耐除草劑的植物的製作方法

2023-07-23 05:57:41

專利名稱：耐除草劑的植物的製作方法
技術領域：
本發明涉及耐受除草劑更具體地AHAS抑制性除草劑的作物植物和作物部分，尤其是十字花科(Brassicaceae),特別是芸苔屬(Brassica)種類的植物。本發明還涉及代表完全敲除型AHAS等位基因的突變AHAS核酸。更具體地，本發明涉及代表影響植物對AHAS抑制性除草劑的耐受性的完全敲除型和突變AHAS蛋白的核酸。
背景技術：
乙醯羥酸合成酶(AHAS ；EC 4. I. 3. 18，也被稱為乙醯乳酸合成酶或ALS)是植物體內生物合成支鏈胺基酸的一種關鍵酶(Tan等人，2005, PestManag Sci，61:246-257)。 AHAS是若干結構上不同的除草劑家族的作用位點，這些除草劑家族包括磺醯脲類、咪唑啉酮類、磺醯氨基羰基三唑啉酮類、三唑並嘧啶類和嘧啶基(氧代/硫代)苯甲酸酯類。由於動物體內不存在AHAS，AHAS抑制性除草劑在動物體內顯示出非常低的毒性(Duggleby等人，2008，Plant Physiology and Biochemistry 46,309-324)。甘藍型油菜是具有基因組A和C的異源四倍體，且包括五個AHAS基因座。AHAS2、AHAS3和AHAS4源於基因組A，然而AHASl和AHAS5源於基因組C。AHASl和AHAS3是甘藍型油菜中唯一的組成型表達的且編碼對生長和發育是必需的主要AHAS活性的基因(Tan等人，Pest ManagSci 61，p246_257，2005)。已經描述了各種具有AHAS突變的植物，這些AHAS突變賦予對一種或多種AHAS抑制性除草劑的耐受性(對於綜述，參見Duggleby等人,2008年，表2,其通過引用結合在此。例如，Prol97到如Ser、Leu、His、Thr、Gin、Ala或Thr的突變可賦予對SU、IMI,PC、TP和/或SACT的耐受性，且已經描述於各種植物種類中，包括擬南芥、藜草、野蘿
卜、茼蒿、菸草和卡諾拉油菜(Haugh等人，1988Mol Gen Genet 211:266-271 ;Sibony等人，Weed Res 41:509-522，2001 ；Yu 等人，2003，Weed Science, 51 (6), p. 831 - 838 ；Tal 和Rubin 2004, Resistant Pest Management Newsletter. 13:p31-33. ;Lee 等人，1988，EMBOJ. 7(5):pl241-1248 ;Ruiter 等人，2003，Plant Mol Biol. 53(5):p675_89 ;Shimizu 等人，2008，Plant Physiol.147(4):pl976_83)。咪唑啉酮耐受性油菜突變體PMI和PM2 (目前以Clearfield 卡諾拉油菜銷售)顯示單核苷酸置換，導致在AHASl蛋白(PMl)內第653位胺基酸的天門冬氨酸到絲氨酸的置換，以及在AHAS3蛋白(PM2)內第574位的色氨酸到亮氨酸的置換。PMl僅耐受咪唑啉酮類，但PM2交叉耐受咪唑啉酮類與磺醯脲類，由此PM2引起的咪唑啉酮類耐受水平比PMl的高得多。當PMl和PM2突變疊加且是純合的時，獲得了對咪唑啉酮類除草劑的最高耐受水平(Tan 等人，2005)。W009/046334描述了突變乙醯羥酸合成酶(AHAS)核酸和由突變核酸編碼的蛋白質，以及包括這些突變基因的卡諾拉油菜植物、細胞和種子，由此植物顯示出對咪唑啉酮類和磺醯脲類的增加的耐受性。W009/031031披露了抗除草劑的芸苔屬植物以及新穎的編碼野生型和咪唑啉酮抗性芸苔屬乙醯羥酸合成酶大亞基蛋白的多核苷酸序列、種子以及使用這樣的植物的方法。
美國專利申請09/0013424描述了具有提高的咪唑啉酮除草劑抗性的芸苔屬品系(包括芥菜型油菜)、用於生成這樣的品系的方法和用於選擇這樣的品系的方法、以及芸苔屬AHAS基因和序列和帶有產生咪唑啉酮類除草劑抗性的點突變的等位基因。W008/124495披露了編碼包括至少兩個突變的乙醯羥酸合成酶(AHAS)大亞基的突變體(如雙突變體和三突變體)的核酸，這些突變體用於生產具有改進的AHAS抑制性除草劑的耐受水平的轉基因或非轉基因植物。本發明還提供了表達載體、細胞、包括編碼AHAS大亞基雙突變體和三突變體的多核苷酸的植物、包括兩個或更多個AHAS大亞基單突變體多肽的植物、及其製備和使用方法。然而，進一步改善作物植物(特別是油菜植物)中對AHAS抑制性除草劑的耐受性是所希望的。 本發明通過提供包括代表完全敲除型AHAS等位基因和編碼耐除草劑AHAS蛋白的AHAS等位基因的結合的耐除草劑植物而對技術作出了重要貢獻。通過將除草劑耐受型AHAS等位基因和完全敲除型AHAS等位基因相結合，本發明提供了一種可替代的獲得作物植物(特別是油菜植物)對AHAS抑制性除草劑的有效耐受性的方法。這個問題在不同實施方案、實例和權利要求中描述之後如在此得以解決。發明概述在第一實施方案中，本發明提供了一種包含完全敲除型AHAS等位基因的芸苔屬植物。一個完全敲除型AHAS等位基因是指一個AHAS基因的核酸序列，該核酸序列編碼非功能性AHAS蛋白，即一種既不參與也不影響AHAS 二聚體形成的AHAS蛋白，或根本不編碼AHAS蛋白。