動物攝食習性的測定方法

2023-07-30 11:27:21

專利名稱：：動物攝食習性的測定方法動物攝食習性的測定方法發明領域避難所區域可包4舌未處理目標作物部分(即結構性避難所(structuredrefUge))或害蟲的其它合適作物部分和雜草宿主部分(即替代性宿主避難所(alternativehostreflige)或天然避難所(naturalrefuge))。在評價可為能夠在多種宿主植物上發育的害蟲所利用的避難所時，需要若干評價方法，來"i平價存在於不同潛在宿主上的部分昆蟲種群。本發明還提供一種測定採食期的昆蟲是否攝食過菸草植物的方法。該方法包括測定成蟲體內脂肪酸特徵中C16:0和C18:3的相對含量。0014]本發明還提供一種測定採食期的昆蟲是否攝食過大豆植物的方法。該方法包括測定成蟲體內脂肪酸特徵中C16:0、C18:l、C18:2和C18:3的相對含量。圖3柱狀圖表示才艮據實施例1測定，菸草植物飼養的蛾的脂肪酸特徵。在一些實施方案中，一種脂肪酸的存在可確定動物是否攝食過目標植物。在另一些實施方案中，兩種或更多種脂肪酸的組合可確定動物是否攝食過月標植物。在又一些實施方案中，脂肪酸特徵可確定動物是否攝食過目標植物。脂肪酸特徵可以是一種或多種脂肪酸相對於所測總脂肪酸的任何比率。在一個具體實施方案中，所設計的本發明方法為測定動物的攝食特性提供了一種高通量方法。該方法一般包括從大量動物中採集組織樣品，將樣品加到多孔板的各孔中。然後篩選多孔板中各樣品存在的目標植物的至少一種指示物，或者測定上述組織樣品的脂肪酸特徵。0051本文所述用於跟蹤動物攝食習性或攝食史的方法和構思具有多種用途。在具體實施方案中，本文所述篩選方法可以用來確定相對於轉基因作物的天然避難所區域的害蟲。這種方法包括從轉基因作物附近誘捕害蟲；篩選誘;t甫害蟲存在的至少一種目標植物的一種或多種指示物；測定攝食轉基因作物以外植物的害蟲種群百分比。或者另外，該方法可以包括從誘捕害蟲採集至少一種組織；測定組織的脂肪酸特徵；將組織的脂肪酸特徵與已知在其生命周期內攝食過目標植物的害蟲的脂肪酸特徵進行比較後，測定攝食轉基因作物以外植物的害蟲種群百分比。—因此，參與確定害蟲避難所區域的產品開發商、科學家和管理當局可以利用與害蟲攝食習性和攝食史有關的資料，確定這些害蟲的天然避難所區域是否足以部分或全部代替農民在自己農田中種植用於目標轉基因作物的結構性避難所的需要，從而在明顯延遲或防止抗性害蟲種群發生的同時使作物產量最大化。實施例0052下面的實施例本質上僅是示例性的，不應解釋為具有限制性意義。通過測定m/z176面積與m/z180面積的比率，對樣品的可替寧進行定量測定，其中m/z180為氘化可替寧標準。使用每個樣品中的可替寧標準來測定保留時間。可替寧數據用十億分之幾表示，檢出限大約十億分之一。棉酚分析將衍生劑(lml)加到裝有研磨蛾的各孔中。板用石蠟膜覆蓋，把蓋壓在石蠟膜上將各孔密封。使板渦旋l分鐘，然後打開蓋去掉密封膜後，板用箔紙覆蓋。將板在烤箱或加熱孔板夾中於80-90°C加熱1小時。從加熱系統中取出後冷卻，再次將板用石蠟膜覆蓋，加蓋密封各孔。將板在2500-3000rpm下離心5分鐘。[00701採用DVBSPE從衍生劑中提取棉酚。柱子依次用丙酮(0.5ml)和甲醇(0.5ml)洗滌，製備DVBSPE96孔板。然後，柱子用含有等量水和DMF混合物的溶液(0.5ml)保持溼潤。[0071為了避免交叉汙染，從裝有蛾和衍生劑的96孔板小心地打開蓋子並掀起石蠟膜。然後，將水(0.5ml)加到各孔中。將各個樣品轉移到DVBSPE96孔板的相應孔中，使之過柱。再將另外的DMF(0.5ml)加到裝有蛾殘餘物的最初的96孔板中，將板用石蠟膜覆蓋，然後加蓋，渦旋1分鐘，按3000rpm離心5分鐘。離心後，把水(0.5ml)加到各孔中，將樣品轉移到DVBSPE96孔板的相應孔中。