用於腫瘤治療和預防的致細胞病變病毒的製作方法

2023-06-28 03:18:56 2

專利名稱：用於腫瘤治療和預防的致細胞病變病毒的製作方法
技術領域：
本發明提供了重組致細胞病變病毒的組合物，其能夠在腫瘤性哺乳動物細胞中複製和/或表達晚期區基因，但在非腫瘤細胞中基本是非複製性的，提供了構建和繁殖這種重組病毒的方法、用這種重組病毒治療腫瘤疾病的方法，以及包括這種重組病毒的治療組合物。
背景正常細胞的增殖被認為由促進生長的原癌基因調節，由限制生長的腫瘤抑制基因抗衡。加強原癌基因活性的突變產生的癌基因促進腫瘤細胞生長。相反，滅活腫瘤抑制基因的遺傳病變則能使細胞擺脫這些基因造成的正常複製限制，腫瘤抑制基因的滅活一般是通過導致與失活腫瘤抑制等位基因純合的細胞的突變。通常，一個滅活的腫瘤抑制基因(如p53、RB、DCC、NF-1)聯合一個活化癌基因(即含有活化結構或調節突變的原癌基因)的形成，能產生一個基本上能夠不受限制生長的腫瘤細胞(即一個轉化細胞)。
細胞的癌基因轉化導致細胞代謝、生理和形態上的許多變化。癌基因轉化細胞的一個特徵性改變是喪失了通過細胞生長調節基因適當表達通常產生的對細胞增殖和分化加以限制的反應性。
儘管不同類型的遺傳改變可能都會導致細胞生長調節基因表達或功能的改變，但一般認為，一個正常細胞向惡性細胞的致瘤性轉化需要一個以上的事件(Land等人(1983)自然(Nature)304596；Wenberg RA(1989)癌症研究(Cancer Res)，493713)。導致大多數細胞類型惡變的確切分子途徑和繼發改變尚不清楚。據報導在許多病例中，具有可能細胞周期控制功能和/或參與功能性轉錄複合物如p53和RB形成的某些蛋白質的表達或活性改變，能導致細胞增殖控制的喪失(Ullrich等人(1992)生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)26715259；Hollstein等人(1991)科學(Science)25349；Sager R(1992)細胞生物學的現代觀點(Curr.Opin.Cell.Biol.)4155；Levine等人(1991)自然351453)。
已發現在相當多的一部分癌症中，某些癌基因具有特徵性活化突變。例如，rasH和rasK編碼區(例如，密碼子12，密碼子61；Parada等人(1984)自然312649)以及APC基因(Powell等人，(1992)自然359235)的特定突變與培養細胞的癌基因轉化有關，而且存在於相當多的特定人類癌症中(例如，結腸腺癌、膀胱癌、肺癌和腺癌、肝癌)。這些研究結果導致開發了診斷和治療試劑(例如，多核苷酸探針和抗體)，其能特異性地識別這些癌基因的活化型(美國專利4,798,787和美國專利4,762,706)。
其它癌基因，如myc、erb B-2和pim-1的過度或不適當表達，看來能促進癌基因轉化，而不必需要編碼區中活化突變的存在。erb B-2的過度表達常見於乳腺、胃和卵巢的腺癌，而這些細胞類型中的erb B-2水平可能會作為腫瘤的診斷標誌物和/或可能與特定腫瘤表型(例如，特定藥物的抗性、生長速率、分化狀態)相關聯。
含有不同癌基因(美國專利4,736,866和美國專利5,087,571)或功能破裂腫瘤抑制基因(Donehower等人(1992)自然356215)的轉基因動物，已有報導用於癌基因篩查試驗，以及其它潛在性用途。
儘管在研製轉化表型和腫瘤的更確切的分子機制模型方面取得進展，但卻幾乎沒有產生除常規化療以外的用於治療癌症的有意義療法。許多常規化療製劑的治療指數很低，其治療劑量水平等於或接近產生毒性的劑量水平。大多數常規化療製劑的毒性副作用令人不能接受，並導致危及生命的骨髓抑制，及其它副作用。
進行基因療法糾正或補充導致先天性疾病如囊性纖維化之缺損等位基因的最新方法已有嘗試，但初始成功的報導有限。某些基因治療方法包括，應用複製缺陷型重組腺病毒在體內的一種能夠表達有功能的缺損型等位基因拷貝的多核苷酸序列轉導至細胞中(Rosenfeld等人(1992)細胞(Cell)68143)。這些治療方法中，某些在將多核苷酸轉導至病人外植的分離細胞方面是有效的，但在體內卻未發現較高效驗。依賴用編碼腫瘤壞死因子(TNF)和白細胞介素-2(IL-2)的多核苷酸轉染外植腫瘤細胞的癌症療法已有報導描述(Pardoll D(1992)腫瘤學的現代觀點(Curr.Opin.Oncol)41124)。
儘管有一天也許會證明基因療法有可能適用於在體內糾正轉化細胞中癌基因或腫瘤抑制基因的缺損等位基因，但尚無報導說明目前的基因療法能夠有效地轉導並正確地定向於(例如，通過同源重組)足夠比例的腫瘤細胞，以在原位對腫瘤進行實際的基因治療。癌生物學的本質要求，為達到有效的治療作用，大量的腫瘤細胞、最好是轉化細胞的全部克隆後代都應被消除。此外，基因治療的現行方法非常昂貴，需要離體培養外植細胞，然後重新輸入病人體內。這類方法的廣泛應用，既使有效，也會因太昂貴而不可行。
因此，在本領域中需要用於腫瘤疾病診斷與治療的方法和組合物，尤其需要的方法是選擇性消除腫瘤細胞，而不伴有常規抗腫瘤化療特徵性的對非腫瘤細胞不必要的殺傷。本發明滿足了這些及其它的需要。
在此討論的參考文獻僅由於在本申請遞交日之前公開而提供。這些不應視為承認，發明者無權根據先予發明在先公開。
發明概述本發明提供了幾種通過用重組腺病毒感染腫瘤細胞而消除腫瘤細胞的新方法和組合物，這種重組腺病毒在非腫瘤細胞中基本是複製缺陷型的，在腫瘤細胞中至少顯示出部分複製表型。本發明的腺病毒構建體在腫瘤細胞和非腫瘤細胞中複製表型的差異，為基於病毒的癌症療法提供了生物學基礎。腺病毒致細胞病變作用的表達以及一種負選擇藥物基因(例如，HSVtk)的任選性表達，與用本發明的重組腺病毒構建體感染的腫瘤細胞特徵性腺病毒複製表型相關，因此將腫瘤細胞和非腫瘤細胞區分開，對腫瘤細胞產生選擇性細胞毒性。儘管詳細描述的方法具體針對腺病毒構建體，但該方法被認為可基本上應用於任何病毒類型，其中有效的複製需要一種宿主細胞蛋白質的結合和/或螯合和/或滅活，這種宿主細胞蛋白質存在於非腫瘤細胞，但在腫瘤細胞中是基本上不存在的或非功能性的(例如，p53，RB)。
為了使腺病毒在細胞內有效複製，腺病毒E1b基因產物p55與宿主細胞p53蛋白質形成一種複合物，由此螯合和/或滅活p53，並產生一種p53功能有缺陷的細胞。這種p53功能缺陷細胞能支持腺病毒複製。以這種方式，野生型腺病毒能在含p53的細胞內複製，因為腺病毒p55蛋白質滅活和/或螯合宿主細胞p53蛋白質。在本發明的一個實施方案中，一種重組腺病毒包含一個編碼突變型p55蛋白質的E1b基因座，這種突變型p55蛋白質基本上不能與所感染的細胞內的p53蛋白質形成功能性複合物，這種重組腺病毒被施用到一位個體身上或施用到包含一種能被重組腺病毒感染的腫瘤細胞的細胞群體中。該重組腺病毒基本上不能有效地螯合所感染的非腫瘤細胞內的p53蛋白質，這導致導入的重組腺病毒多核苷酸不能在非腫瘤細胞內表達複製表型。相反，缺乏功能性p53蛋白質的腫瘤細胞通過導入的重組腺病毒支持複製表型的表達，導入的重組腺病毒通過腺病毒致細胞病變作用和/或與複製表型關聯的負選擇基因的表達，導致腫瘤細胞的消除。在這些實施方案的優選變化中，重組腺病毒包含一個編碼基本上不能結合p53的突變型p55之E1b基因座，而且也可任選地缺乏一種功能性p19蛋白質(即在E1a多肽存在時不能抑制腺病毒早期區基因的表達)。本發明的重組腺病毒可進一步包含一個突變型p19基因，其增強致細胞病變作用；本領域中為人熟知的這種變型是p19cyt突變型基因。不過，在某些突變型中保留功能性p19以維持感染過程中病毒DNA的完整性，也可能是優選的。