在另一個實施方案中，本發明提供了一種芸苔屬植物，其中完全敲除型AHAS等位基因包括一個無義突變，這是一個在AHAS等位基因中的突變，由此一個或多個翻譯終止密碼子被引入編碼DNA以及相應的野生型AHAS等位基因的相應mRNA序列中，由此該終止密碼子導致非功能性AHAS蛋白的產生。仍然在另一個實施方案中，本發明提供了一種芸苔屬植物，其中完全敲除型AHAS等位基因選自下組，該組由以下各項組成a)包含在對應於SEQ ID NO: I的核苷酸871-873或SEQ ID NO:3的核苷酸826-828的位置上的終止密碼子的核苷酸序列；b)包含在對應於SEQ ID NO: I的核苷酸862-864或SEQ ID NO:5的核苷酸808-810的位置上的終止密碼子的核苷酸序列；c)包含在對應於SEQ ID NO: I的核苷酸775-777或SEQ ID N0:5的核苷酸721-723的位置上的終止密碼子的核苷酸序列；d)包含在對應於SEQ ID NO: I的核苷酸799-801或SEQ ID NO: 5的核苷酸745-747的位置上的終止密碼子的核苷酸序列。本發明還提供了一種芸苔屬植物，在其基因組中包括至少一種第二突變AHAS等位基因，所述第二突變AHAS等位基因編碼一種耐除草劑的AHAS蛋白。在另一個實施方案中，該耐除草劑的AHAS蛋白包括一個在對應於SEQ ID N0:2的197位或SEQ ID N0:4的182位或SEQ ID NO:6的179位的位置上的絲氨酸。可替代地，耐除草劑的AHAS的蛋白包括至少兩個胺基酸置換。
仍然在另一個實施方案中，該耐除草劑的AHAS的蛋白包括與SEQ IDNO: 2,SEQ IDNO: 4 或 SEQ ID NO: 6 具有至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95%、98%、99% 或 100%
的序列一致性的胺基酸序列。在一個另外的實施方案中，本發明的AHAS等位基因包括與SEQ IDN0:U SEQ IDNO: 3 或 SEQ ID NO: 5 具有至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95%、98%、99% 或 100%的序列一致性的核苷酸序列。同樣地在本發明的一個實施方案中，提供了含有本發明的突變AHAS等位基因的植物的植物細胞、配子、種子、胚、合子或體細胞、子代或雜交體。本發明進一步提供了選自下組的芸苔屬種子，該組由以下各項組成a)已經於2009年12月17日以登錄號NCMB 41690保藏在NCMBLimited中的包含AHAS 1-HET0112的芸苔屬種子； b)已經於2009年12月17日以登錄號NCMB 41687保藏在NCMBLimited中的包含AHAS3-HET0102的芸苔屬種子；c)已經於2009年12月17日以登錄號NCMB 41688保藏在NCMBLimited中的包含AHAS3-HET0103的芸苔屬種子；或d)已經於2009年12月17日以登錄號NCMB 41689保藏在NCMBLimited中的包含AHAS3-HET0104的芸苔屬種子；還提供了從上面描述的種子中獲得芸苔屬植物，或其細胞、部分、種子或子代。在一個實施方案中，提供了代表如上所述的完全敲除型AHAS等位基因的核酸序列。本發明還提供了一種用於將至少一種選自本發明的完全敲除型AHAS等位基因從一種植物轉移到另一種植物的方法，包括以下步驟e)鑑定包含至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因的第一種植物，或產生包含至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因的第一種植物；f)使該第一種植物與不包含該至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因的第二種植物雜交，然後從雜交體收集Fl雜交種子；g)任選地，鑑定包含該至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因的Fl植物；h)使包含該至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因的Fl植物與不包含該至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因的第二種植物回交至少一代(X)，並從雜交體中收集BCx種子；並且i)鑑定包含該至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因的每一代BCx植物。本發明進一步提供了一種將一種本發明的完全敲除型AHAS等位基因與除草劑耐受型AHAS等位基因結合在一種植物中的方法，該方法包括以下步驟j)產生和/或鑑定至少一種包含至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因的植物和至少一種包含至少一種選擇的除草劑耐受型AHAS等位基因的植物；k)使這至少兩種植物雜交，並且從至少一個雜交體收集Fl雜交種子；並且I)任選地，鑑定一種包含至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因和至少一種選擇的除草劑耐受型AHAS等位基因的Fl植物。在另一個實施方案中，提供了用於生產如上所述的植物的方法，以及用來通過使至少一種本發明的完全敲除型AHAS等位基因與至少一種除草劑耐受型AHAS等位基因結合在一種植物的基因組DNA中而增加該植物的除草劑耐受性的方法。本發明進一步提供了用於控制在作物植物附近的雜草的方法，以及用於使用一種或多種AHAS抑制性除草劑處理包含完全敲除型和除草劑耐受型AHAS等位基因的結合的植物的方法。本發明還涉及本發明的一種完全敲除型A HAS等位基因用於獲得耐除草劑的植物的用途。仍然在另一個實施方案中，本發明涉及本發明的一種植物用於產生包含一種或多種完全敲除型AHAS等位基因的種子，或生產包含一種或多種完全敲除型AHAS等位基因的油菜作物的用途。附圖