0072樣品過柱後，柱子依次用20:80水:曱醇(0.5ml)和5:95丙酮曱醇(0.5ml)洗滌。隨後，用丙酮(50(^1)把棉酚從柱子中洗脫到2ml或1.5ml96孔板中。從樣品中除去丙酮，樣品用溫和的氮氣流乾燥。將樣品保存於-2(TC直到用電噴霧離子化/質譜/質i普(ESI/MS/MS)進行分析。棉酚的HPLC/ESI/MS/MS測定[0073向各樣品中加入丙酮(200|111),並將樣品混勻。然後，將包含5嗎/ml氘化衍生化雙苯胺-棉酚(20^il)的溶液加到各個樣品中作為內標。樣品加蓋後渦旋，然後轉移到0.5ml96孔板中用於分析。[0074HPLC使用短柱(ZorbaxEclipseXBD-C18，購自AgilentTechnologies,Inc.)雙溶劑流動相。溶劑A為10%水的曱醇溶液，溶劑B為2:1乙腈:丙酮。流速為0.25ml/分鐘，梯度見表1。表l:HPLC溶劑梯度tableseeoriginaldocumentpage18[0075質i普4義為Waters公司的MicromassQuattroUltimaLC/MS/MS檢測器，包括電噴霧負離子化三重四極杆質譜儀(triplequadrupolemassspectrometerwithnegativeelectrosprayionization)。因為HPLC無法提供正確的雙苯胺-棉酚電噴霧負離子化的電離基質，所以過HPLC柱後按0.05ml/分鐘的流速，引入0.6%NH4OH的曱醇溶液。用混合T形接口(mixingT-connection)，完成NH4OH的MeOH溶液與HPLC洗脫液過柱後的混合。在MS/MS方式中，用第一個四極杆來篩選667.3表示雙苯胺-棉酚負離子的質荷比。在第二個四極杆中，667.3質荷比在碰撞室內破碎。用第三個四極杆來篩選碎片離子一苯胺基-棉酚，其質荷比為574.2，這是因為失去了一個苯胺。檢出第二碎片離子提供了改進的特異性，並增加了信噪比。[0076通過574.2m/z的峰面積與內標氘化雙苯胺-棉酚峰面積的比率確定棉酚的半量子化。然後將這些比率與標準、空白和實驗室飼養的對照蛾的結果相比較以確定棉酚是否存在。結果[0077如上所述，對伺養在菸草、棉花、大豆和花生植物的煙夜蛾幼蟲的脂肪酸特徵、可替寧的存在和棉酚的存在進行了分析。[0078為了確立各植物宿主的脂肪酸特徵，對總離子流色譜圖積分，獲得各種脂肪酸(C16:0、C16:l、C18:0、C18:2和C18:3)的面積，合計得到總量。一種脂肪酸佔總脂肪酸的百分比見下表2至表5。所有4種宿主植物的比較顯示，每一種都有可用來與其它宿主區別的獨特的脂肪酸特徵。表2:花生植物飼養蛾的脂肪酸比率tableseeoriginaldocumentpage19表3:tableseeoriginaldocumentpage20[0079採用軟獨立建模分類法(SoftIndependentModelingforClassAnalogy,SIMCA),開發出基於4種作物每一種的飼養蛾脂肪酸特徵的監督分類(supervisedclassification)。SIMCA模型開發為4種作物的每一種產生單獨的主成分分析(PrincipalComponentAnalysis,PCA)模型或者分類模型。新的未知樣品用各PCA模型進行分類，通過未知樣品距PCA組模型的最小距離確定其組成員關係。參見圖1-4。以S/S。對Ho作圖顯示，橫坐標上樣品至模型距離相對於平均模型距離(S/S。)，及各樣品在縱坐標上的水平(leverage)。按5%顯著水平的水平線和垂直線表示組限(classlimit)。可將兩條橫線內接近原點的未知樣品劃分為組模型成員。兩條衝黃線以外的樣品不屬於組模型。圖1-4顯示可根據幼蟲變態前飼餵的宿主植物，應用脂肪酸特徵數據，對蛾樣品進行分類。表6顯示模型之間的距離。