在本發明的一個替代實施方案中，一種重組腺病毒包含一個編碼一種E1a蛋白質(例如p289R或p243R)的E1a基因座，E1a蛋白質基本上不能與所感染的細胞內的RB蛋白質形成複合物，這種重組腺病毒被施用到一位個體身上或施用到包含一種能被重組腺病毒感染的腫瘤細胞的細胞群體中。該重組腺病毒基本上不能有效地螯合感染的非腫瘤細胞內的RB蛋白質，這導致導入的重組腺病毒多核苷酸不能在非腫瘤細胞內表達複製表型。相反，缺乏功能性RB蛋白質的腫瘤細胞通過導入的重組腺病毒支持複製表型的表達，導入的重組腺病毒通過腺病毒致細胞病變作用和/或與複製表型關聯的負選擇基因的表達，導致腫瘤細胞的消除。在這些實施方案的優選變化中，重組腺病毒包含一個編碼突變型E1a蛋白質(例如，p289R)的E1a基因座，這種突變型E1a蛋白質缺乏能夠結合RB(和/或300KD多肽和/或107KD多肽)的CR1和/或CR2結構域，但包含一個能夠反式激活腺病毒早期基因的功能性CR3結構域。這些實施方案的其它變化包括，其中的重組腺病毒包含一個基本上不能表達結合併滅活RB的蛋白質的非功能性E1a基因座，而且可任選地包含一種功能性p19蛋白質(即，在缺乏E1a功能時能夠刺激腺病毒早期區基因的表達)。本發明的重組腺病毒可進一步包含一個突變型p19基因，其增強致細胞病變作用；本領域中為人熟知的這種突變型是p19 cyt突變型基因。
本發明提供的新型重組腺病毒構建體，在非腫瘤細胞中是複製缺陷型的，但在缺乏功能性p53和/或RB的腫瘤細胞中能夠表達複製表型。這些新的重組腺病毒構建體在E1a和/或E1b基因區、尤其在編碼E1bp55蛋白質和Ela p289R或p243R蛋白質的CR1和CR2結構域的序列中，包含一種突變，例如缺失或點突變。在某些實施方案中，一種負選擇基因，如HSVtk基因，被有效地連接到一個早期區(例如，E2，E1a，E1b)增強子/啟動子上、一個晚期區基因增強子/啟動子(例如，主要晚期啟動子)上、或一個具有CMV增強子的早期或晚期區啟動子上，在一個重組腺病毒構建體中還包含一種E1a或E1b突變，如此，負選擇基因在表達複製表型(即，腫瘤細胞)的感染細胞中被優勢轉錄，且通過施用一種有效劑量的負選擇劑(例如，9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤，FIAU)，得到這些細胞的負選擇。一種負選擇基因可被插入到E1a和/或E1b結構序列位置，以分別伴隨形成一種E1a(-)複製缺陷突變型、E1b(-)複製缺陷突變型、或E1a/E1b雙重突變型。
此外還提供了包含這種重組腺病毒的抗腫瘤組合物，其為藥學可接受的形式，以用於輸運至體內腫瘤細胞群體。
本發明還提供了重組乳多空病毒，如人類乳頭瘤病毒(HPV)、多瘤病毒(例如，BK，JC)和SV40，它們都缺乏結合和/或滅活p53和/或RB的功能性蛋白質。缺乏功能性E6蛋白質表達的人類乳頭瘤病毒突變型，基本上缺乏有效降解p53的能力，因此能夠在p53(-)細胞中表達複製表型，在包含足夠水平的功能性p53的細胞中卻不能。缺乏功能性E7蛋白質表達的人類乳頭瘤病毒突變型，基本上缺乏有效結合RB的能力，因此能夠在RB(-)細胞中表達複製表型，但在包含足夠水平的功能性RB的細胞中卻不能。既缺乏功能性E6蛋白質，又缺乏功能性E7蛋白質表達的人類乳頭瘤病毒突變型，基本上缺乏有效結合RB和p53的能力，因此能夠在p53(-)RB(-)細胞中表達複製表型，但在包含足夠水平的功能性RB和/或p53的細胞中卻不能。
本發明還提供了治療腫瘤性疾病的新方法，其包括將一種重組病毒施用到一位病人身上，與在非腫瘤細胞群體中相比，該重組病毒能夠在腫瘤細胞群體中優勢表達重組表型和/或表達致細胞病變效應的步驟。
附圖簡述

圖1顯示了腺病毒E1a-289R多肽的結構域結構和蛋白質-蛋白質相互作用的示意圖。
圖2顯示了質粒p019、p020和p021的結構示意圖。
定義除非另有不同定義，在此使用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬領域一般技術人員通常所理解的一樣。儘管任何與在此描述的相似或相同的任何方法和材料都可用於本發明的實施或試驗，但對優選的方法和材料予以描述。為本發明之目的，下文就以下術語予以定義。
「天然存在的」這一術語在此用於一種物體，指這種物體可在自然界中發現的事實。例如，可從自然界某一來源中分離的生物體(包括病毒)中存在的一種多肽或多核苷酸序列，且未經人類在實驗室中有意修飾，其就是天然存在的。正如在此使用的那樣，「重組」這一術語指一種多核苷酸構建體(例如，一個腺病毒基因組)是部分經人類有意修飾而產生的。
正如在此使用的那樣，「複製缺陷病毒」這一術語指一種病毒，它在預定的細胞群體(例如，基本上缺乏p53和/或RB功能的細胞)中優勢抑制細胞增殖或誘導編程性細胞死亡，且這種細胞群體支持病毒複製表型的表達，而且在包括以正常p53和RB功能水平為特徵的非複製、非轉化細胞中基本上不能抑制細胞增殖、誘導編程性細胞死亡、或表達複製表型。一般複製缺陷病毒對包含正常RB和/或p53功能的細胞，顯示其噬斑形成效率大大降低。
正如在此使用的那樣，「p53功能」這一術語指具有一種基本正常的、由p53基因編碼的多肽水平(即，相對於相同組織類型的非腫瘤細胞)的特性，其中p53多肽能夠結合野生型腺病毒2或5的E1b p55蛋白質。例如，通過一種滅活(即，突變)型p53的產生、或通過p53多肽表達的大大減少或完全喪失，可喪失p53功能。還有，在包含編碼野生型p53蛋白質之p53等位基因的腫瘤細胞中，p53功能也可能基本上缺乏；例如，p53基因座以外的遺傳改變，如導致p53亞細胞加工或定位異常的突變(例如，一種導致p53主要定位於細胞漿而不是細胞核的突變)，能導致p53功能喪失。
正如在此使用的那樣，「RB功能」這一術語指具有一種基本正常的、由RB基因編碼的多肽水平(即，相對於相同組織類型的非腫瘤細胞)的特性，其中RB多肽能夠結合野生型腺病毒2或5的E1a蛋白質。例如，通過一種滅活(即，突變)型RB的產生，或通過RB多肽表達的大大減少或完全喪失，可喪失RB功能。還有，在包含編碼野生型RB蛋白質的RB等位基因的腫瘤細胞中，RB功能也可能基本上缺乏；例如，RB基因座以外的遺傳改變，如導致RB亞細胞加工或定位異常的突變，可導致RB功能喪失。
正如在此使用的那樣，「複製表型」這一術語指被一種病毒如複製缺陷腺病毒感染的細胞之以下表型特徵中的一個或多個(1)晚期基因產物的大量表達，如衣殼蛋白(例如，腺病毒五鄰體基質多肽)或起始於病毒晚期基因啟動子的RNA轉錄物，(2)病毒基因組的複製或複製中間物的形狀，(3)病毒衣殼或包裝病毒體顆粒的裝配，(4)被感染細胞中致細胞病變效應(CPE)的出現，(5)病毒裂解周期的完成，以及(6)其它表型改變，典型的是依非腫瘤細胞中p53或RB功能的消除而定，這類非腫瘤細胞是由編碼功能性癌蛋白質的野生型有複製能力的DNA病毒感染的。一種複製表型至少包括一個所列舉的表型特徵，優選的是一個以上的表型特徵。
「抗腫瘤複製缺陷病毒」這一術語在此用來指一種重組病毒，其相對於相同組織細胞類型的感染的非複製、非腫瘤細胞來說，它具有優勢殺傷感染的腫瘤細胞的功能特性。
正如在此使用的那樣，「腫瘤細胞」和「腫瘤」是指那些顯示相對自主生長的細胞，因此它們顯示以細胞增殖控制明顯喪失為特徵的異常生長表型。腫瘤細胞包括的細胞，可以正在主動複製，或可以處於臨時非複製靜止狀態(G1或G0)；同樣腫瘤細胞可包括具有充分分化的表型、分化不良表型、或兩種類型細胞的混合。因此，在一定的時點，並非所有的腫瘤細胞都一定是複製細胞。所定義的腫瘤細胞由良性腫瘤及惡性(或顯性)腫瘤的細胞組成。顯性腫瘤細胞常被稱作癌(cancer)，通常，如果來自內胚層或外胚層組織來源的細胞，則被稱為癌(carcinoma)，或者，如果來自源於中胚層的細胞類型，則被稱為肉瘤。