簡要說明圖I :分別來自 GenBank CAA77613. I、CAA77615. I 和 AY042819. I 的甘藍型油菜AHASl (BN1)、甘藍型油菜AHAS3 (BN3)和擬南芥AHAS (AT)蛋白質的胺基酸序列的多重序列比對圖2 :將完全敲除型AHAS等位基因與AHAS錯義等位基因相結合對在溫室中播種前施用的酮脲磺草吩酯(thiencarbazone-methyl)的耐受性的影響。A.與AHAS3錯義等位基因(HET0111)結合的AHASl錯義等位基因(HET0108)。從左至右未處理的HET0108/HET0108HET0111/HET0111 ;處理的 HET0108/HET0108 HET0111/HET0111 ;處理的 HET0108/HETO108 AHAS3wt/AHAS3wt ;處理的 AHASlwt/AHASlwt HET0111/HET0111 ;處理的 AHASlwt/AHASlwtAHAS3wt/AHAS3wt。B.與AHAS3錯義等位基因(HET0111)結合的AHASl敲除型等位基因(HET0112)。從左至右未處理的 HET0112/HET0112HET0111/HET0111 ;處理的 HET0112/HETOl 12 HET0111/HET0111 ;處理的 HETOl 12/HET0112 AHAS3wt/AHAS3wt ;處理的 AHASlwt/AHASlwt HET0111/HET0111 ;處理的 AHASlwt/AHASlwtAHASSwt/AHASSwtoC.與 AHAS3 敲除型等位基因(HET0104)結合的AHASl錯義等位基因(HET0108)。從左至右未處理的HET0108/HETO108 HET0104/HET0104 ;處理的 HET0108/HET0108HET0104/HET0104 ;處理的 HETO108/HETO108 AHAS3wt/AHAS3wt ;處理的 AHASlwt/AHASlwt HET0104/HET0104 ;處理的 AHASlwt/AHASlwt AHAS3wt/AHAS3wt。Wt=野生型。圖3 :將完全敲除型AHAS等位基因與AHAS錯義等位基因相結合對在溫室中出苗後噴灑的酮脲磺草吩酯(thiencarbazone-methyl)的耐受性的影響。A.與AHAS3錯義等位基因(HET0111)結合的AHASl錯義等位基因(HET0108)。從左至右未處理的優良親本品系；處理的 HET0108/HET0108 HET0111/HET0111 ;處理的 HET0108/HET0108AHAS3wt/AHAS3wt ；處理的 AHASlwt/AHASlwt HET0111/HET0111 ;處理的 AHASlwt/AHASlwt AHAS3wt/AHAS3wt。B.與AHAS3錯義等位基因(HET0111)結合的AHASl敲除型等位基因(HET0112)。從左至右未處理的優良親本品系；處理的HET0112/HET0112HET0111/HET0111 ;處理的HET0112/HETOl 12 AHAS3wt/AHAS3wt ;處理的 AHASlwt/AHASlwt HET0111/HET0111 ;處理的 AHASlwt/AHASlwtAHAS3wt/AHAS3wt。C.與AHAS3敲除型等位基因(HET0104)結合的AHASl錯義等位基因(HET0108)。從左至右未處理的優良親本品系；處理的HET0108/HET0108 HET0104/HETO104 ;處理的 HET0108/HET0108 AHAS3wt/AHAS3wt ;處理的 AHASlwt/AHASIwtHETO104/HETO104 ;處理的 AHASlwt/AHASlwt AHAS3wt/AHAS3wt。
Wt=野生型。一般定義術語「核酸序列」(或核酸分子)是指處於單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA分子，特別是編碼根據本發明的蛋白質或蛋白質片段的DNA。「內源核酸序列」是指植物細胞內的核酸序列，例如存在於芸苔屬細胞的核基因組中的AHAS基因的內源等位基因。「分離的核酸序列」用於表示不再處於其天然環境中例如在體外或在重組宿主細胞如細菌或植物中的核酸序列。術語「基因」表示包含在細胞內被轉錄成RNA分子(例如，包含內含子序列的然後被剪接為成熟mRNA的前mRNA)的區域(轉錄區)的DNA序列，其可操作地連接到調節區(例如啟動子)上。因此，基因可以包含若干可操作地連接的序列，例如啟動子(一種包含例如涉及翻譯起始的序列的5』前導序列)、(蛋白質)編碼區(cDNA或基因組DNA)以及包含例如轉錄終止位點的3』非翻譯序列。