模型間距離越大，組間差異越大。一般而言，模型差異>3表示有顯著差異的組模型。數值範圍為200-45,000的，組it型顯著不同，並可4艮據其組，對新樣品進行分類。表6:棉花、菸草、大豆和花生植物之間的模型距離tableseeoriginaldocumentpage210080棉酚的有效性試驗在不同的兩天內分兩批單獨進行。大多數昆蟲飼養在棉花上。第一天進行第一批試驗，包括苘麻、大豆和豌豆餵養的昆蟲用於比較。預期該批將被證明為棉酚陰性。第二天，包括人工飼料餵養的昆蟲作為陰性對照。這兩天內，還進行空白和標準試-驗作為額外的試驗對照。[0081圖5中的結果用電噴霧/質譜儀記錄的信噪比表示，是電噴霧/質譜儀給出最一致的結果。也可使用質譜儀的其它響應參數，例如峰面積。提供以下每個處理組的最小、平均和最大信噪比人工飼料、苘麻、大豆、豌豆或棉花飼養昆蟲(單獨表示兩天中棉花飼餵的昆蟲)。選擇信噪比的截止值12作為確定棉酚存在與否的數值(若大於該值，則樣品為陽性；若小於或等於該值，則為陰性)。採用這些標準，試驗中棉花伺養昆蟲總被鑑定為棉酚陽性。對於棉花飼養蛾，信噪比通常〉100,幾乎總>30，並從未<14。兩天的最小值分別14和18,每天所測得的棉花銅餵昆蟲的總數〉50。信噪比標準(signaltonoisecriteria)取決於總的方法，因此在實驗室之間有所不同。因此，進行有效性研究以設定使假陰性最小的標準十分重要。[00821使用信噪比標準，棉酚HPLC-MS測定法有效性研究的結果見表7。發現所有棉花餵養蛾都是棉酚陽性的。其它不含棉酚植物的飼養蛾具有一定的假陽性比率。表7還表示非棉酚植物飼養的蛾存在一定的假陽性比率。也就是說，有些蛾可能被鑑定為在棉花上飼養，但是它們卻不是在棉花上飼養的。例如，所測28隻苘麻飼養蛾中有4隻被鑑定為在棉花上飼養。[0083檢測棉酚所設置的信噪比為12:1,試驗成功鑑定出所有得自棉花的昆蟲(棉酚陽性)，但是假陽性比率約為15°/。。也就是說，一定數量未在棉花上飼養的昆蟲被保守地鑑定來自棉花。表7:有效性研究結果tableseeoriginaldocumentpage22權利要求1.一種測定採食期的動物是否攝食過目標植物的方法，該方法包括篩選動物存在的目標植物的至少一種指示物。2.權利要求1的方法，其中所述指示物選自脂肪酸、生育酚、糖、黃酮類、生物鹼、植物蛋白、遺傳標記、礦物質、次生代謝物、其衍生物和它們的組合。3.權利要求1的方法，其中所述指示物選自菸鹼、降菸鹼、可替寧、降可替寧和棉酚。4.權利要求l的方法，其中所述動物是害蟲。5.權利要求l的方法，其中所述動物是昆蟲。6.權利要求l的方法，其中所述目標植物是作物。7.權利要求1的方法，其中所述目標植物是選自以下的作物棉花、玉米、油菜、玉蜀黍、菸草、大豆、花生、向日葵、水稻、苜蓿和小麥。8.權利要求l的方法，其中所述動物是谷實夜蛾或煙夜蛾。9.權利要求1的方法，其中所述指示物是黃酮類，選自花色素苷、黃烷醇、二氫黃酮、黃酮醇、黃酮和異黃酮。10.權利要求1的方法，其中所述指示物是生育酚，選自RRR-生育酚、(3-生育酚、Y-生育酚、5-生育酚、生育三烯酚、oc-生育三烯酚、，生育三烯酚和5-三烯甘油酯。11.權利要求l的方法，其中該方法還包括從動物中採集組織樣品；從組織樣品中提取脂肪酸；分析提取的脂肪酸以確定動物的脂肪酸特徵；和將該動物的脂肪酸特徵與已知在其生命周期中攝食過目標植物的動物的脂肪酸特徵相比較。12.權利要求11的方法，其中該方法還包括使提取的脂肪酸進行酯交換以產生脂肪酸甲酯的混合物；和分離並檢測脂肪酸甲酯的混合物以確定動物的脂肪酸特徵。13.權利要求11的方法，其中所述方法按高通量形式實施，包括從大量動物中採集組織樣品；將組織樣品放入多孔板的各孔中；和篩選各組織樣品存在的目標植物的一種或多種指示物。一14.