzerland；溼度3.5％) 據描述可以根據ISO標準4324測定粉末休止角的測量設備 方法 將粉末放置在管莖直徑為99mm的漏鬥中，並使用攪拌器使粉末流動。粉末落到直徑100mm且高25mm的透明塑料容器上。用以下公式測定休止角Φ 休止角Φ＝ARCTAN(2h/100) 其中h為所能獲得的粉末錐形物的最大高度，其中塑料容器的所有表面都被粉末覆蓋。
休止角試驗的結果(數值為3次測量的平均值，並且給出標準差)。
休止角的結果清楚地表明，純的或者混有麥芽糖糊精的乳清蛋白質微膠粒粉末表現出顯著低於最初的乳清蛋白質粉末或者甚至脫脂乳粉的角度。低於35°的休止角是流動性非常好的粉末的特徵。
實施例22獲得綠茶抽提物遞送載體的方法 方法1 將5ml 20％的綠茶抽提物溶液倒在10g純乳清蛋白質微膠粒粉末上，然後在燒杯中劇烈攪拌。粉末吸收所有的液相。通過在烘箱中60℃乾燥18小時，除去殘留的水。最終的產物含有9％的綠茶抽提物。
方法2 將30ml綠茶的醇抽提物倒在70g純乳清微膠粒粉末上，然後攪拌。最終的產物具有非常悅目的綠色。在環境溫度蒸發乙醇。
實施例23獲得咖啡因遞送載體的方法 將10ml 2％的咖啡因倒在10g純乳清蛋白質微膠粒粉末上，然後在燒杯中劇烈攪拌。粉末吸收所有的液相。通過在烘箱中60℃乾燥18小時，除去殘留的水。最終的產物含有1.7％的咖啡因。用手碾壓該壓緊的終產物並測試。產物鬆脆，並且甚至在如此高的咖啡因含量時也感覺不到苦味。
實施例24獲得咖啡提取物遞送載體的方法 將5ml含有20％可溶性咖啡提取物的溶液倒在10g純乳清蛋白質微膠粒粉末上，然後在燒杯中劇烈攪拌。粉末吸收所有的液相。通過在烘箱中60℃乾燥18小時，除去殘留的水。最終的產物含有9％的可溶性咖啡提取物，非常鬆脆，並且具有濃鬱的咖啡味。
實施例25獲得番茄紅素遞送載體的方法 將30ml飽和的番茄紅素醇提取物倒在70g純微膠粒粉末上，然後攪拌。最終產物具有非常悅目的橙色。在環境溫度蒸發掉乙醇。
權利要求
1.製備蛋白質微膠粒和活性劑的聚集體的方法，所述方法包括步驟
-將乳清蛋白質微膠粒和活性劑分散在溶劑中，和
-蒸發溶劑。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的溶劑選自水、有機溶劑、乙醇、丙三醇和油類。
3.根據權利要求1-3中所述的方法，其中所述的活性劑在分散在溶劑中之前為乾燥形式。
4.根據權利要求1-3中所述的方法，其中所述的活性劑在分散在溶劑中之前為液體形式。
5.權利要求4的方法，其中將所述的活性劑噴到乳清蛋白質微膠粒上。
6.根據前述權利要求中任意一項所述的方法，其中蒸發通過噴霧乾燥進行。
7.製備蛋白質和活性劑的聚集體的方法，所述方法包括步驟
-將天然乳清蛋白質和活性劑分散在水性溶液中，和
-將乳清蛋白質變性為乳清蛋白質微膠粒、並形成乳清蛋白質微膠粒和活性劑的聚集體。
8.權利要求7的方法，其中所述的變性通過將水性溶液的pH調整至5-8、並在80℃至90℃的溫度加熱所述溶液至少10秒來進行。
9.製備蛋白質和活性劑的聚集體的方法，所述方法包括步驟將乳清蛋白質微膠粒粉末與活性劑混合。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述的活性劑在混合之前在溶劑中。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述的溶劑可以是水、有機溶劑、乙醇、丙三醇、油類。