「內源基因」用於與「外源基因」、「轉基因」或「嵌合基因」區分，並且是指來自某一植物屬、種類或品種的植物的基因，不是通過轉化引入植物的(即，它 不是『轉基因』)，而是通常存在於所述植物屬、種類或品種的植物中的，或者是從其通常存在的另一種植物屬、種類或品種的植物中，通過普通的育種技術或通過體細胞雜交(例如原生質體融合)引入到植物中的。類似地，基因的「內源等位基因」不是通過植物轉化引入到植物或植物組織中的，而是例如通過植物誘變和/或選擇產生的，或通過篩選天然植物種群而獲得的。術語「蛋白質」或「多肽」可互換使用，並且是指由胺基酸的鏈組成的分子，不涉及特定的作用模式、大小、三維結構或來源。因此，AHAS蛋白的「片段」或「部分」仍然可以被稱為「蛋白質」。「分離的蛋白質」用來指不再處於其天然環境中的蛋白質，例如體外或在重組細菌或植物宿主細胞中。「酶」是一種包含酶促活性的蛋白質或蛋白複合體，例如功能性AHAS 酶。如在此所使用的「AHAS蛋白」是指構成涉及支鏈胺基酸的生物合成的AHAS酶(也稱為「乙醯羥酸合成酶」或「乙醯乳酸合成酶」)的催化亞基的一種或多種蛋白質或一種或多種多肽。在植物和微生物中，這些胺基酸的碳骨架是從單獨的丙酮酸合成(纈氨酸合成)的，丙酮酸加乙醯輔酶A合成(亮氨酸)或丙酮酸加2-酮丁酸酯合成(異亮氨酸)。在這個過程中的第一步驟是由乙醯羥酸合成酶(AHAS的，EC 2.2. I. 6)催化的，其中形成了 2-乙醯乳酸酯(AL)或2-乙醯-2-羥丁酸酯(AHB)。該AHAS酶由兩個亞基組成的一個催化亞基和一個調節亞基(也分別稱為大亞基和小亞基)。催化亞基具有範圍在59-66kDa的分子質量，並且在真核生物中，它被合成作為一個較大的前體蛋白，該較大的前體蛋白具有一個需要指導蛋白質到線粒體(在真菌中)或到葉綠體(植物中)的N-端肽。該調節亞基不具有AHAS活性，但極大地促進了該催化亞基的活性。它在植物中超過50kDa，也被合成為較大的具有一個N-端細胞器靶向肽的前體蛋白。凝膠過濾研究表明，在溶液中，擬南芥AHAS的催化亞基以二聚體存在。然而，在存在任何磺醯脲類除草劑的情況下，它結晶為一個四聚體，該調節亞基與催化亞基之間的複合物的分子質量還表明，在裝配中存在四個每個亞基。擬南芥AHAS的催化亞基的每個四聚體具有四個活性位點。每個活性位點位於在兩個單體的界面；因此，AHAS活性的最低要求是具有一個催化亞基的二聚體。這些四聚體的生物學關聯性還不清楚；它們可以(Duggleby等人，2008)。來自擬南芥的AHAS蛋白、來自甘藍型油菜的AHASl和AHAS3蛋白的胺基酸序列分別由序列表中的SEQ ID NO:2,SEQ IDN0:4和SEQIDNO: 6 代表。在擬南芥中，AHAS蛋白(GenBank:CAB62345. UAAM92569. I 和 AY042819. I)被合成作為一個663個胺基酸(aa)長的前體，而無葉綠體轉運肽的成熟蛋白在第98位胺基酸開始。在甘藍型油菜中，AHASl (GenBank:CAA77613. I)和 AHAS3 (GenBank:CAA77615. I)前體蛋白為655個和652個胺基酸長，成熟蛋白分別在第83位和第80位胺基酸開始。擬南芥AHAS的每種多肽由三個域α (殘基86-280)、β (殘 基281-451)和Y (殘基463-639)組成，其中每個域具有一個相似的由六至九個螺旋環繞的六鏈平行b面的整體摺疊。涉及在擬南芥中形成二聚體界面的殘基位於第119-217位胺基酸之間和第508-607位胺基酸之間。在甘藍型油菜中，這些分別位於第104-202位胺基酸之間和第493-592位胺基酸之間(AHASl)以及第101-199位胺基酸之間和第490-589位胺基酸之間(AHAS3)。擬南芥和甘藍型油菜AHAS蛋白的胺基酸序列的比對表示在圖I中。在菸草中，M542和H142殘基顯示涉及三級結構的穩定和二聚體的相互作用(Le等人，2004，Biochem Biophys ResCommun. 7; 317 (3)，p930_938)。此外，發現菸草AHAS蛋白的第567-582位胺基酸之間的區域和第630位胺基酸的區域C-末端涉及活性二聚體的結合/穩定，因為這些域的缺失導致單體形成(Kim 等人，2004，Biochem J. 15;384, p 59-68)。術語「AHAS基因」在此是指編碼乙醯羥酸合成酶催化亞基蛋白(即AHAS蛋白)的核酸序列。AHAS 基因無內含子(Mazur 等人,1987, Plant Physiol. , Dec;85, plllO-1117)。擬南芥AHAS (GenBank AY042819)和甘藍型油菜AHASl和AHAS3的基因序列/編碼序列分別由序列表中的SEQ ID NO: I、SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:5表示。如在此所使用的，術語「等位基因」表示在特定基因座的基因的任何一種或多種可替代形式。在生物的二倍體(或雙二倍體)細胞中，給定基因的等位基因位於染色體的特定位置或基因座(複數個基因座)上。一種等位基因存在於同源染色體對的每條染色體上。如在此所使用的，術語「同源染色體」表示這樣的染色體，所述染色體含有相同生物學特徵的信息，在相同的基因座上含有相同的基因，但可能這些基因的等位基因不同。同源染色體是在減數分裂過程中配對的染色體。「非同源染色體」代表了生物體的所有生物學特徵，形成一組，而在細胞中的組數被稱為倍性。二倍體生物含有兩組非同源染色體，其中每組同源染色體是從不同的親體遺傳來的。