權利要求13的方法，其中所述指示物選自脂肪酸、生育酚、糖、黃酮類、生物鹼、植物蛋白、遺傳標記、礦物質、其衍生物和它們的組合。15.權利要求13的方法，其中所述指示物選自菸鹼、降菸鹼、可替寧、降可替寧和棉酚。16.—種測定動物是否糹聶食過至少一種目標4直物的方法，該方法包括從動物中採集至少一種組織；測定組織的脂肪酸特徵；和將該組織的脂肪酸特徵與已知在其生命周期內攝食過目標植物的動物的脂肪酸特徵相比較。17.權利要求16的方法，其中該方法還包括將組織與溶劑接觸以便從組織中提取脂肪酸；使脂肪酸進行酯交換以製備脂肪酸曱酯的混合物；和分析脂肪酸曱酯的混合物以測定組織的脂肪酸特徵。18.權利要求16的方法，其中所述目標植物是選自以下的作物棉花、玉米、油菜、玉蜀黍、菸草、大豆、花生、向日葵、水稻、苜蓿和小麥。19.權利要求16的方法，其中該方法還包括分析組織中存在的目標植物的至少一種指示物。20.權利要求19的方法，其中該方法包括測定組織的脂肪酸特徵後，分析組織中存在的目標植物的至少一種指示物。21.權利要求19的方法，其中所述指示物選自脂肪酸、生育酚、糖、黃酮類、生物鹼、植物蛋白、遺傳標記、礦物質、次生代謝物、其衍生物和它們的組合。22.權利要求19的方法，其中所述指示物選自菸鹼、降菸鹼、可替寧、降可替寧和棉酚。23.權利要求16的方法，其中該方法包括測定成蟲體內脂肪酸特徵中C16:l和C18:l的相對含量，以確定採食期的昆蟲是否攝食過棉花植物。24.權利要求23的方法，其中該方法還包括分析成蟲的試驗組織中存在的棉酚。25.權利要求16的方法，其中該方法包括測定成蟲體內脂肪酸特徵中C16:0、C18:l和C18:2的相對含量，以確定採食期的昆蟲是否攝食過花生植物。26.權利要求25的方法，其中該方法還包括分析成蟲的試驗組織中存在的蛋白特異性變應原。27.權利要求26的方法，其中所述蛋白特異性變應原是白藜蘆醇。28.權利要求16的方法，其中該方法包括測定成蟲體內脂肪酸特徵中C16:0和C18:3的相對含量，以確定採食期的昆蟲是否攝食過菸草植物。29.權利要求28的方法，其中該方法還包括分析成蟲的試驗組織中存在的菸鹼和/或菸鹼衍生物。30.權利要求29的方法，其中所述菸鹼衍生物選自可替寧、降可替寧、降煙》鹹和其它煙-威代謝物。31.權利要求16的方法，其中該方法包括測定成蟲體內脂肪酸特徵中C16:0、C18:l、C18:2和C18:3的相對含量，以確定採食期的昆蟲是否攝食過大豆植物。32.權利要求31的方法，其中該方法還包括分析成蟲的試驗組織中存在的至少一種異黃酮。33.權利要求32的方法，其中所述至少一種異黃酮選自染料木素、黃豆香元和黃豆黃素o34.—種測定與轉基因作物相比的天然避難所區域的害蟲的方法，該方法包^舌從轉基因作物附近誘捕害蟲；篩選誘捕害蟲存在的至少一種目標植物的一種或多種指示物；和測定攝食轉基因作物以外植物的害蟲種群百分比。35.權利要求34的方法，其中所述指示物選自脂肪酸、生育酚、糖、黃酮類、生物鹼、植物蛋白、遺傳標記、礦物質、其衍生物和它們的組合。36.權利要求35的方法，其中所述指示物選自菸鹼、降菸鹼、可替寧、降可替寧和棉酚。37.權利要求34的方法，其中該方法還包括從採集到的害蟲中採集至少一種組織；測定組織的脂肪酸特徵；和將該組織的脂肪酸特徵與已知在其生命周期內攝食過目標植物的害蟲的脂肪酸特徵進行比較。38.權利要求34的方法，其中所述害蟲是昆蟲。全文摘要本發明提供一種測定動物是否攝食過目標植物的方法。該方法包括篩選動物存在的目標植物的至少一種指示物。文檔編號G01N33/50GK101351705SQ200680049961公開日2009年1月21日申請日期2006年11月1日優先權日2005年11月2日發明者G·P·赫德,J·T·格林普拉特,M·米爾科夫斯基,R·G·奧爾思,S·H·莫迪亞諾申請人:孟山都技術有限公司