穀氨酸脫羧酶基因及其應用的製作方法

2023-07-23 10:36:41 3

專利名稱：穀氨酸脫羧酶基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種穀氨酸脫羧酶基因及其應用，屬於基因工程技術領域。
背景技術：
γ-氨基丁酸(Y-Aminobutyric acid，簡稱 GABA)，由穀氨酸(Glutamic acid, Glu)經穀氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase,簡稱GAD)催化脫羧而來。Y -氨基丁酸是哺乳動物中樞神經系統中的重要的抑制性神經遞質。具有重要的生理功能，已報導的生理活性有調節血壓、促使精神安定、促進腦部血流、增進腦活力、營養神經細胞、增加生長激素分泌、健肝利腎、預防肥胖、促進乙醇代謝(醒酒)、改善更年期綜合症等多種功效。目前利用基因工程技術過量表達穀氨酸脫羧酶基因，來進一步提高GABA的產量的研究已有相關報導。在這個研究領域中，主要是將這些來源於GABA積累菌株的穀氨酸脫羧酶基因導入到大腸桿菌或枯草芽孢桿菌的某個野生型菌株中，並使穀氨酸脫羧酶在宿主菌中得到高效表達，從而增強宿主菌生產GABA的能力，但是採用該方法生產GABA，需要加入大量L-穀氨酸或L-穀氨酸鈉作為前體物質，而L-穀氨酸或L-穀氨酸鈉通常由穀氨酸棒桿菌發酵產生。因此，現有技術生產GABA的過程複雜且生產成本高。

發明內容
本發明提供了一種穀氨酸脫羧酶基因gadB2，該基因是根據基因組全序列已公布的短乳桿菌ATCC 367的穀氨酸脫羧酶基因為參照設計引物，以篩選出的短乳桿菌CCTCC NO =M 2010367的基因組為模板，利用PCR技術將其基因組中編碼穀氨酸脫羧酶的基因 gadB2擴增出來，並進行基因測序，其核苷酸序列如Seq ID NO .1。本發明還提供了一種穀氨酸脫羧酶基因gadCB2，該基因除了含有穀氨酸脫羧酶的基因gadB2外，還含有與gadB2相連的編碼穀氨酸/ Y -氨基丁酸反向轉運蛋白的基因 gadC，其核苷酸序列如Seq ID NO .2。本發明還提供了一種穀氨酸脫羧酶基因gadRCB2，該基因除了含有穀氨酸脫羧酶的基因gadCB2外，還含有與gadCB2相連的編碼正轉錄調控蛋白的gadR基因，其核苷酸序列如 Seq ID NO . 3。所述穀氨酸脫羧酶基因gadB2、gadCB2、gadRCB2均來源於短乳桿菌CCTCC NO M 2010367。所述短乳桿菌CCTCC NO =M 2010367為從本實驗室系列乳酸菌中利用紙層析方法篩選出一株產Y-氨基丁酸的乳酸菌，已於2010年12月27日，保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢、武漢大學，保藏編號CCTCC NO =M 2010367，分類學命名短乳杆 |if Lb85 {,Lactobacillus brevis Lb85)。為構建GABA生產菌株，將gadB2、gadCB2、gadRCB2基因分別連接到載體上，構建出三種穀氨酸脫羧酶重組表達質粒pDXW8-gadB2、pDXW8_gadCB2、pDXW8_gadRCB2 ；將三種重組質粒通過電轉化的方法導入到穀氨酸棒桿菌ATCC13032中，得到三株重組穀氨酸棒桿菌pDXW8-gadB2/ATCC13032、pDXW8-gadCB2/ATCC13032 和 pDXW8_gadRCB2/ATCC13032。所述表達載體為大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭型誘導表達載體PDXW-8 (專利申請號 200910233618. 1)。所述穀氨酸棒桿菌ATCC13032購自ATCC，該菌株具有積累穀氨酸的能力。發酵液中GABA的精確定量胺基酸自動分析儀法。用5%三氯乙酸將發酵液稀釋 25倍後靜止30min，12000rpm離心IOmin沉澱蛋白，取上清液，用日立L835-50型胺基酸自動分析儀檢測。胺基酸自動分析儀採用2619#樹脂(陽離子交換柱f2.6X150mm)，53°C分析，GABA用外標法定量。本發明將來源於野生菌的穀氨酸脫羧酶基因導入穀氨酸棒桿菌中，構建了穀氨酸棒桿菌基因工程菌，該菌株以葡萄糖作為碳源、尿素等無機氮作為氮源，相對於需要外源添加L-穀氨酸或L-穀氨酸鈉為前體物質的生物轉化，生產成本明顯降低。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發明，下列實施例用於說明目的而非用於限制本發明範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊所述的條件進行操作。材料和試劑
所用限制性內切酶，T4 DNA連接酶，PCR試劑等均購於TaKaRa寶生物公司；大腸桿菌 JM109購自天根生物公司；引物，質粒提取試劑盒，PCR產物純化試劑盒均購於上海生工生物工程公司；電轉儀購自Bio-Rad公司；其他試劑均為國內或國外購買的分析純試劑。實施例一穀氨酸脫羧酶基因gadB2的獲得