在雙二倍體種類中，實質上存在兩組二倍體基因組，由此將兩組基因組的染色體稱為「同源染色體」(類似地，兩組基因組的基因座或基因被稱為部分同源基因座或基因)。二倍體或雙二倍體的植物種類在特定基因座上可以包含大量的不同的等位基因。如在此所使用的，術語「雜合」表示當兩個不同的等位基因存在於特定基因座但是分別位於相應的在細胞中的同源染色體對上時所存在的遺傳條件。相反地，如在此所使用的，術語「純合」表示當兩個相同的等位基因存在於特定基因座但是分別位於相應的在細胞中的同源染色體對上時所存在的遺傳條件。如在此所使用的，術語「基因座(複數個基因座)」表示在染色體上的一個或多個特定位置或位點，其中發現了例如基因或遺傳標記。例如，「AHAS1基因座」是指在染色體上可找到AHASl基因(和兩個AHASl等位基因)的位置，而「AHAS3基因座」是指在染色體上可找到AHAS3基因(和2個AHAS3等位基因)的位置。
如在此所使用的，「基本相似(essentially similar)」是指具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%的序列一致性的序列。這些核酸序列也可以被稱為與提供在序列表中的AHAS序列「實質相同」或「基本相同」。兩個相關核苷酸或胺基酸序列的「序列一致性」，表示為百分比，是指在兩個最優比對序列中，具有相同殘基的位置數(xlOO)除以比較的位置數。一個空位，即在比對中的一個位置，其中一個殘基存在於一個序列中，但不存在另一個序列中，其被視為具有不相同殘基的位置。根據European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS, Rice 等人，2000, Trendsin Genetics 16(6) :276_277 ;參見例如 http://www. ebi. ac. uk/emboss/align/index.html)中的 Needleman 和 Wunsch 總體比對算法(Needleman and Wunsch, 1970, J MolBiol48(3) :443-53)使用預設設置(空位開放罰分=10 (對於核苷酸)/10 (對於蛋白質)和空位拓展罰分=0.5 (對於核苷酸)/0.5 (對於蛋白質))，通過在全長上比對兩個序列來發現兩個序列的「最優比對」。對於核苷酸使用的預設評分矩陣是EDNAFULL，而對於蛋白質，使
用的預設評分矩陣是EBL0SUM62。可以使用「嚴緊雜交條件」來鑑定與給定的核苷酸序列實質相同的核苷酸序列。嚴緊條件是序列依賴性的，在不同的情況下將是不同的。通常，嚴緊條件被選擇為比特定序列在定義的離子強度和PH下的熱熔點(Tm)低大約5° C。Tm (在定義的離子強度和pH下)是50%的靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度。典型地，所選擇的嚴緊條件是在pH 7和至少60° C的溫度下，鹽濃度為約0. 02摩爾。降低鹽濃度和/或增加溫度增加了嚴緊性。用於RNA-DNA雜交的嚴緊條件(Northern印跡，使用例如IOOnt的探針)是例如包括在63° C下，在0. 2X SSC中至少洗滌一次持續20min的那些條件、或等效條件。「高嚴緊條件」可以例如通過如下來提供在65° C的水溶液中雜交，該溶液含有6x SSC(20x SSC含有 3. OM 恥(1、0.31檸檬酸恥，？!1 7. 0)、5x enhardt' s( 100X enhardt’s含有2%Ficol I、2%聚乙烯吡咯烷酮、2%牛血清白蛋白)、0. 5%十二烷基硫酸鈉(SDS)、以及作為非特異性競爭物的20 μ g/ml變性的載體DNA (單鏈魚精子DNA，具有120-3000個核苷酸的平均長度)。在雜交之後，可以在若干步驟中進行高嚴緊洗滌，其中最終洗滌(大約30分鐘)是在雜交溫度下，在0. 2-0. Ix SSC、0. 1%SDS中進行。「中度嚴緊條件」是指與在上述溶液中雜交等效的條件，但是在大約60° C-62° C。中度嚴緊洗滌可以在雜交溫度下，在Ix SSC、0. 1%SDS中進行。「低嚴緊性」指與在上述溶液中雜交等效的條件，但是在大約50° C_52° C。低嚴緊洗滌可以在雜交溫度下，在2x SSC、0. 1%SDS中進行。還參見Sambrook等人，(1989)以及 Sambrook 和 Russell (2001)。術語基因或蛋白質的「直向同源物」在此是指在另一個種類中發現的同源基因或蛋白質，其具有與該基因或蛋白質相同的功能，但其序列(通常)從當包含這些基因(即，通過物種形成從共同祖先進化的基因)的種類發散時的時間點發散。因此可以基於序列比較(例如，基於整個序列或特定結構域的序列一致性百分比)和/或功能分析，鑑定在其他的植物種類(例如芥菜型油菜等)中的甘藍型油菜AHAS基因的直向同源物。術語「突變體」或「突變」是指例如不同於所謂的「野生型(wild type)」變異體(也可寫成「wildtype」或「wild-type」)的植物或基因，是指例如在自然界中最常出現的植物或基因的典型形式。「野生型植物」是指一種這樣的植物，其具有在自然種群中的這種植物的最常見表型。「野生型等位基因」是指產生野生型表型所需要的基因的等位基因。突變植物或等位基因可以發生在自然種群中或者可以通過人工幹預產生，例如，通過誘變，因此「突變等位基因」是指產生突變表型所需要的基因的等位基因。