正如在此使用的那樣，「有效地連接」這一術語是指多核苷酸元件以功能性關係連接。當一個核酸被放到與另一個核酸序列有功能性關係的位置上時，這個核酸就是「有效地連接」的。例如，一個啟動子或增強子如果影響編碼序列的轉錄，它就是有效地連接到這個編碼序列的。有效地連接意指，被連接的DNA序列通常是鄰接的，以及需要連接兩個蛋白質編碼區使之連續，而且符合閱讀框架。然而，因為一般當與啟動子相隔幾千個鹼基對時，增強子能發揮功能，而且內含子序列可具有不同長度，因此某些核苷酸元件雖不鄰接，但可以是有效地連接。
正如在此使用的那樣，「生理條件」是指一種液體環境，其具有完整哺乳動物細胞、或組織間隙、或活的哺乳動物的器官內條件基本相似的離子強度、pH和溫度。通常，生理條件包括一種水溶液，具有大約150mM NaCl(或任選地KCl)、pH為6.5-8.1，以及溫度大約為20-45℃。一般來說，生理條件是結合生物大分子分子間結合的適宜條件。例如，150mM NaCl。pH 7.4、37℃的生理條件一般是適宜的。發明詳述一般來說，此後使用的名稱以及下述細胞培養、分子遺傳學和分子病毒學的實驗室步驟，都是本領域中為人熟知和常用的。標準技術被用於重組核酸方法、多核苷酸合成、多肽合成、病毒原種的生產和增殖(包括能夠反式互補重組缺陷病毒原種的細胞系)、細胞培養等。一般來說，酶反應和純化步驟的進行是根據生產商的說明書。技術和步驟的進行一般根據本領域的常規方法和不同的綜合性參考文獻(一般參見Sambrook等人)。分子克隆實驗室手冊，第二版。(1989)冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；病毒學，第二版，Fields BN與Knipe DM編著，(1990)Raven出版社，紐約。在此引入作為參考)，這些參考文獻在本文中予以提供。其中的步驟被認為是本領域中周知的，予以提供以方便讀者。其中包含的全部信息在此引入作為參考。
腫瘤是一種病理狀態，其部分特徵在於具有變異基因型和表型的腫瘤細胞的產生。某些腫瘤可能包含一個缺乏RB功能，但具有正常p53功能的細胞群體；這類細胞被稱為RB(-)。某些腫瘤細胞可能缺乏p53功能、但具有RB功能；這類細胞被稱為p53(-)。某些腫瘤可能包含既缺乏p53又缺乏RB的細胞，被稱為p53(-)RB(-)。SAOS2細胞系(參見下文，參見實驗性實施例)是一個p53(-)RB(-)腫瘤細胞類型的例子。還可能有的腫瘤細胞包含基本上正常水平的p53和RB；這類具有正常p53和正常RB的細胞可能缺乏其它癌蛋白質(例如，p53和RB以外的腫瘤抑制基因產物)，這為能在這類腫瘤細胞中優勢表現複製表型的抗腫瘤病毒構建體提供了基礎。
本發明的一個基礎是，幾種感染哺乳動物細胞的DNA病毒(例如，腺病毒；乳多空病毒如BK和JC、SV40，和乳頭瘤病毒如HPV，等等)編碼病毒蛋白質，其在病毒複製周期的有效進程中是必不可少的；這些病毒蛋白質中的某一些螯合細胞蛋白質，如參與細胞周期控制和/或轉錄複合物形成的蛋白質，以此作為有效病毒複製的必需條件。當結合、螯合或降解這些細胞蛋白質的病毒蛋白質如p53和RB缺乏時，病毒複製被大大抑制。用缺乏螯合或降解p53和/或RB能力的突變型病毒感染的正常(即，非腫瘤)細胞，不能支持突變型病毒的複製，因此這類突變型病毒被認為是複製缺陷的(或複製缺損的)。然而，因為在缺乏功能性p53和RB的細胞(這類細胞被分別稱為p53(-)RB(-))中，p53或RB的螯合或降解並不是病毒複製所必需的，因此有可能的是，p53和/或RB螯合或降解有缺損的複製缺陷突變型病毒可在這種p53(-)或RB(-)細胞中表達複製表型，其程度比在具有基本正常p53和/或RB功能的細胞中要高。腫瘤細胞常常缺乏p53功能(p53(-)細胞)、RB功能(RB(-)細胞)、或此兩種功能(p53(-)RB(-)細胞)。因此，某些複製缺陷病毒突變型可能在腫瘤細胞中優勢顯示複製表型。
缺乏表達功能性RB滅活蛋白質(例如，腺病毒E1a，HPVE7蛋白質)能力的病毒突變型，將會在p53(-)細胞和RB(-)p53(-)細胞中顯示複製表型。缺乏表達功能性p53滅活蛋白質(例如，腺病毒E1bp55，HPVE6蛋白質)能力的病毒突變型，將會在p53(-)細胞和RB(-)p53(-)細胞中顯示複製表型。既缺乏表達功能性p53滅活蛋白質(例如，腺病毒E1b p55，HPVE6蛋白質)能力、又缺乏表達功能性RB滅活蛋白質(例如，腺病毒E1a，HPVE7蛋白質)能力的病毒突變型，將會在RB(-)p53(-)細胞中顯示複製表型。因此，與複製表型之表達相關的細胞毒性，可被用來作為優勢殺傷具有RB(-)、p53(-)、或RB(-)p53(-)表型的腫瘤細胞的基礎。儘管某些複製中的非腫瘤細胞在細胞周期的進行期間，可暫時顯示RB(-)表型、p53(-)表型或RB(-)p53(-)表型，本發明的病毒突變型可被用來優選地、儘管不一定是完全選擇性地，殺傷腫瘤細胞，由此構成了一種有用的抗腫瘤療法，其可單獨應用，或可與其它療法聯合應用。HPV E7多肽的37氨基端殘基的缺失(或其它滅活突變)是優選的應用於RB(-)細胞的HPV突變型，因為這些殘基對於RB結合是重要的。
儘管下面提出的方法和組合物是特別針對與複製缺陷腺病毒構建體有關的方法而描述的，但認為本發明也能與編碼螯合或促進p53蛋白質或RB蛋白質降解的癌蛋白質的其它DNA病毒一起應用，例如複製缺陷乳頭瘤病毒種類(例如，HPV16、18、23型的突變型)，其含有在E6和/或E7基因的突變，其基本上分別消除p53和/或RB的功能。除腺病毒科的成員(尤其是Mastadenovirus屬)外，認為編碼螯合和/或滅活p53或RB病毒蛋白質的乳多空病毒科成員，尤其是乳頭瘤病毒和多瘤病毒也被認為適合用於本發明的方法中。
關於腺病毒和乳多空病毒生物學的綜合性描述，在此引入作為參考的病毒學，第二版，Fields BN與Knipe DM編著，第二卷1651-1740頁，Raven出版社，紐約，紐約，可予以參考指導。以下特定描述是指但並不限於，腺病毒血清型5和腺病毒血清型2。儘管認為其它腺病毒血清型也可應用，但腺病毒5型為病毒多核苷酸的核苷酸編號常規以及E1a病毒基因區和其它病毒基因病毒編碼多肽的胺基酸編號提供了常用的參照點。腺病毒2型為E1b病毒基因區及其它病毒基因區的編號常規提供了方便的參照。認為本領域的技術人員將會很容易地識別其它腺病毒血清型的相應位置。人類乳頭瘤病毒的參照一般指與腫瘤相關的型(例如，16、18或33型)，儘管非致癌型也可應用。
E1b突變型細胞磷蛋白p53的一個功能是抑制哺動物細胞之細胞周期的進展。野生型腺病毒E1b p55蛋白質與具有p53的經感染的細胞中的p53結合，導致p53功能的基本滅活，這可能是通過以滅活形式螯合p53。功能性E1b p55蛋白質是含有功能性p53的細胞內腺病毒有效複製所必需的。因此，基本上缺乏結合p53能力的腺病毒變異株在具有正常功能性p53水平的非複製、非腫瘤細胞中是複製缺陷的。
人類腫瘤細胞對突變的(例如，替換、缺失、移碼突變)p53等位基因常常是純合的或雜合的，而且缺乏細胞周期的正常控制所必需的p53功能(Hollstein等人，(1991)科學25349；Levine等人(1991)參見前述書中，在此引入作為參考)。因此，許多腫瘤是p53(-)，或是因為它們缺乏足夠水平的p53蛋白質和/或是因為它們表達了不能發揮基本p53功能的p53突變型，而且，既使在野生型p53可能存在時，它們也可大大消弱p53功能(例如，通過抑制功能性多聚體的形成)。某些腫瘤細胞可能包含基本上編碼野生型p53蛋白質的等位基因，但可包含大大消除p53功能的第二個位點突變，例如導致p53蛋白質定位於細胞漿而不是細胞核的突變；這種第二位點突變型基本上也缺乏p53功能。