從本實驗室系列乳酸菌中利用紙層析方法篩選出一株產Y-氨基丁酸的乳酸菌，通過鏡檢和16SrDNA鑑定，證實與GenBank中公布的各種短乳桿菌的16SrDNA的同源性為99%， 從而確定該菌株為短乳桿菌。所述短乳桿菌已於2010年12月27日，保藏於中國典型培養物保藏中心， 地址中國武漢、武漢大學，保藏編號CCTCC NO =M 2010367，分類學命名短乳桿菌 Lb85 {,Lactobacillus brevis Lb85)。根據基因組全序列已公布的短乳桿菌ATCC 367的穀氨酸脫羧酶基因LVIS_0079 為參照設計引物，以篩選出的這株產GABA的短乳桿菌CCTCC NO =M 2010367的基因組為模板，利用PCR技術將其基因組中編碼穀氨酸脫羧酶的基因gadB2擴增出來，並進行基因測序，其核苷酸序列如Seq ID NO . 1。上遊引物B2F:
5' -CTAGCTAGCAGAAGGAGATATAGGATGAATAAAAACGATCAGGAAACACAG-3』 下遊引物B2R:
5， -GATAAGCTTTTAACTTCGAACGGTGGTCTTG-3』
實施例二 重組穀氨酸棒桿菌pDXW8-gadB2/ATCC13032的構建 1.將gadB2與pDXW-8用同樣的兩種限制性內切酶Nhel、HindIII進行雙酶
切，分別回收1. 46kb和9. 48kb酶切片段，然後將這兩個片段用T4 DNA連接酶連接，並轉化到大腸桿菌JM109中完成pDXW8-gadB2重組質粒的構建；2.將重組質粒pDXW8-gadB2經電轉化的方法導入到穀氨酸棒桿菌ATCC13032
感受態中，得到重組穀氨酸棒桿菌pDXW8-gadB2/ATCC13032。穀氨酸棒桿菌ATCC13032感受態的製備。將穀氨酸棒桿菌ATCC13032單菌落於液體LBG培養基(10g/L蛋白腖，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，5g/L葡萄糖)中30°C培養過夜， 隨後以10%的接種量轉接於30mL感受態培養基(10g/L蛋白腖，5g/L酵母粉，10g/L NaCl, 25g/L甘氨酸，0. 1% Tween-80)中，30°C培養3-5h，之後將菌液置於冰水浴冷卻15min，離心棄上清，將細胞懸浮於30mL冰冷的10%甘油中，再次離心棄上清，並用10%甘油重複洗滌2 次，最後用400μ L 10%的冷甘油重懸細胞，分裝後於_70°C保存或直接用於電轉化。 實施例三穀氨酸脫羧酶基因gadCB2的獲得
根據基因組全序列已公布的短乳桿菌ATCC 367的gadC-gadB2基因 LVIS_0078-LVIS_0079為參照設計引物，以篩選出的這株產GABA的短乳桿菌CCTCC NO =M 2010367的基因組為模板，利用PCR技術將其基因組中編碼穀氨酸脫羧酶的基因gadCB2擴增出來，並進行基因測序，其核苷酸序列如Seq ID NO .2。上遊引物CB2F:
5' -CTACTCGAGAGAAGGAGATATACCATGGATGAAAATAAGTCTGAACAGC-3』 下遊引物B2R:
5， -GATAAGCTTTTAACTTCGAACGGTGGTCTTG-3』 實施例四重組穀氨酸棒桿菌pDXW8-gadCB2/ATCC13032的構建
1.將gadCB2與pDXW-8用同樣的兩種限制性內切酶Xhol、HindIII進行雙酶切，分別回收3. 02kb和9. 51kb酶切片段，然後將這兩個片段用T4 DNA連接酶連接，並轉化到大腸桿菌JM109中完成pDXW8-gadCB2重組質粒的構建；
2.將重組質粒pDXW8-gadCB2經電轉化的方法導入到穀氨酸棒桿菌 ATCC13032感受態中，得到重組穀氨酸棒桿菌pDXW8-gadCB2/ATCC13032。實施例五穀氨酸脫羧酶基因gadRCB2的獲得
根據基因組全序列已公布的短乳桿菌ATCC 367的gadR-gadC-gadB2基因 LVIS_0077-LVIS_0078-LVIS_0079為參照設計引物，以篩選出的這株產GABA的短乳桿菌 CCTCC NO =M 2010367的基因組為模板，利用PCR技術將其基因組中編碼穀氨酸脫羧酶的基因gadRCB2擴增出來，並進行基因測序，其核苷酸序列如Seq ID NO .3。上遊引物RCB2F:
5' -CTAGCTAGCAGAAGGAGATATACCATGGAATCCAGAACTAAGGAAAGG-3』 下遊引物B2R:
5， -GATAAGCTTTTAACTTCGAACGGTGGTCTTG-3』 實施例六重組穀氨酸棒桿菌pDXW8-gad RCB2/ATCC13032的構建
1.將gad RCB2與pDXW-8用同樣的兩種限制性內切酶Nhel、HindIII進行雙酶切，分別回收3. Slkb和9. 48kb酶切片段，然後將這兩個片段用T4 DNA連接酶連接，並轉化到大腸桿菌JM109中完成pDXW8-gadRCB2重組質粒的構建；
2.將重組質粒pDXW8-gadRCB2經電轉化的方法導入到穀氨酸棒桿菌 ATCC13032感受態中，得到重組穀氨酸棒桿菌pDXW8-gad RCB2/ATCC13032。實施例七重組穀氨酸棒桿菌發酵生產GABA培養基種子培養基(葡萄糖2. 5%，尿素0. 6%，玉米漿3. 0%，K2HPO4 · 3H20 0. 15%， MgSO4 · 7H20 0. 05%, pH 7. 0 7. 5)；發酵培養基(葡萄糖16%，尿素0. 4%，玉米漿0. 3%， K2HPO4 · 3H20 0. 2%, MgSO4 · 7H20 0. 08%, MnSO4 2mg/L, FeSO4 2mg/L, pH 7· 0 7· 5)