12.根據權利要求9-11中任意一項所述的方法，其中所述的乳清蛋白質微膠粒粉末對溶劑具有至少30％的結合量。
13.根據權利要求9-12中任意一項所述的方法，其中所述的乳清蛋白質微膠粒粉末包含至少50％的微膠粒。
14.根據前述權利要求中任意一項所述的方法，其中所述的活性劑選自維生素、礦物質、抗氧化劑、多聚-不飽和脂肪酸、肽、植物提取物、蛋白質水解物、生物活性劑、香味劑、甜味劑、糖、多糖、蔗糖、增補物、藥劑、藥物、化妝品成分、例如來自咖啡或綠茶等的多酚類、番茄紅素、類胡蘿蔔素、咖啡因、橙皮苷、可溶或者不可溶鹽、益生菌、著色劑、麥芽糖糊精、脂肪、乳化劑、配體及它們的混合物。
15.根據前述權利要求中任意一項所述的方法，其中所述的活性劑選自對熱、UV射線、光、氧氣、金屬、溼度、溫度敏感的成分。
16.根據前述權利要求中任意一項所述的方法，其中微膠粒與活性劑的比率為1:1至1:1000。
17.根據前述權利要求中任意一項所述的方法，其中所述的聚集體包含至少一種與乳清蛋白質微膠粒結合的活性劑。
18.根據權利要求17的方法，其中所述的聚集體為具有至少一種摻入的活性劑的乳清蛋白質微膠粒基質。
19.根據權利要求18的方法，其中所述的基質為無定形聚合物。
20.根據前述權利要求中任意一項所述的方法，其中所述的活性劑以0.1-50％的量包含在聚集體中。
21.可以通過根據前述權利要求中任意一項所述的方法獲得的聚集體。
22.包含乳清蛋白質微膠粒和至少一種與乳清蛋白質微膠粒結合的活性劑的聚集體。
23.根據權利要求22的聚集體，其中所述的聚集體為具有至少一種摻入的活性劑的乳清蛋白質微膠粒基質。
24.根據權利要求23的聚集體，其中所述的基質為無定形聚合物。
25.根據權利要求21-24中任意一項所述的聚集體，其中所述的活性劑選自維生素、礦物質、抗氧化劑、多聚-不飽和脂肪酸、肽、植物提取物、蛋白質水解物、生物活性劑、香味劑、甜味劑、糖、多糖、蔗糖、增補物、藥劑、藥物、化妝品成分、例如來自咖啡或綠茶等的多酚類、番茄紅素、類胡蘿蔔素、咖啡因、橙皮苷、可溶或者不可溶鹽、益生菌、著色劑、麥芽糖糊精、脂肪、多糖例如膠等、乳化劑、配體及它們的混合物。
26.食品或者化妝品產品，其包含根據權利要求21-25中任意一項所述的聚集體。
27.乳清蛋白質微膠粒作為載體用於遞送活性劑的用途。
28.乳清蛋白質微膠粒作為脂質遞送載體的用途。
29.權利要求28的用途，其中所述的脂質選自脂溶性維生素、抗氧化劑或者長鏈多不飽和脂肪酸。
30.乳清蛋白質微膠粒作為水溶性化合物的穩定劑的用途。
31.乳清蛋白質微膠粒作為脂溶性化合物的穩定劑的用途。
32.權利要求27-31中任意一項所述的用途，用於食品或者化妝品目的。
33.遞送活性劑的複合物，其包含乳清蛋白質微膠粒和所述活性劑。
全文摘要
本發明涉及乳清蛋白質微膠粒和活性劑的聚集體、及其製備方法、尤其涉及其在營養學和/或化妝品領域中作為活性劑遞送載體的用途。
文檔編號A23L1/00GK101472484SQ200780019485
公開日2009年7月1日 申請日期2007年3月27日 優先權日2006年3月27日
發明者C·J·E·施密特, L·J·R·博韋託 申請人:雀巢產品技術援助有限公司