缺乏複合p53的能力、但基本上保留其它基本病毒複製功能的複製缺陷腺病毒種，被認為會在p53功能有缺陷的細胞(例如，基本上缺失p53等位基因的純合細胞，包含基本上無功能的突變型p53蛋白質的細胞)中顯示複製表型，但在非複製、非腫瘤細胞中，將基本上不會顯示複製表型。在此為了方便，將這些複製缺陷腺病毒種稱為E1b-p53(-)複製缺陷腺病毒。
包含缺乏p53功能的腫瘤細胞亞群以及包含表達基本正常p53功能的非腫瘤細胞亞群的一種細胞群體(例如，混合細胞培養物或一例人類癌症病人)，在感染條件(即，適合細胞群體腺病毒感染的條件，通常為生理條件)下，可與一種包含感染劑量的E1b-p53(-)複製缺陷腺病毒的組合物接觸。這種接觸導致該細胞群體被E1b-p53(-)複製缺陷腺病毒感染。在包含缺乏p53功能的腫瘤細胞亞群的大部分細胞中，這種感染引起複製表型的優勢表達，但在具有基本正常p53功能的非腫瘤細胞中，卻不引起複製表型的大量表達。在一個被感染的p53(-)細胞中，複製表型的表達導致細胞死亡，如通過致細胞病變效應(CPE)、細胞裂解、編程性細胞死亡等等，導致該細胞群體中腫瘤p53(-)細胞的選擇性消除。
一般地，適用於p53(-)腫瘤細胞選擇性殺傷的E1b-p53(-)複製缺陷腺病毒構建體包括有效滅活E1b p55多肽結合p53蛋白質能力的突變(例如，缺失、替換、移碼)。這種滅活性突變通常發生在p55中結合p53的區域。任選地，突變型E1b區可編碼並表達一種由E1b區殘基編碼的功能性p19蛋白質，在缺乏E1a多肽時，其在腺病毒早期基因的反式激活中是有功能的。
適用於本發明的方法和組合物的E1b-p53(-)複製缺陷腺病毒構建體包括但並不限於以下實例(1)腺病毒2型dl1520，它包括在核苷酸位置2022的C變為T突變，其在用於起始p55蛋白質翻譯的AUG密碼子的3個胺基酸下遊產生一個終止密碼子，以及包括核苷酸2496與3323之間被一個小的接頭插入取代的缺失，其在核苷酸3336處產生第二個終止密碼子；p19蛋白質的表達基本上不受影響(Barker與Berk(1987)病毒學156107，在此引入作為參考)，以及(2)一種複合腺病毒構建體，包括腺病毒2型dl 1520，後者至少包括位置2022突變和/或2496-3323或其中的一大部分缺失突變，以及p19的額外突變，產生一個p19 cyt突變型；該複合病毒構建體缺乏p55，且包含p19cyt突變的加強的致細胞病變效應。Ad2 dl 1520可從加利福尼亞州洛杉磯市加利福尼亞大學洛杉磯分校A.Berk博士處獲得，而且在文獻中有描述，包括Barker與Berk(1987)病毒學156107，在此引入作為參考。
優選的將另外的突變摻入到這類腺病毒構建體中，以抑制腫瘤細胞中感染性病毒體的形成，否則這些腫瘤細胞可能會支持E1b-p53(-)突變型的複製。在一些治療方法中這種額外的失活突變型是優選的，其中完整的病毒複製形成能夠傳播並感染鄰近細胞的感染性病毒體是不受歡迎的。這些完全滅活的突變型被稱為不能複製的E1b-p53(-)突變型。這些不能複製的突變型包括防止感染性病毒體形成的突變，既使在p53(-)RB(-)細胞內；這些突變典型的是在一種必需病毒體蛋白質或蛋白酶上的結構突變。
不過，在許多療法中，也需要突變病毒能夠複製並形成含有突變病毒基因組的感染性病毒體，其可能會傳播並感染其它細胞，由此擴大初始劑量突變病毒的抗腫瘤作用。
缺乏結合p53能力的另外的E1b(-)突變型可由本領域熟練的技術人員製備，其方式通過在編碼p55多肽的E1b基因區產生突變，表達突變型p55多肽，在液體結合條件下使突變型p55多肽接觸p53或p53的結合片段，以及鑑定不能特異結合p53的突變型E1b多肽，作為適用於本發明的候選E1b(-)突變型。
更典型的是，一種功能性試驗被用來鑑定候選E1b(-)突變型。例如，測定p53功能的Friend試驗將基本按照Frebourg等人(1992)癌症研究(Cancer Res.)526977上的描述進行，在此引入作為參考。缺乏滅活p53能力的E1b突變型將被鑑定為候選E1b(-)複製缺陷突變型。
E1a/E1b雙重突變型某些人類腫瘤細胞既缺乏p53功能又缺乏RB功能，這或是由於突變滅活，或是由於一種或兩種蛋白質種類的缺失。這類細胞被稱為p53(-)RB(-)細胞。
缺乏結合p53的能力、也缺乏結合RB的能力、但基本上保留其它基本病毒複製功能的複製缺陷腺病毒種，被認為會優勢在p53(-)RB(-)細胞中顯示一種複製表型。在此為了方便，將這種複製缺陷腺病毒種稱為E1a-RB(-)/E1b-p53(-)複製缺陷腺病毒，或簡稱為E1a/E1b雙重突變型。這些E1a/E1b雙重突變型可由本領域熟練的技術人員構建，其方法是結合至少一種在E1a區的E1a-RB(-)突變和至少一種在編碼p55E1b區中的E1b-p53(-)突變，以構成一種E1a/E1b雙重突變腺病毒。這種複製缺陷雙重突變腺病毒將在p53和RB功能均有缺陷的細胞中顯示複製表型，但在非複製、非轉化細胞，或在p53和RB功能兩者之一有缺陷、而不是兩者都有缺陷的細胞中，將基本上不會顯示複製表型。例如，Ad5 dl 434突變型(Grodzicker等人，(1980)細胞21454，在此引入作為參考)包括一個E1a基因座的缺失以及E1b基因座的部分缺失，基本上缺乏編碼功能性E1a和E1b p55蛋白質的能力。
包含缺乏p53和RB功能的腫瘤細胞亞群以及包含表達基本正常p53功能和/或RB功能的非腫瘤細胞亞群的一個細胞群體(例如，混合細胞培養物或一例人類癌症病人)，在感染條件(即適合細胞群體腺病毒感染的條件，通常為生理條件)下，可與一種包含感染劑量的複製缺陷E1a/E1b雙重突變腺病毒的組合物接觸。這種接觸導致該細胞群體被E1a/E1b雙重突變複製缺陷腺病毒感染。在包含既缺乏p53功能又缺乏RB功能的腫瘤細胞亞群的大部分細胞中，這種感染引起複製表型的優勢表達，但在具有基本正常p53的功能和/或RB功能的非腫瘤細胞中，卻不引起複製表型的大量表達在一個被感染的p53(-)RB(-)細胞中，複製表型的表達導致細胞死亡，如通過致細胞病變效應(CPE)、細胞裂解等等，導致該細胞群體中腫瘤性p53(-)RB(-)細胞的選擇性消除。
將另外的突變摻入到這類腺病毒構建體中以抑制腫瘤細胞中感染性病毒體的形成，也許是優選的，否則這些腫瘤細胞可能會支持E1a/E1b雙重突變型的複製。在一些治療方法中，完整的病毒複製形成能夠傳播並感染鄰近細胞的感染性病毒體是不期望的，在這些療法中，優選的是這些另外的滅活突變型。這些完全滅活的突變型被稱為不能複製的E1a/E1b雙重突變型。這些不能複製的突變型包括防止感染性病毒體形成的突變，既使在p53(-)RB(-)細胞內；這些突變一般是在一種必需病毒體蛋白質或蛋白酶上的結構突變。
不過，在許多療法中也需要突變病毒能夠複製並形成含有突變病毒基因組的感染性病毒體，其可能會傳播並感染其它細胞，由此擴大初始劑量突變病毒的抗腫瘤作用。
負選擇病毒構建體儘管腺病毒複製表型在感染細胞內的表達一般可通過細胞裂解、致細胞病變效應(CPE)、編程性細胞死亡或其它細胞死亡機制而與病毒誘導的細胞毒性相關，但增強將用於抗腫瘤療法的重組腺病毒的細胞毒性，可能常常是優選的。這種增強可採取在重組腺病毒內包含一個負選擇範圍的形式，典型的是將其有效地連接到一個腺病毒啟動子上，該啟動子在表達複製表型的細胞中顯示陽性轉錄調節。例如，一個HSVtk基因盒可被有效地連接到緊接一種複製缺陷腺病毒如Ad5 NT dl 1110的E3啟動子的下遊。常常需要的是，去掉腺病毒基因組的一個非必需部分(即，用於病毒複製和包裝)以容納該負選擇基因盒；由此，E3基因區很大的一部分可能被去掉，並代之以一個負選擇基因盒如一個HSVtk基因，其被有效地連接到一個E2啟動子(和增強子)或其它適當的啟動子/增強子上。另外的選擇是，可將一個負選擇基因有效地連接到一個腺病毒晚期區啟動子上，以使得該負選擇基因產物在以晚期基因啟動子轉錄為特徵的、表達複製表型的細胞中有效表達。