培養條件重組穀氨酸棒桿菌在種子培養基中30°C振蕩培養12h後，以10%的接種量轉接到發酵培養基中進行發酵，在發酵12h時加入ImM IPTG誘導，並在隨後的24h之內通過間歇性添加尿素的方法使培養基PH值控制在中性範圍，之後繼續發酵至60h， 測定發酵液中Y-氨基丁酸含量。經檢測重組菌 pDXW8-gadB2/ATCC13032、pDXW8_gadCB2/ATCC13032、 pDXW8-gadRCB2 /ATCC13032發酵60h的發酵液中Y -氨基丁酸的產量分別為7. 25mM、 6. 99mM和6. 28mM,野生菌ATCC13032發酵液中未檢出Y -氨基丁酸。序列表
江南大學
穀氨酸脫羧酶基因及其應用 9
PatentIn version 3.5
1
1440
DNA
Seq ID NO · 1

擴增得到基因序列 1
atgaataaaa acgatcagga aacacagcag atgattaata atgtggattt agaaaaaacg60
tttttaggca gtgtcgaagc cgggcaatcc ttacccacca atacattacc agatgatccc120
atggcaccgg atgttgccgc tcaattggtg gaacactatc gtttaaatga agccaaggct180
aatcaaaacc tggcgacctt ctgtaccaca caaatggaac cacaagccga tgaattaatg240
aagaacgcgt tgaataccaa tgcgattgat aaatcggaat accctaagac cgcggcaatg300
gaaaattact gtggcagcat gattgctcac ctatggggaa ttcctgacaa tgaaaagatt360
tacgatgatt tcattgggac ctcaacggta ggttcttctg aaggatgtat gttaggcggc420
ttggcgctac tacatagttg gaagcaccgg gccaaggcag ctggttttga tattgaagac480
ctgcatagcc acaagcccaa cttggtcatc atgtcaggtt accaagttgt ttgggaaaag540
ttctgtacct attggaatgt cgagatgcgc caagtgccaa ttaatggtga ccaagtttcc600
ttagatatgg atcatgtgat ggattatgtt gatgaaaata cgattgggat tatcggaatt660
gagggcatta cgtacacagg ctccgttgat gatattcaaa cgctagataa cctcgtgacc720
gaatataata agaccgcgac gatgccggta cggattcacg ttgatgctgc ctttggtggc780
ctgttcgcgc cgttcgtcga tggctttaac ccgtgggact tccggttgaa gaacgtggtt840
tccattaacg tttcgggcca taagtacggg atggtttacc ctgggttggg gtggattgtt900
tggcggcaca acacggctga tattttaccc gcagaaatgc ggttccaagt gccatatcta960
ggtaagaccg ttgattcaat cgccattaac ttctcacaca gtggtgccca tatcagtgcg1020caatactaca atttcattcg atttggattg tcaggttaca agacgatcat gcaaaatgtt1080
cggaaggtgt cattgaagct gacggcagct ctgaaaacgt atgggatttt cgatatttta1140
gttgatgggt cacagctacc aattaactgt tggaaactag cggacgatgc gccggttggt1200
tggacgttgt atgatttgga gtccgagctg gctaagtatg gttggcaagt tccggcatat1260
ccactgccaa agaatcgcga cgatgtgaca attagccgga tcgtggtacg cccatccatg1320
accatgacga ttgccgatga tttcttggat gatttgaaat tagcaattga tggattaaat1380
cacacatttg gcgtgacgac caccgttgat caagataaca agaccaccgt tcgaagttaa1440 〈210〉 2 〈211〉 3001 〈212〉 DNA 〈213〉Seq ID NO . 2 〈220〉
〈223〉擴增得到基因序列 〈400〉 2
gtggatgaaa ataagtctga acagcaaatt gatacgcaaa aggcaaatcg aataacgggc60