如在此所使用的，術語「突變AHAS等位基因」(例如突變體AHASl或AHAS3)是指與野生型AHAS等位基因在一個或多個核苷酸位置上不同的AHAS等位基因，即，當與野生型等位基因比較時，該AHAS等位基因在其核酸序列中包括一種或多種突變。 核酸序列中的突變可以包括例如(a) 「錯義突變」，是核酸序列中的改變，其導致一個胺基酸置換另一個胺基酸； (b) 「無義突變」或「終止密碼子突變」，所述突變是核酸序列中的改變，其導致提前終止密碼子的引入，從而終止翻譯(導致截短的蛋白質)；植物基因含有翻譯終止密碼子「TGA」 (RNA中的UGA)，「TAA」 (RNA中的UAA)和「TAG」(RNA中的UAG);因此，導致有待進入正在被翻譯的成熟mRNA中(在閱讀框中)的這些密碼子之一的任何核苷酸置換、插入、缺失將使翻譯終止。(C) 一個或多個胺基酸的「插入突變」，是由於在核酸的編碼序列中已經添加一個或多個密碼子所致；(d) 一個或多個胺基酸的「缺失突變」，是由於在核酸的編碼序列中已經缺失一個或多個密碼子所致；(e) 「移碼突變」，導致核酸序列被翻譯在突變的不同的框下遊。移碼突變可能具有不同的原因，例如一個或多個核苷酸的插入、缺失或複製，而且影響前mRNA剪接(剪接位點突變)的突變可以導致移碼；(f) 「剪接位點突變」，其改變或取消前-mRNA序列的正確剪接，導致與野生型不同的胺基酸序列的蛋白質。例如，在RNA剪接過程中可以跳過一個或多個外顯子，導致一種缺乏由跳過的外顯子編碼的胺基酸的蛋白質。可替代地，可以通過錯誤剪接，或者可以保留一個或多個內含子，或者可以產生替代的剪接供體或受體，或者可以在一個替代位置(例如在內含子內)開始剪接，或者可以產生替代的多腺苷酸化信號，來改變閱讀框。正確的前mRNA剪接是一個複雜的過程，可以受到基因的核苷酸序列中的各種突變的影響。在高等真核生物例如植物中，主要的剪接體剪接內含子，所述內含子在5』剪接位點(供體位點)含有GU，在3』剪接位點(受體位點)含有AG。核真核基因的大約99%的剪接位點遵循GU-AG法則(或GT-AG 法則；參見 Lewin, Genes VI, Oxford University Press 1998,第 885-920 頁，ISBN0198577788)，同時內含子在5』和3』剪接位點含有其他的二核苷酸，例如GC-AG和AU-AC，分別僅佔大約1%和O. 1%。如在此所使用的，「完全敲除型等位基因」是一個指導顯著降低功能的AHAS表達或沒有功能性AHAS表達的突變體等位基因，即，細胞體內顯著降低量的功能性AHAS蛋白或沒有功能性AHAS蛋白。根本而言，相對於野生型蛋白質，導致包含至少一個胺基酸插入、缺失和/或置換的蛋白質的任何突變可以導致顯著降低的酶活性或沒有酶活性。然而，應當理解的是，在蛋白質某些部分中的突變更可能導致突變AHAS蛋白的功能降低，例如導致截短的蛋白質的突變，由此缺失了功能和/或結構域的重要部分。為了確定一個突變AHAS等位基因是否是一個完全敲除型等位基因，可以分析該特定等位基因是否確實在mRNA和/或蛋白質水平沒有表達或表達顯著更少，而在其仍然表達的情況下，是否蛋白質的分子質量表明多聚體或單體的形成，例如由Kim等人(BiochemJ. 15; 384, P 59-68，2004)描述的。可替代地，可以在例如植物上進行雜交，為此AHAS功能是必需的，由此預期將獲得突變等位基因的(雙)純合子，並且如果這些沒有回收，該突變等位基因起到敲除型等位基因的作用，例如在下文中所述。如在此所使用的，「顯著降低量的功能性AHAS蛋白」(如功能性AHASl或AHAS2蛋白)是指與不包含完全敲除型AHAS等位基因的細胞產生的功能性AHAS蛋白的量相比，由含有完全敲除型AHAS等位基因的細胞產生的功能性AHAS蛋白的量降低至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100% (即，細胞不產生功能性蛋白)。該定義涵蓋了在體內不具有生物活性的「非功能性」AHAS蛋白(例如，截短的AHAS蛋白)的產生、功能性蛋白的絕對量的降低(例如，由於AHAS基因突變產生 的無功能AHAS蛋白)、和/或與功能性野生型AHAS蛋白(例如AHAS蛋白中的一個或多個胺基酸殘基被另一個胺基酸殘基置換或缺失，其中一個或多個胺基酸殘基對於該編碼的AHAS蛋白的生物活性是至關重要的)相比具有顯著降低的生物活性的AHAS蛋白的產生。應當理解的是，如在此所使用的「非功能性AHAS蛋白」是指一種不能參與二聚體和/或四聚體的形成和/或不影響其他可以存在於細胞中的野生型或(錯義)突變AHAS蛋白的酶活性的AHAS蛋白。一種非功能性AHAS蛋白是由一種完全敲除型AHAS等位基因編碼的。一種活性AHAS蛋白由一種活性AHAS等位基因編碼的，且既可以是野生型AHAS蛋白，也可以是仍然具有生物活性但不被AHAS抑制性除草劑所抑制的突變AHAS蛋白(例如由包含錯義突變的核酸序列編碼的AHAS蛋白)，即耐除草劑的AHAS蛋白。如在此所使用的，術語「突變AHAS蛋白」是指由突變AHAS核酸序列(「AHAS等位基因」)編碼的AHAS蛋白，由此該突變導致AHAS蛋白的胺基酸序列的變化。一種突變AHAS可以是一種非功能性AHAS蛋白，由此對於生物活性所必需的胺基酸已經被置換或缺失。可替代地，一種突變AHAS蛋白可以包含一個這樣一種突變，即，通過該突變，該突變AHAS蛋白變得不可被AHAS抑制性除草劑所抑制。優選地，這樣的耐除草劑或抗除草劑的AHAS蛋白仍然能夠執行其天然功能，即支鏈胺基酸的合成。這樣的耐除草劑的突變AHAS蛋白的實例在本領域是已知的，並且描述於例如Duggleby 等人，2008 ;W009/046334、W009/031031、美國專利申請 09/0013424 中，均通過引用結合在此。包含兩種或更多種胺基酸置換的耐除草劑的突變AHAS蛋白例如描述於W008/124495中，也通過引用結合在此。表I :耐除草劑的胺基酸置換的概述是AHAS蛋白及其引用，均結合在此(所有位置均相對於擬南芥AHAS胺基酸序列而被標準化，即對應於SEQID NO: 2)