在一些實施方案中，當病毒複製在體內形成感染性病毒體是不期望的時，可應用不能複製的腺病毒複製缺陷構建體。這種不能複製的突變型包含Ela(-)和/或E1b(-)突變，而且包含在適當腫瘤細胞(例如p53(-)細胞、RB(-)細胞、或p53(-)RB(-)細胞)中產生複製表型所需要的全部遺傳功能，但已缺失形成感染性病毒體所需要的至少一種必需基因功能，如結構性包膜蛋白質、蛋白酶等等。另外的選擇是，病毒誘發的免疫反應可中和感染性病毒體，而限制病毒感染的擴散。除E1a和/或E1b突變外缺乏一種可互補性反式作用功能的不能複製的突變型，其在一種互補性輔助病毒或一種能夠提供缺失的反式作用功能的輔助細胞系的協同下，可得以增殖。例如，提供反式E1a和E1b功能的293細胞系(ATCC#CRL 1573；Graham等人(1997)普通病毒學雜誌(J.Gen.Virol.)3659，在此引入作為參考)可被修飾，以提供附加的反式功能-如病毒體包膜蛋白質或諸如此類，使得「不能複製的」突變型能夠增殖，以製備病毒原種。
HSVtk基因在細胞內的表達對細胞沒有直接毒性，除非該細胞接觸到一種負選擇製劑，如9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤或FIAU。表達複製表型的感染細胞(其中一個負選擇基因被大量表達)可能基本上不會產生附加的細胞毒性，直到應用有效選擇劑量的負選擇製劑(如9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤)以後，此時表達tk基因的感染細胞將被選擇性消除；因而，負選擇可被用於增強致細胞病變殺傷和/或通過殺傷具有複製表型的細胞而抑制進一步的病毒複製。此外，通過調整負選擇製劑的劑量和/或應用方案，有可能使表達負選擇基因的感染細胞群體中僅一部分被消除。通常，通過產生標準劑量-反應曲線來標定9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤的劑量，且確定可觀察到感染腫瘤細胞的消除達到所需的水平的劑量水平。有關9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤(GANC)應用於動物的資料，可從本領域中各種不同的來源獲得，包括包裝插入的人類詳細說明。當用於細胞培養物時，9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤的選擇性濃度通常在0.05mM～50mM的範圍，通常約為1mM，其中大約0.2mM用於體外應用，大約1～5mM用於體內應用(通常為，將9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤125mg/ml水溶液裝到滲透泵中，持續輸注約24小時以上)。體內應用的一個劑量方案可包括9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤的劑量為5mg/kg體重，每日兩次，靜脈給予，共7天。
負選擇基因可被插入到E1a-RB(-)複製缺陷腺病毒構建體，E1ba-p53(-)複製缺陷腺病毒構建體、E1a/E1b雙重突變複製缺陷病毒構建體或類似構建體中。一個優選的實施方案是，將一種HSVtk基因盒(Zjistra等人(1980)自然342435；Mansour等人(1988)自然336348；Johnson等人(1989)科學2451234；Adair等人(1989)美國國家科學院院報(Proc.NaH.Acad.Sci.U.SA)864574；Capecchi，M.(1989)科學2441288，在此引入作為參考)有效地連接到Ad5 NT Dl 1110的E2啟動子或一種選擇性啟動子和/或增強子上(例如，主要晚期啟動子、E1a啟動子/增強子、E1b啟動子/增強子)，帶有多腺苷酸化位點形成一個tk表達盒。該tk表達盒(或其它負選擇表達盒)被插入到腺病毒基因組中，例如，作為E3基因大量缺失的置換。其它負選擇基因和複製缺陷腺病毒構建體對本領域的技術人員來說是顯而易見的。一個負選擇基因被有效地連接到E2啟動子上被認為是一個特別優選的方案，用於將其結合到E1a(-)複製缺陷腺病毒突變型中，因為E2啟動子包含多個E2F位點，而RB(-)和p53(-)RB(-)缺乏RB功能，推測將會顯示更為有效的E2啟動子轉錄。
診斷及體外應用本發明的複製缺陷腺病毒可被用於檢測缺乏p53和/或RB功能的細胞。例如，包含缺乏p53和/或RB功能的腫瘤細胞亞群的一種細胞樣本能被適當的複製缺陷腺病毒種感染。經過適當的孵育期後，細胞樣本中表達複製表型(例如，排除臺盼藍能力的喪失、病毒體形成、3H-胸苷摻入病毒DNA的細胞可被定量，以測量細胞樣本中複製和/或腫瘤細胞的數目或比例。這類方法可用於診斷腫瘤和/或在外植細胞樣本(例如，因淋巴細胞白血病接受化療的病人淋巴細胞樣本)的基礎上評價病人在化療後的腫瘤細胞負荷。
其它診斷性應用和變化是顯而易見的；例如，一個報導基因(例如，螢光素酶β-半乳糖苷酶)可用來代替複製缺陷腺病毒中的負選擇基因；通過報導基因的表達，可對轉化細胞進行計數，(例如在一個細胞樣本或轉化試驗中)，報導基因的表達與提示細胞中缺乏p53和或RB的複製表型的表達相關聯。
治療方法通過給病人施用一種包含本發明的複製缺陷腺病毒的組合物，可提供腫瘤疾病的療法，複製缺陷腺病毒包括Ela-RB(-)複製缺陷腺病毒、Elb-p53(-)複製缺陷腺病毒、Ela/Elb雙重突變型，以及進一步包含一種負選擇基因的複製缺陷腺病毒。
包含缺乏p53和/或RB功能細胞的多種人類腫瘤可應用複製缺陷腺病毒構建體治療。例如但不限於，患有支氣管癌、鼻咽癌、喉癌、小細胞與非小細胞肺癌、肺腺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、結腸癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、或淋巴細胞白血病的病人或非人類哺乳動物，可通過施用有效抗腫瘤劑量的一種適當的複製缺陷腺病毒來治療。感染性腺病毒顆粒的混懸液可通過多種途徑應用到腫瘤組織中，包括靜脈內、腹腔內、肌肉、皮下及局部應用。每毫升含有大約103～1012或更多病毒體顆粒腺病毒混懸物可作為一種氣霧劑吸入(例如，作為肺輸運以治療支氣管癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、或喉癌)、或用藥籤將其直接敷到腫瘤部位以治療腫瘤(例如，支氣管癌、鼻咽癌、喉癌、宮頸癌)、或者可以輸注應用(例如，輸注到腹腔以治療卵巢癌、輸注到門靜脈以治療肝癌或其它非肝臟原發腫瘤的肝轉移)、或者可通過其它適當途徑，包括直接注射到瘤塊中(例如，乳腺腫瘤)、灌腸(例如，結腸癌)、或導管(例如，膀胱癌)。
侯選抗腫瘤腺病毒突變型的進一步評估，可通過其在含有缺乏p53和/或RB功能的腫瘤細胞移植物的nu/nu小鼠中減少腫瘤生成或腫癌細胞負荷的能力，並將其與含有等同腫瘤細胞移植物的非治療小鼠作比較。
可配製抗腫瘤複製缺陷腺病毒突變型用於腫瘤疾病患者的治療和診斷。