tttcagttat tttccatgac gacttccatg gtcatgacgg tttacggttt tgcggcattt120
gctaagcaag gaccaaccgc tttcttttac ctgtttttag ccgggatctt atggttttta180
ccggtgactc ggacctcagg agagatggcg tccatcgatg gctggagtaa aggcggtatc240
tttacttggt cacggaatat gttaggtgaa cgcgccggtt ggtcggcatt attctaccaa300
tggattcaca ttacggttgg gatgaataca atgatgtatt tcattatcgg ctgtttttcg360
gtaacgtttg gcttacccat tatcacgg at aacccgttag ttaagtttat tttgaggatg420
atcattttat ggggccttat ctttctacag caaaaaggaa cgagtgttac cggtaagatt480
gcccaatggt gtttcacgtt aggggtgatt atcccagtct tcttcttact ctttctattt540
attttgtacc tcgtacaagg aaacccagcg atgattcacg tcaacatgca caccattttt600
ccatcgagtt ggaatgggag tgtcttagtg ggatttgttc cgtttatctt ggcttttgcc660
ggtgccgaag ggtcggcacc acacgttaag gacttggata aacctagcat ctatcctaag720
gtcatgatgg cactagcagt tgctgcgatc tgttccgata ttatcggcag tatggcaatt780
gctatgacga ttccgaataa t cagattcag ttaagtaatg ggattgttta cgcctatggg840
gccttagttg cccgctatgg tgtgggcgtg gtctttgtcg aaaagctaac agggttctta900
ttagccgttg gtgtcttggg tgaaatcagt agctgggtcg tgggtcctaa cgcggggatg960
tttgaagcag ccaaggctgg atacttacca ccgcgcttct ctaaggccaa taaatatggg1020
attgaaacca atgtcatggt ccttcaaggg gtcatcgtgt cgattgttgg ggcgctgttg1080
已cgtttgggg ctggcgggaa caaggcgagc ctttccttcc agactgcaat gagtttgacg1140
gtagccttat acaccttgat gtatatgctg atgtttatta gttatttggt cttacagttc1200
aagtatgtcg atttgcatcg ggactttgtg gccgctaagt cgcgttggtt gcggatcact1260
tacggtatcc tagggtttat tttatcggcc tttggatttg tcgtgacctt cttcccgcca1320
gcagatttat ccgttgcctc aaaacacacg tacctaatgt tgttagtgag tgcctttgtg1380
gtcatgctcg ttttgccatt tatcttgtac cgtttccacg acaaatgggc cttgcagcta1440
ggggtcaat g tggatgaagt ggcagcaccg accggtcatg aggcgttgga aaaagaaacc1500aagtagtgaa aaataattaa ggaggcaagc catatcgcaa tacggatatg acgactatat1560
aatgaataaa aacgatcagg aaacacagca gatgattaat aatgtggatt tagaaaaaac1620
gtttttaggc agtgtcgaag ccgggcaatc cttacccacc aatacattac cagatgatcc1680
catggcaccg gatgttgccg ctcaattggt ggaacactat cgtttaaatg aagccaaggc1740
taatcaaaac ctggcgacct tctgtaccac acaaatggaa ccacaagccg atgaattaat1800
gaagaacgcg ttgaatacca atgcgattga taaatcggaa taccctaaga ccgcggcaat1860
ggaaaattac tgtggcagca tgattgctca cctatgggga attcctgaca atgaaaagat1920
ttacgatgat ttcattggga cctcaacggt aggttcttct gaaggatgta tgttaggcgg1980
cttggcgcta ctacatagtt ggaagcaccg ggccaaggca gctggttttg atattgaaga2040