權利要求
1.一種在其基因組中包含至少一種突變AHAS等位基因的植物，所述AHAS等位基因是完全敲除型AHAS等位基因。
2.如權利要求I所述的植物，其中所述完全敲除型等位基因包含一個終止密碼子突變。
3.如權利要求I或2所述的植物，其中所述完全敲除型等位基因選自下組，該組由以下各項組成 a)—種包含在對應於SEQID NO: I的核苷酸871-873或SEQ ID NO: 3的核苷酸826-828的位置上的終止密碼子的核苷酸序列； b)一種包含在對應SEQ ID NO: I的核苷酸862-864或SEQ ID NO: 5的核苷酸808-810的位置上的終止密碼子的核苷酸序列； c)一種包含在對應於SEQ ID NO: I的核苷酸775-777或SEQ ID NO:5的核苷酸721-723的位置上的終止密碼子的核苷酸序列；或 d)—種包含在對應於SEQID NO: I的核苷酸799-801或SEQ ID NO: 5的核苷酸745-747的位置上的終止密碼子的核苷酸序列。
4.如權利要求I至3的任一項所述的植物，進一步在其基因組內包含至少一個第二突變AHAS等位基因，所述第二突變AHAS等位基因編碼耐除草劑的AHAS蛋白。
5.如權利要求3或4所述的植物，其中所述耐除草劑的AHAS蛋白包含一個在對應於SEQ ID NO: 2的197位或SEQ ID NO:4的182位或SEQID NO:6的179位的一個位置上的絲氨酸。
6.如權利要求4或5所述的植物，其中所述耐除草劑的AHAS蛋白包含至少兩個胺基酸置換。
7.如權利要求4至6的任一項所述的植物，其中所述耐除草劑的AHAS蛋白包含一個與SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:6具有至少90%的序列一致性的胺基酸序列。
8.如權利要求I至7的任一項所述的植物，其中所述AHAS等位基因包含與SEQIDNO: I、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:5 至少 90% 的序列一致性。
9.如權利要求I至8的任一項所述的植物，選自由芥菜型油菜、甘藍型油菜、白菜型油菜、衣索比亞芥、甘藍和黑芥組成的組。
10.一種如權利要求I至9的任一項所述的植物的植物細胞、種子或子代。
11.一種選自下組的芸苔屬種子，該組由以下各項組成 a)已經於2009年12月17日以登錄號NCMB41690保藏在NCMBLimited中的包含AHASI-HETOl 12的芸苔屬種子； b)已經於2009年12月17日以登錄號NCMB41687保藏在NCMBLimited中的包含AHAS3-HET0102的芸苔屬種子； c)已經於2009年12月17日以登錄號NCMB41688保藏在NCMBLimited中的包含AHAS3-HET0103的芸苔屬種子； d)已經於2009年12月17日以登錄號NCMB41689保藏在NCMBLimited中的包含AHAS3-HET0104的芸苔屬種子。
12.—種從權利要求11所述的種子獲得的芸苔屬植物，或其細胞、部分、種子或子代。
13.—種編碼完全敲除型AHAS等位基因的核酸分子。
14.如權利要求13所述的核酸分子，包括一種終止密碼子突變。
15.如權利要求13或14所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列選自下組，該組由以下各項組成 a)—種包含在對應於SEQID NO: I的核苷酸871-873或SEQ ID NO: 3的核苷酸826-828的位置上的終止密碼子的核苷酸序列； b)—種包含在對應於SEQID NO: I的核苷酸862-864或SEQ ID NO: 5的核苷酸808-810的位置上的終止密碼子的核苷酸序列； c)一種包含在對應於SEQ ID NO: I的核苷酸775-777或SEQ ID NO: 5的核苷酸721-723的位置上的終止密碼子的核苷酸序列；d)—種包含在對應於SEQID NO: I的核苷酸799-801或SEQ ID NO: 5的核苷酸745-747的位置上的終止密碼子的核苷酸序列；
16.如權利要求13至15的任一項所述的核酸，包含一種與SEQID NO: 1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列。