作為治療或預防應用，一種含有藥學有效劑量的一種或多種抗腫瘤複製缺陷腺病毒突變型的無菌組合物被施用到人類病人或獸醫非人類病例身上，以治療腫瘤疾病。通常，該組合物包含水性混懸液中大約103～1015或更多的腺病毒顆粒。在這種無菌組合物中常常應用一種藥學上可接受的載體或賦形劑。可應用多種水溶液，例如，水、緩衝水、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等等。這些溶液是無菌的，而且一般不含除所需腺病毒病毒體以外的顆粒物質。組合物可包含需用來接近生理條件的藥學上可接受的輔助物質，如pH調節和緩衝劑、毒性調節劑等等，例如，醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉、等等。促進細胞被腺病毒感染的賦形劑可包括在內。
複製缺陷腺病毒可由脂質體或免疫脂質體輸運到腫瘤細胞中；根據存在於腫瘤細胞群體的細胞表面特性(例如，結合免疫脂質體中免疫球蛋白的細胞表面蛋白質的存在)，這種輸運可以選擇性地定向於腫瘤細胞。一般，一種包含病毒體的水性混懸液被包裹在脂質體或免疫脂質體中。例如，一種複製缺陷腺病毒病毒體的混懸液可被包裹在微膠粒中，以通過常規方法形成免疫脂質體(美國專利5,043,164，美國專利4,957,735，美國專利4,925,661；Connor與Huang(1985)細胞生物學雜誌(J.Cell Biol)，101582；Lasic DD(1992)自然355299；新型藥物輸運(Novel Drug Delivery(編著PrescottLF與Nimmo WBWiley，紐約1989；(Reddy等人(1992)免疫學雜誌(J.Immunol).1481585；在此引入作為參考)。包含一種特異性結合個體癌細胞上癌細胞抗原(例如，CALLA，CEA)的抗體的免疫脂質體，可被用來將病毒體定嚮導入那些細胞中。
施用包含本抗腫瘤複製缺陷腺病毒或其混合物的組合物，可用於腫瘤疾病的預防和/或治療。在治療應用中，組合物被用到已患特定腫瘤疾病的病人身上，其劑量足以治癒或至少部分抑制該病及其併發症。足以達到這一目的的劑量被被為「治療有效劑量」或「效驗劑量」。這種應用的有效劑量將取決於疾病嚴重度、病人一般狀況及用藥途徑。
在預防性應用中，包含抗腫瘤複製缺陷腺病毒或其混合物的組合物，被應用到目前並不處於腫瘤疾病狀態的病人身上，以增強病人對腫瘤復發的抵抗力，或延長緩解時間。這樣的劑量被稱為「預防有效劑量」。在這方面應用的準確劑量也取決於病人的健康狀況和總體免疫水平。
以施治醫生選擇劑量水平及方式可單次或多次應用該組合物。無論如何，藥物處方應提供足量的本發明的抗腫瘤複製缺陷腺病毒，以有效地治療病人。
本發明的抗腫瘤複製缺陷腺病毒療法可聯合其他抗腫瘤方案，如常規化療和/或免疫抑制。免疫抑制的步驟將由在WO96/12406中基本上描述的步驟組成。通常，一種複製缺陷腺病毒將會單獨應用，或與一種免疫抑制劑混合應用，優選的免疫抑制化合物的實例包括環磷醯胺、環孢菌素或地塞米松。這些化合物達到所需水平的免疫抑制的劑量在本領域是公知的。例如，環磷醯胺的優選應用劑量為100～300mg/kg，而地塞米松的優選應用劑量約為2～6mg/kg。
突變腺病毒的增殖本發明的腺病毒突變型(例如，E1a-RB(-)複製缺陷腺病毒、E1b-p53(-)複製缺陷腺病毒、以及E1a-E1b雙重突變型)通常是在一種細胞系(例如，293細胞系ATCC # CRL 1573，美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD；Gracham等人(1977)普通病毒學雜誌3659)內以病毒原種增殖的，該細胞系能分別提供反式E1a功能、E1b功能，或E1a和E1b兩種功能，以支持感染性突變病毒體複製和形成。
以下實施例是通過舉例方式提供的，但並不限於此。變化以及其它實施方案對本領域的技術人員來說是顯而易見的。
實驗實施例複製缺陷重組腺病毒對缺乏p53和/或RB細胞的作用以下實驗實施例證實，將複製缺陷重組腺病毒製劑施用到缺乏p53和/或Rb功能的腫瘤細胞上，能有效地殺死腫瘤細胞。該實施例還顯示，含有p53和Rb功能的非腫瘤細胞對複製缺陷重組腺病毒製劑的殺傷具有一定的抗性。因此，以下描述的資料提供了實驗證據表明，複製缺陷重組腺病毒的應用可用來選擇性地殺傷腫瘤細胞。選擇性殺傷是通過利用突變腺病毒在腫瘤細胞中誘導複製表型但其在非腫瘤細胞中卻基本上不誘導複製表型(或相關的致細胞病變效應)的不同能力來實現的。
對照非腫瘤細胞以及代表多種腫瘤細胞類型的細胞系，接種在加DMEM(高葡萄糖)和10％胎牛血清的6孔培養皿中長至鋪成連片或接近連片，在標準培養條件下，37℃，5％CO2孵育。在密度為5×105細胞/孔下篩查細胞。被測試的腫瘤細胞有SAOS-2(ATCCHTB85)，來源於人類原發性骨肉瘤；U-20S(ATCC HTB96)，來源於人類肉瘤；HS700T(ATCC HTB 147)，來源於源自胰腺或腸道的人類轉移性腺癌；293(ATCC CRL 1573)，轉化的人胚腎；以及DLD-1(ATCC CCL 221)，來源於人類結腸腺癌。每種細胞系均可從美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD獲得。對照非腫瘤細胞係為IMR 90(ATCC CCL 186)和WI-38(ATCC CCL 75)，兩者都是二倍體人肺成纖維細胞系。
這些細胞培養物隨之用野生型腺病毒2型、以及複製缺陷重組腺病毒突變型dl 1010、dl434、和dl 1520平行感染。另外一個培養皿中接種用於計數的細胞。這些細胞與用於病毒感染的細胞來自相同的細胞混懸液。計數細胞以確定病毒蝕斑形成單位(PFU)的數目，加入細胞培養物以得到所需的感染複數(MOI)。野生型腺病毒2型與突變腺病毒被加到平行的細胞培養物中，其MOI為0.1、1.0、10和100。懸浮於PBS中的病毒被加到細胞培養孔中，體積為1ml。在接種後即刻、以及在大約1小時的吸附期中間，將接種的培養皿在37℃，5％CO2下，以X和Y軸方向震搖。1小時的吸附期過後，加入2ml加含高葡萄糖以及2％胎牛血清的DMEM，將培養物在標準培養條件下，37℃、5％CO2孵育。在感染後不同時間，用溶在20％甲醇中的0.5％結晶紫給細胞培養物染色，以測定病毒製劑殺傷細胞的功效，將死亡細胞從培養孔中洗脫分離下來，而活細胞仍保留在培養孔中，且被染料著色。結果顯示，與非腫瘤細胞相比，複製缺陷重組腺病毒製劑能夠優勢地殺死腫瘤細胞，而野生型腺病毒2型能大約同等程度地殺死腫瘤細胞和非腫瘤細胞。更為特別的是，結果顯示dl 1010突變型殺傷腫瘤細胞特別有效，dl 1520突變型和dl 434突變型也有效。在感染後4-7天，野生型腺病毒2型能夠殺死每個培養孔中的細胞，儘管功效不等且不完全，每個孔中至少有某些細胞著色。注意WI-38和SAOS-2細胞系並不是腺病毒感染的良好宿主，而且正如以下討論的那樣，IMR 90作為人二倍體成纖維細胞的另一個對照細胞系。8-12天後，dl 1010突變型能夠有效地殺死除感染抵抗型SAOS-2以外的全部腫瘤細胞系。感染後12天，Dl 1010殺死293、UZOS、HS 700T和DLD-1細胞系，但基本上不殺傷二倍體人肺成纖維細胞(WI-38)。感染後14-20，dl 1520突變型能夠有效地殺死5個腫瘤細胞系中的3個(293，HS 700T和DLD-1)，但基本上不殺傷二倍體人肺成纖維細胞(WI-38)。dl 1520是一種E1B(-)突變型，USOS細胞系不允許這種E1B(-)突變病毒複製，提示了不同的轉化細胞系對突變型重組缺損腺病毒感染的特異性，這與所預料是一樣的。感染後14-20天，dl 434突變型(一種雙重突變型EIA(-)E1B(-))能夠有效地殺死5個腫瘤細胞系中的3個(293，HS 700T和DLD-1)，但基本上不殺傷二倍體人肺成纖維細胞(WI-38)。DLD-1和UZOS細胞系對dl 434的複製顯示出部分抵抗表型。每種細胞系都單獨用PBS模擬感染，以作為存活對照。