cctgcatagc cacaagccca acttggtcat catgtcaggt taccaagttg tttgggaaaa2100
gttctgtacc tattggaatg tcgagatgcg ccaagtgc ca attaatggtg accaagtttc2160
cttagatatg gatcatgtga tggattatgt tgatgaaaat acgattggga ttatcggaat2220
tgagggcatt acgtacacag gctccgttga tgatattcaa acgctagata acctcgtgac2280
cgaatataat aagaccgcga cgatgccggt acggattcac gttgatgctg cctttggtgg2340
cctgttcgcg ccgttcgtcg atggctttaa cccgtgggac ttccggttga agaacgtggt2400
ttccattaac gtttcgggcc ataagtacgg gatggtttac cctgggttgg ggtggattgt2 460
ttggcggcac aacacggctg atattttacc cgcagaaatg cggttccaag tgccatatct2520
aggtaagacc gttgattcaa tcgccattaa cttctcacac agtggtgccc atatcagtgc2580
gcaatactac aatttcattc gatttggatt gtcaggttac aagacgatca tgcaaaatgt2640
tcggaaggtg tcattgaagc tgacggcagc tctgaaaacg tatgggattt tcgatatttt2700
agttgatggg tcacagctac caattaactg ttggaaacta gcggacgatg cgccggttgg2760
ttggacgttg tatgatttgg agtcc gagct ggctaagtat ggttggcaag ttccggcata2820
tccactgcca aagaatcgcg acgatgtgac aattagccgg atcgtggtac gcccatccat2880
gaccatgacg attgccgatg atttcttgga tgatttgaaa ttagcaattg atggattaaa2940
tcacacattt ggcgtgacga ccaccgttga tcaagataac aagaccaccg ttcgaagtta3000 a
3001
〈210〉 3
〈211〉 3785
〈212〉 DNA
〈213〉Seq ID NO . 3
〈220〉
〈223〉擴增得到基因序列 〈400〉 3
atggaatcca gaactaagga aaggctgggg gcaacgttgc agcgtctaac cgatgatgaa60
caatttgata cgatcacggt taaacggcta gttttggaaa gccatgttaa tcgacagaca120
ttttattatc atttccaaga taaatttgat tgtctgcagt atcagttcga tcgcgaggca180
cagcggctgg tggggaaagt aacggccgac aactggctgg ctagttatct gagcttgttt240
cgctacattg atgcgcatca gaacttttgt catcacgtcg tcgattctca tgcttattcg300gaatttgatg attttatctt ggaaacgatc gatctgatcg tagagcgatt aaaccagagt360
ctgaagcagg catgtccgca gttacatttc cgcaatgaat cgggtctatt actatttgag420
tatggcttac aggggattgt tcgcaattgg tttcgcagtg gcctccgaga aaatccggct480
ttggtcgttg aggggatcgg accggttagc cagcggcaat tggccatgtt attagaaaca540 gaaagtctgc tcaccaaagt atcagtcaaa caacaactgg catctgtcta gcacttatac600
ataacccagt ctctgtctat tctttatttg gtacgtcagc tctactctta gggtgttaac660
acggaatcac cattggtggt ggttcacaat tattcggccg aataatgagt tcccaaattg720
aaaccgctgt cacttgtgct taattgacac cgcttcgttt ggttgtgaag ggattgtgta780
gcaagtggat gaaaataagt ctgaacagca aattgatacg caaaaggcaa atcgaataac840
gggctttcag ttattttcca tgacgacttc catggtcatg acggtttacg gttttgcggc900
atttgctaag caaggaccaa ccgctttctt ttacctgt tt ttagccggga tcttatggtt960