17.一種用於將至少一種選自本發明的完全敲除型AHAS等位基因從一種植物轉移到另一種植物的方法，包括以下步驟 a)鑑定包含至少一種選擇的如權利要求13至16的任一項所述的完全敲除型AHAS等位基因的第一種植物，或產生包含至少一種選擇的如權利要求13至16的任一項所述的完全敲除型AHAS等位基因的第一種植物； b)使該第一種植物與不包含該至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因的第二種植物雜交，然後從雜交體收集Fl雜交種子； c)任選地，鑑定包含該至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因的Fl植物； d)使包含該至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因的Fl植物與不包含該至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因的第二種植物回交至少一代(X)，並且從雜交體中收集BCx種子；並且 e)鑑定包含該至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因的每一代BCx植物。
18.一種將如權利要求13至16的任一項所述的完全敲除型AHAS等位基因與除草劑耐受型AHAS等位基因結合在一種植物中的方法，該方法包括以下步驟 a)產生和/或鑑定至少一種包含至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因的植物和至少一種包含至少一種選擇的除草劑耐受型AHAS等位基因的植物； b)使這至少兩種植物雜交,並且從至少一個雜交體收集Fl雜交種子；並且 c)任選地，鑑定一種包含至少一種選擇的完全敲除型AHAS等位基因和至少一種選擇的除草劑耐受型AHAS等位基因的Fl植物。
19.一種用於生產如權利要求I至9的任一項所述的植物的方法，包括根據權利要求17或18將突變AHAS等位基因結合在和/或轉移到一株植物中。
20.一種增加植物的除草劑耐受性的方法，包括將至少一種完全敲除型AHAS等位基因與至少一種除草劑耐受型AHAS等位基因結合在所述植物的基因組DNA中。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述完全敲除型等位基因選自下組，該組由以下各項組成 a)—種包括在對應於SEQ ID NO: I的核苷酸871-873或SEQ ID NO: 3的核苷酸826-828的位置上的終止密碼子的核苷酸序列； b)—種包括在對應於SEQID NO: I的核苷酸862-864或SEQ ID NO:5的核苷酸808-810的位置上的終止密碼子的核苷酸序列； c)一種包括在對應於SEQ ID NO: I的核苷酸775-777或SEQ ID NO: 5的核苷酸721-723的位置上的終止密碼子的核苷酸序列； d)—種包括在對應於SEQID NO: I的核苷酸799-801或SEQ ID NO: 5的核苷酸745-747的位置上的終止密碼子的核苷酸序列。
22.如權利要求20或21所述的方法，其中所述完全敲除型等位基因包含一種與SEQIDNO: I、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列。
23.一種用於控制在作物植物附近的雜草的方法，包括以下步驟 a)將由如權利要求4至9的任一項所述的植物產生的種子種植在田間； b)對在田間的雜草和作物植物施用有效量的AHAS抑制性除草劑以控制雜草。
24.如權利要求23所述的方法，還包括在步驟a)之前向所述田間施用有效量的AHAS抑制性除草劑的步驟。
25.一種用於處理如權利要求4至9的任一項所述的植物的方法，其特徵在於用一種或多種AHAS抑制性除草劑處理所述植物。
26.如權利要求25所述的方法，其中所述AHAS抑制性除草劑選自由磺醯脲類、咪唑啉酮類、磺醯氨基羰基三唑啉酮類、三唑並嘧啶類和嘧啶基(氧代/硫代)苯甲酸酯類組成的組。
27.如權利要求23至26的任一項所述的方法，其中所述AHAS抑制性除草劑是4_ [(4，5-二氫-3-甲氧基-4-甲基-5-氧代-1H-1，2，4-三唑-I-基)羰基氨磺醯]_5_甲基噻吩-3-羧酸甲酯。
28.如權利要求23至27的任一項所述的方法，其中所述植物對於施用至少5.O克4_ [(4，5-二氫-3-甲氧基-4-甲基-5-氧代-1H-1，2，4-三唑-I-基)羰基氨磺醯]_5_甲基噻吩-3-羧酸甲酯有效成分/公頃是耐受的。
29.如權利要求17至28的任一項所述的方法，其中所述植物選自由芥菜型油菜、甘藍型油菜、白菜型油菜、衣索比亞芥、甘藍和黑芥組成的組。
30.如權利要求13至16的任一項所述的一種完全敲除型AHAS等位基因用於獲得一種耐除草劑的植物的用途。
31.如權利要求I至9的任一項或權利要求12所述的植物用於生產包含一種或多種完全敲除型AHAS等位基因的種子的用途。
32.如權利要求I至9的任一項或權利要求12所述的植物用於生產包含一種或多種完全敲除型AHAS等位基因的油菜作物的用途。
全文摘要
本發明涉及包含完全敲除型AHAS等位基因的芸苔屬植物，並且涉及包含一種完全敲除型AHAS等位基因與編碼耐除草劑的AHAS蛋白的AHAS等位基因的結合的芸苔屬植物、代表完全敲除型AHAS等位基因的核酸序列、以及用於產生和鑑定所述植物和等位基因的方法，用來獲得耐除草劑的植物。
文檔編號A01H5/10GK102666859SQ201080058512
公開日2012年9月12日 申請日期2010年12月6日 優先權日2009年12月22日
發明者R·魯伊特, T·戈爾茲 申請人:拜爾作物科學公司