也應用IMR 90細胞(ATCC CCL 186)和野生型及突變型腺病毒進行以下實驗。IMR 90細胞用所示病毒感染，相應的MOI為0.1、1.0、10和100。感染後第9天，用PBS衝洗細胞，用結晶紫染色。每個6孔培養皿的一個孔中接種293細胞，以作為病毒感染的陽性對照。結果顯示，IMR 90人二倍體肺成纖維細胞分別被野生型Ad2、dl1010、和dl 1520不同程度的殺傷。野生型Ad2在MOI為10或100時有效地殺死IMR 90細胞。Dl 1010在所測試的最高MOI時也不能在IMR 90細胞中複製，儘管在上面的實驗中dl 1010能殺死293、UZOS、HS700T和DLD-1腫瘤細胞系。Dl 1520病毒只在MOI為100時能夠有效地殺死IMR 90細胞；在這麼大的病毒劑量時，不能排除細胞死於病毒負荷過重而不是病毒複製的可能性。
因此，正如所預料的那樣，這些資料顯示複製缺陷重組腺病毒突變型能被用來選擇性地殺傷缺乏p53和/Rb功能的腫瘤細胞。
複製缺陷重組腺病毒的構建下文描述了ONYX-019、ONYX-020和ONYX-021的產生與測試，它們是E1B 55KD帶有缺失的改進的腺病毒株，其能選擇性地在p53缺陷細胞中複製。這些病毒株與dl 1520(此後稱為ONYX-015)作了比較，顯示在病毒CPE試驗中較ONYX-015有顯著改進。
除非另外說明，本發明在這方面的實施，將應用分子生物學、微生物學、重組DNA操作和生產、以及免疫學的常規技術，這是本領域內的技術。這些技術在文獻中有充分解釋。參見，例如，Sambrook，分子克隆；實驗室手冊，第二版(1989)；DNA克隆，第I和第II卷(DN.Glover，編著1985)；寡核苷酸合成(M.J.Gait，編著1984)；核酸雜交(B.D.Hames與S.J.Higgins，編著1984)；轉錄與翻譯(B.D.Hames與S.J.Higgins，編著，1984)；動物細胞培養(R.I.Freshney，編著1986)；固定化細胞與酶(IRL Press，1986)；B.Perbal，分子克隆實用指南(1984)；叢書，酶學方法(Academic Press，Inc)；哺乳動物細胞的基因轉移載體(J.H.Miller與M.P.Calos，編著，1987，冷泉港實驗室)，酶學方法，154和155卷(Wu與Grossman，及Wu，分別編著)，(Mayer與Walker，編著)(1987)；細胞和分子生物學的免疫組織化學方法(Academic Press，London)，Scopes，(1987)；蛋白質純化原理與實踐，第二版(Springer-Verlag，N.Y.)；以及實驗免疫學手冊，I-IV卷(D.M.Weir與C.C.Blackwell，編著1986)。在此上下方提到的所有專利、專利申請和公開文本，均在此引入作為參考。
DNA構建體核苷酸1339-3328是應用XbaI和BglII限制酶從Ad5 pXC1質粒上切割下來的，該質粒獲自加拿大安大略省多倫多市的Microbix Biosystems，Inc。pXC1含有從鹼基對22～5790的Ad5序列。核苷酸1339-3328包含E1B 55KD基因的大部分；它不包括最後的C-末端178個鹼基對。凝膠純化的DNA片段被克隆到一個修飾的Bluscript(Stratagene公司)載體(pBS Bg1 ΔHin)上；其中以Bg1II替換了Hind III位點。
自1339-3328片段的兩端以及內部構建寡核苷酸(見圖2)。寡核苷酸如下A5XBAT＝5』-CCGCTCTAGAGAATGCAATAGTAGTAC-3』 Ad51339-1361ntA5BGLB＝5』-CTCCAGATCTTCATGGTCATGTC-3』 Ad53315-3328ntE1B217B＝5』-GGGGAATTCAAAGGCCACCCTATCCTCCGTATC-3』Ad52646-2669ntE1B275T＝5』-GGGAATTCACCGATGTAAGGGTTCGGGGCTGTG-3』Ad52844-2868ntE1B300T＝5』-GGGAATTCTCAATTAAGAAATGCCTCTTTGAAAG-3』 Ad52919-2944ntE1B354T＝5』-GGGAATTCGCCTCTCAGATGCTGACCTGCTCG-3』 Ad53081-3104nt這些寡核苷酸用於PCR以產生不同的片段，命名為A、B、C和D。用凝膠純化這些片段。
以下片段對A和B、A和C、A和D分別連接到凝膠純化的pXC1的Bg1II/XbaI7.9kb片段上。在轉化入DH5α細胞後，應用寡核苷酸A5XBAT和A5BGLB通過PCR對菌落進行篩選，尋找陽性菌落。參見，美國專利5,008,182號，以及Hedrum，PCR方法和應用2167-71(1992)。
這些構建體含有編碼E1B 55KD基因中以下胺基酸缺失的DNA序列p019(pXC1-AB)由片段A和B構建胺基酸218-275缺失p020(pXC1-AC)由片段A和B構建胺基酸218-300缺失p021(pXC1-AD)由片段A和B構建胺基酸218-354缺失圖2顯示了上述片段對每個構建體的一個陽性進行DNA maxi preps(Qiagen)。對DNA進行序列分析以證實缺失。質粒p019、p020和p021存在於大腸桿菌中，保藏在美國典型培養物保藏中心，在此它們被分別稱為JN 019，JN020和JN 021。美國典型培養物保藏中心的保藏號JN 019為ATCC98286號；JN 020為ATCC 98287號；JN 021為ATCC 98288號。
病毒構建體每次用獲自Microbix的pBHGE 3質粒和p019、p020及p021質粒中的一個質粒共轉染HEK 293細胞。pBHGE 3質粒含有Ad5E1序列188-1339鹼基對的缺失，被構建帶有早期區1中的插入或突變的Ad5載體。挑選噬斑，應用寡核苷酸A5XBAT和A5BGLB對第一批噬斑進行PCR分析，以證實部分缺失的E1B 55KD基因的存在。PCR方法在本領域公知。其在核酸雜交試驗中應用探針擴增靶遺傳材料。參見，例如，美國專利號4,683,202；4,683,195；5,091,310；5,008,182和5,168,039。擴展噬斑，應用Qiagen QIAamp Blood製備病毒DNA。對缺失的上遊和下遊進行DNA序列分析以證實缺失。
免疫沉澱資料應用來自裂解C33A細胞的病毒的免疫沉澱資料顯示，ONYX-019、ONYX-020與ONYX-021病毒(對應於上述p019、p020與p021)(a)看來比ONYX-015能產生稍多一些的19KD蛋白質，使用的抗-19KD單克隆抗體獲自Oncogene Sciences；(b)產生一種55 KD蛋白質的變體，其分子量低於野生型55KD，應用的抗-55KD抗體獲自Oncogene Sciences；注意ONYX-015不產生可檢測得到的55KD；以及(c)正如所預料的那樣，與腺病毒抗體起反應，應用的抗腺病毒抗體獲自abV Immune Response。
CPE資料應用C33A的CPE試驗的資料將ONYX-015至ONYX-019、ONYX-020和ONYX-021進行了比較，資料顯示，通過產生同等CPE效應所需的MOI進行測定，新病毒株的效力比ONYX-015大約強2-10倍。