tttaccggtg actcggacct caggagagat ggcgtccatc gatggctgga gtaaaggcgg1020
tatctttact tggtcacgga atatgttagg tgaacgcgcc ggttggtcgg cattattcta1080
ccaatggatt cacattacgg ttgggatgaa tacaatgatg tatttcatta tcggctgttt1140
ttcggtaacg tttggcttac ccattatcac ggataacccg ttagttaagt ttattttgag1200
gatgatcatt ttatggggcc ttatctttct acagcaaaaa ggaacgagtg ttaccggtaa1 260
gattgcccaa tggtgtttca cgttaggggt gattatccca gtcttcttct tactctttct1320
atttattttg tacctcgtac aaggaaaccc agcgatgatt cacgtcaaca tgcacaccat1380
ttttccatcg agttggaatg ggagtgtctt agtgggattt gttccgttta tcttggcttt1440
tgccggtgcc gaagggtcgg caccacacgt taaggacttg gataaaccta gcatctatcc1500
taaggtcatg atggcactag cagttgctgc gatctgttcc gatattatcg gcagtatggc1560
aattgctatg acgattccga ataat cagat tcagttaagt aatgggattg tttacgccta1620
tggggcctta gttgcccgct atggtgtggg cgtggtcttt gtcgaaaagc taacagggtt1680
cttattagcc gttggtgtct tgggtgaaat cagtagctgg gtcgtgggtc ctaacgcggg1740
gatgtttgaa gcagccaagg ctggatactt accaccgcgc ttctctaagg ccaataaata1800
tgggattgaa accaatgtca tggtccttca aggggtcatc gtgtcgattg ttggggcgct1860
gttgacgttt ggggctggcg ggaacaaggc gagcctttcc ttccagactg caatgagttt1920
gacggtagcc ttatacacct tgatgtatat gctgatgttt attagttatt tggtcttaca1980
gttcaagtat gtcgatttgc atcgggactt tgtggccgct aagtcgcgtt ggttgcggat2040
cacttacggt atcctagggt ttattttatc ggcctttgga tttgtcgtga ccttcttccc2100
gccagcagat ttatccgttg cctcaaaaca cacgtaccta atgttgttag tgagtgcctt2160
tgtggtcatg ctcgttttgc catttatctt gtaccgtttc cacgacaaat gggccttgca2220
gctaggggtc aatgtggatg aagtggcagc accgaccggt catgaggcgt tggaaaaaga2280
aaccaagtag tgaaaaataa ttaaggaggc aagccatatc gcaatacgga tatgacgact2340
atataatgaa taaaaacgat caggaaacac agcagatgat taataatgtg gatttagaaa2400
aaacgttttt aggcagtgtc gaagccgggc aatccttacc caccaataca ttaccagatg2460
atcccatggc accggatgtt gccgctcaat tggtggaaca ctatcgttta aatgaagcca2520
aggctaatca aaacctggcg accttctgta ccacacaaat ggaaccacaa gccgatgaat2580
taatgaagaa cgcgttgaat accaatgcga ttgataaatc ggaataccct aagaccgcgg2640caatggaaaa ttactgtggc agcatgattg ctcacctatg gggaattcct gacaatgaaa 2700 agatttacga tgatttcatt gggacctcaa cggtaggttc ttctgaagga tgtatgttag 2760 gcggcttggc gctactacat agttggaagc accgggccaa ggcagctggt tttgatattg 2820 aagacctgca tagccacaag cccaacttgg tcatcatgtc aggttaccaa gttgtttggg 