這些實驗按以上所述進行。簡言之，將野生型腺病毒2型及突變腺病毒ONYX-015至ONYX-019、ONYX-020和ONYX-021加入平行的細胞培養物中，MOI分別是0.1、1.0、10和100。將懸浮在pBS中的病毒加入細胞培養孔中，體積為1ml。在接種後即刻，以及在大約1小時的吸附期中間，將接種的培養皿在37℃，5％CO2，以X和Y軸方向震搖。1小時的吸附期過後，加入2ml含高葡萄糖以及2％胎牛血清的DMEM，將培養物在標準培養條件下，37℃5％CO2孵育。在感染後7天，為測定病毒製劑殺傷細胞功效用溶在20％甲醇中的0.5％結晶紫給細胞培養物染色，死亡細胞從培養孔中洗脫分離下來，而活細胞仍保留在培養孔中，且被染料著色。結果顯示，與非腫瘤細胞相比，複製缺陷重組腺病毒製劑ONYX-015、ONYX-019、ONYX-020和ONYX-021能夠優勢地殺死腫瘤細胞，而野生型腺病毒2型能大約以同等程度殺死腫瘤細胞和非腫瘤細胞。
結果進一步證實，通過產生同等CPE效應所需的MOI進行測定，在殺傷C33A細胞方面，ONYX-019、ONYX-020和ONYX-021的效力比ONYX-015約強2-10倍。實驗中MOI的範圍是10、1.0、0.1和0.01，ONYX-019、ONYX-020和ONYX-021在MOI為0.1-0.01時顯示增強的殺傷作用。
複製缺陷重組腺病毒和化學療法對腫瘤細胞殺傷的作用然後我們研究了ONYX-015(dl1520)靜脈(IV)單獨應用及聯合應用化學療法的功效。將人類腫瘤異種移植物(結腸、宮頸)植於裸鼠皮下，生長到5-7mm大小時，將109總pfu分次劑量(1-5天)IV注射。化學療法組的小鼠在第5天經腹腔(IP)注射接受最大可耐受劑量的5-Fu或順鉑。對照組以同樣方式接受IV和IP載體注射。IV注射後觀察到腫瘤內病毒複製。順鉑和5Fu沒有顯著改善存活或者抑制腫瘤生長，而單獨用ONYX-015即顯著抑制腫瘤生長(40％-60％)，並改善存活(p＝0.05)。用ONYX-015和5-Fu(或順鉑)的聯合療法與任一單獨的製劑相比均顯著改善存活。因此，ONYX-015當IV施用時具有選擇性抗腫瘤活性，化學療法能提高這種活性。
儘管本發明為了便於明確理解而通過舉例方式在某些方面做了詳細描述，但顯然，在權利要求的範圍內進行一定變化和修飾是可行的。
權利要求
1.一種消除細胞群體中的腫瘤細胞的方法，包括以下步驟(1)一種缺乏能夠結合功能性腫瘤抑制基因產物的表達病毒癌蛋白質的重組複製缺陷腺病毒，該腺病毒具有一種選自Onyx019、Onyx020或Onyx021的腺病毒的特性，在感染條件下使這種腺病毒接觸(2)一種細胞群體，其包含有能與病毒癌蛋白質形成結合複合物的功能性腫瘤抑制基因產物的非腫瘤細胞，以及缺乏該功能性腫瘤抑制基因產物的腫瘤細胞，籍此產生一種感染的細胞群體。
2.根據權利要求1的方法，其中病毒癌蛋白質是一種腺病毒E1b多肽。
3.根據權利要求1的方法，其中腫瘤抑制基因產物是p53。
4.根據權利要求1的方法，其中腫瘤細胞是p53(-)。
5.根據權利要求4的方法，其中重組複製缺陷腺病毒不編碼能夠結合p53的E1bp55多肽。
6.根據權利要求1的方法，其中重組複製缺陷腺病毒選自ONYX019、ONYX020或ONYX021。
7.根據權利要求1的方法，其中所述的包括腫瘤細胞和非腫瘤細胞的細胞群體存在於一種哺乳動物中，且所述的接觸步驟是通過將重組複製缺陷腺病毒施用到個體而在體內進行的。
8.根據權利要求7的方法，其中哺乳動物是人。
9.根據權利要求1的方法，其中重組複製缺陷腺病毒能在缺乏p53功能的腫瘤細胞中複製以形成感染性病毒體。
10.根據權利要求9的方法，其中在腫瘤細胞中形成的感染性病毒體能夠在病人體內播散並感染鄰近細胞。
11.根據權利要求1的方法，其中重組複製缺陷腺病毒在人類患者的腫瘤細胞中不能複製形成感染性病毒體。
12.根據權利要求1的方法，其中重組複製缺陷腺病毒進一步包括一種E1a中的遺傳改變，其阻止與腫瘤抑制物Rb的結合。
13.一種治療人類腫瘤疾病的方法，其包括將一種組合物應用到患有包含缺乏功能性腫瘤抑制基因產物的腫瘤細胞的人類腫瘤患者身上，該組合物中包含一種治療有效劑量的重組複製缺陷腺病毒，其具有選自Onyx019、Onyx020或Onyx021的腺病毒之特性。
14.根據權利要求13的方法，其中腫瘤抑制基因產物是p53。
15.根據權利要求13的方法，其中包含重組複製缺陷腺病毒的組合物還包括該複製缺陷腺病毒E1a區的遺傳改變。
16.根據權利要求15的方法，其中該複製缺陷腺病毒E1a區的遺傳改變基本上阻止與RB腫瘤抑制基因產物的結合。
17.根據權利要求16的方法，其中該腫瘤包含缺乏腫瘤抑制物RB、或缺乏腫瘤抑制物p53，或這兩種腫瘤抑制物都缺乏的腫瘤細胞。
18.根據權利要求13或15的方法，其中包含重組複製缺陷腺病毒的組合物還包括一種有效地連接的負選擇基因。
19.根據權利要求18的方法，其中該病毒選自Onyx019、Onyx020或Onyx021。
20.一種用於腫瘤疾病治療的抗腫瘤組合物，其包含一種藥學上可輸運形式的、治療有效劑量的重組複製缺陷腺病毒，其具有選自Onyx019、Onyx020或Onyx021的腺病毒之特性。
21.一種重組質粒JN019，其保藏在美國典型培養物保藏中心，保藏號為98286。
22.一種重組質粒JN020，其保藏在美國典型培養物保藏中心，保藏號為98287。
23.一種重組質料JN021，其保藏在美國典型培養物保藏中心，保藏號為98288。
24.一種複製缺陷腺病毒，其具有選自Onyx019、Onyx020或Onyx021的腺病毒之特性。
25.一種複製缺陷腺病毒Onyx019。
26.一種複製缺陷腺病毒Onyx020。
27.一種複製缺陷腺病毒Onyx021。
28.一種存在於重組質粒JN019的經分離的核酸序列，該質粒保藏在ATCC，保藏號為98286，該核酸序列包含腺病毒E1B區的缺失，該缺失編碼胺基酸218-275。
29.一種存在於重組質粒JN020的經分離的核酸序列，該質粒保藏在ATCC，保藏號為98287，該核酸序列包含腺病毒E1B區的缺失，該缺失編碼胺基酸218-300。
30.一種存在於重組質粒JN021的經分離的核酸序列，該質粒保藏在ATCC，保藏號為98288，該核酸序列包含腺病毒E1B區的缺失，該缺失編碼胺基酸218-354。
31.根據權利要求1或12的方法，其還包括將該腫瘤細胞接觸一種免疫抑制或化學治療化合物。
32.一種組合物，其包括一種選自Onyx019、Onyx020或Onyx021的重組複製缺陷腺病毒，以及一種化學治療化合物。
33.一種組合物，它包括一種具有選自Onyx019、Onyx020或Onyx021的腺病毒之特性的重組複製缺陷腺病毒以及一種化學治療化合物。
34.一種組合物，它包括一種選自Onyx019、Onyx020或Onyx021的重組複製缺陷腺病毒，以及一種免疫抑制化合物。
35.一種組合物，它包括一種具有選自Onyx019、Onyx020或Onyx021的腺病毒之特性的重組複製缺陷腺病毒以及一種免疫抑制化合物。
36.一種宿主細胞，它包含一種選自JN019、JN020和JN021的質粒。
全文摘要
提供了基於病毒療法的治療腫瘤疾病的方法和組合物。缺乏結合和/或滅活p53或RB病毒蛋白質的突變型病毒被施用到腫瘤病人身上,該腫瘤包含缺乏p53和/或RB功能的細胞。該突變型病毒在具有基本正常p53和/或RB功能的非複製、非腫瘤細胞中,能夠基本上產生一種複製表型。腫瘤細胞中複製表型的優勢產生,導致腫瘤細胞的優選殺傷,其方式或是直接殺傷或是通過在表達病毒複製表型的細胞中細胞毒性基因的表達。
文檔編號C12N15/86GK1242051SQ9718108
公開日2000年1月19日 申請日期1997年12月10日 優先權日1997年12月10日 公開號97181081.8
發明者J·R·比斯肖夫, J·奈, N·勒裡亞, S·霍恩, A·威廉斯, D·柯恩 申請人:昂尼克斯藥物公司 被以下專利引用 (1),