2880 aaaagttctg tacctattgg aatgtcgaga tgcgccaagt gccaattaat ggtgaccaag 2940 tttccttaga tatggatcat gtgatggatt atgttgatga aaatacgatt gggattatcg 3000 gaattgaggg cattacgtac acaggctccg ttgatgatat tcaaacgcta gataacctcg 3060 tgaccgaata taataagacc gcgacgatgc cggtacggat tcacgttgat gctgcctttg 3120 gtggcctgtt cgcgccgttc gtcgatggct ttaacccgtg ggacttccgg ttgaagaacg 3180 tggtttccat taacgtttcg ggccataagt acgggatggt ttaccctggg ttggggtgga 3240 ttgtttggcg gcacaacacg gctgatattt tacccgcaga aatgcggttc caagtgccat 3300 atctaggtaa gaccgttgat tcaatcgcca ttaacttctc acacagtggt gcccatatca 3360 gtgcgcaata ctacaatttc attcgatttg gattgtcagg ttacaagacg atcatgcaaa 3420 atgttcggaa ggtgtcattg aagctgacgg cagctctgaa aacgtatggg attttcgata 3480 ttttagttga tgggtcacag ctaccaatta actgttggaa actagcggac gatgcgccgg 3540 ttggttggac gttgtatgat ttggagtccg agctggctaa gtatggttgg caagttccgg 3600 catatccact gccaaagaat cgcgacgatg tgacaattag ccggatcgtg gtacgcccat 3660 ccatgaccat gacgattgcc gatgatttct tggatgattt gaaattagca attgatggat 3720 taaatcacac atttggcgtg acgaccaccg ttgatcaaga taacaagacc accgttcgaa 3780 gttaa
3785
〈210〉 4 〈211〉 51 〈212〉 DNA
〈213〉人工合成序列B2F 〈220〉
〈223〉根據基因序列設計用於擴增 〈400〉 4
ctagctagca gaaggagata taggatgaat aaaaacgatc aggaaacaca g51
〈210〉 5 〈211〉 31 〈212〉 DNA
〈213〉人工合成序列B2R 〈220〉
〈223〉根據基因序列設計用於擴增 〈400〉 5
gataagcttt taacttcgaa cggtggtctt g31
〈210〉 6 〈211〉 49DNA
人工合成序列CB2F
根據基因序列設計用於擴增
6
ctactcgaga gaaggagata taccatggat gaaaataagt ctgaacagc49
7
31
DNA
人工合成序列B2R
根據基因序列設計用於擴增
7
gataagcttt taacttcgaa cggtggtctt g31
8
48
DNA
人工合成序列RCB2F
根據基因序列設計用於擴增
8
ctagctagca gaaggagata taccatggaa tccagaacta aggaaagg48
9
31
DNA
人工合成序列B2R
根據基因序列設計用於 擴增
9
gataagcttt taacttcgaa cggtggtctt g3權利要求
1.一種穀氨酸脫羧酶基因gadB2，核苷酸序列如kq ID NO . 1所示。
2.一種含有權利要求1所述基因的穀氨酸脫羧酶基因gadCB2，核苷酸序列如％(1 ID NO . 2所示。
3.一種含有權利要求1所述基因的穀氨酸脫羧酶基因gadRCB2，核苷酸序列如kq ID NO . 3所示。
4.一種權利要求1所述穀氨酸脫羧酶基因gadB2的應用，是將gadB2導入穀氨酸生產菌中構建基因工程菌。
5.一種權利要求2所述穀氨酸脫羧酶基因gadCB2的應用，是將gadCB2導入穀氨酸生產菌中構建基因工程菌。
6.一種權利要求3所述穀氨酸脫羧酶基因gadRCB2的應用，是將gadRCB2導入穀氨酸生產菌中構建基因工程菌。
全文摘要
本發明公開了一種穀氨酸脫羧酶基因及其應用，屬於基因工程技術領域。是將來源於短乳桿菌的穀氨酸脫羧酶基因gadB2、以及與gadB2相連的轉運蛋白基因gadC和調控蛋白基因gadR通過棒狀桿菌表達載體pDXW8導入到穀氨酸棒桿菌ATCC13032中，重組穀氨酸棒桿菌能夠將其自身積累的穀氨酸直接轉化成γ-氨基丁酸。
文檔編號C12R1/15GK102154345SQ20111002057
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月18日 優先權日2011年1月18日
發明者史鋒, 李佑新, 李永富, 李燁 申請人:江南大學