包括3202g>a突變的cyp2d6基因片段、所編碼的蛋白質片段及其應用的製作方法
2023-07-23 06:11:31 2
包括3202g>a突變的cyp2d6基因片段、所編碼的蛋白質片段及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於生物學領域，涉及CYP2D6等位基因第3202位的單鹼基突變，所述位點由G突變為A。具體地，本發明涉及包含該突變位點的核酸片段及其相應編碼的蛋白質片段、鑑定所述突變位點的試劑、檢測方法和該位點的應用，特別是鑑定該位點在指導用藥中的應用。
【專利說明】包括3202G>A突變的CYP2D6基因片段、所編碼的蛋白質片段及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物學領域，涉及CYP2D6等位基因第3202位的單鹼基突變。更具體地，本發明涉及包含該突變位點的核酸片段及其相應編碼的蛋白質片段、鑑定所述突變位點的試劑、檢測方法和鑑定該位點在指導用藥中的應用。 【背景技術】
[0002]細胞色素P4502D6 (CYP2D6)是CYP酶家族重要的成員之一。其基因位於第22號染色體上，包括9個外顯子，基因全長9432bp (GenBank註冊號M33388，外顯子區位於第1620-5909位)。人體內該細胞色素的量只佔肝臟酶總量的2%-4%，卻參與臨床上20%-30%藥物的代謝，這樣藥物包括抗抑鬱藥、抗心律失常藥、抗精神病藥、鎮痛藥、止咳藥、止吐藥、抗糖尿病藥及β受體阻滯藥等，研究其代謝多態性具有十分重要的臨床應用價值(參見參考文獻I)。
[0003]CYP2D6基因具有高度多態性。目前為止，NCBI SNP資料庫中已經收錄了超過300個突變位點。由CYP450國際命名委員命名的等位基因也已有150多個，另外還有多種新發現的突變型尚未被命名(http://www.cypalleles.k1.se/cyp2d6.htm)。每個等位基因都不同程度涉及點突變、缺失、插入、重排等，從而影響CYP2D6的活性，進而影響對藥物的代謝活性，產生不同程度的藥物效應。除去野生型CYP2D6*1外，目前研究較多且臨床意義較大的突變型主要包括以下7種:CYP2D6*2、*3、*4、*5、*10、*17、*41，其中人種分布最廣、研究最多、中國人群研究資料相對最豐富的突變型是CYP2D6*2 (28500T ;4180G>C)和CYP2D6*10 (IOOOT ；4180G>C)(參見參考文獻 1、2、3)。
[0004]根據目前的臨床研究顯示，CYP2D6基因的這種多態性是造成CYP2D6酶活性在個體之間差異顯著的主要原因，攜帶不同CYP2D6基因型的個體間可引起藥物療效的極大差異，甚至產生嚴重的藥物毒副作用或治療不充分。因此，研究CYP2D6基因多態性對藥物療效的影響將對臨床合理用藥提供重要的科學依據(參見參考文獻3、4)。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供CYP2D6基因的新的單鹼基突變位點，包含該突變位點的核酸片段、其編碼的蛋白質片段及鑑定該突變位點在用藥指導中的應用。
[0006]本發明的第一個方面是提供核酸片段，所述核酸片段包含對應於SEQ ID N0.1的第3202位的突變位點，且是SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸，其中第3202位的核苷酸是A ;或者所述核酸片段包含對應於SEQ ID N0.2的第1031位的突變位點，且是SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸，其中第1031位的核苷酸是A ;或者所述核酸片段為上述核酸片段的反向互補序列。
[0007]本發明的第二個方面是提供與含有對應於SEQ ID N0.1的第3202位或對應於SEQID N0.2的第1031位的突變位點的等位基因片段或其反向互補序列全部或部分雜交的等位基因特異性寡核苷酸，其中SEQ ID N0.1的第3202位或SEQ ID N0.2的第1031位的突變位點的核苷酸是A ;所述等位基因片段是SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸或其反向互補序列。
[0008]本發明的第三個方面是提供用於檢測和/或分析本發明的單鹼基突變的試劑盒，所述試劑盒包含本發明的核酸片段或等位基因特異性寡核苷酸，或包含能夠作為引物擴增所述單鹼基突變但不包含該單鹼基的核酸片段；所述單鹼基對應於SEQ ID N0.1的第3202位或SEQ ID N0.2的第1031位。
[0009]本發明的第四個方面是提供本發明的核酸片段或寡核苷酸在檢測CYP2D6基因突變中的應用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探針或引物；或者本發明的核酸片段或寡核苷酸用於製備檢測CYP2D6基因突變的藥物的應用；或者本發明的核酸片段或寡核苷酸用作檢測CYP2D6基因突變的檢驗標誌物的應用。
[0010]本發明的第五個方面是提供一種用藥指導，包括檢測待測樣品中CYP2D6基因的對應於SEQ ID N0.1的第3202位或SEQ ID N0.2的第1031位的單鹼基突變；根據檢測到的突變，調整由CYP2D6代謝的藥物的給藥量。
[0011 ] 本發明的第六個方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID N0.1的序列的核酸中對應於第3202位的核苷酸或分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID N0.2的序列的核酸中對應於第1031位的核苷酸。
[0012]本發明的第七個方面是提供CYP2D6蛋白或其片段或變異體，所述蛋白序列為SEQID N0.3所示的序列；所述片段或變異體包含對應於SEQ ID N0.3的第344位的穀氨醯胺，並且為SEQ ID N0.3所示的胺基酸序列的至少10個連續胺基酸。
[0013]本發明提供了包含新的單鹼基突變的CYP2D6基因和編碼序列。該基因在對應於SEQ ID N0.2的第1031位核苷酸由G突變為A (1031G>A)，從而引起其編碼的胺基酸由精氨酸突變為穀氨醯胺，即對應於SEQ ID N0.3的第344位的穀氨醯胺。該突變的CYP2D6蛋白(命名為R344Q)對藥物的代謝活性與野生型相比降低。該單鹼基突變對攜帶此突變位點的個體的用藥具有指導意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1是實施例1中的對應於本發明的SEQ ID N0.1序列的雜合子攜帶者測序圖譜，其中箭頭所指為CYP2D6基因第3202位核苷酸；
[0015]圖2是實施例2構建的雙基因表達載體pIRES-Gluc-2D6的結構示意圖譜；
[0016]圖3是實施例2中所示的CYP2D6.1(野生型)、CYP2D6.2(缺陷型突變體)、CYP2D6.10(缺陷型突變體)和本發明的R344Q蛋白針對右美沙芬及丁呋洛爾的代謝能力檢測結果，其中*表示P值<0.05 ；
[0017]圖4是實施例2中所示的CYP2D6.1(野生型)、CYP2D6.2(缺陷型突變體)、CYP2D6.10(缺陷型突變體)和本發明的R344Q蛋白針對右美沙芬代謝的典型LC-MS/MS檢測圖譜；箭頭所指處分別為底物右美沙芬(右)及其代謝產物去甲基右美沙芬(左)的信號峰；其中橫坐標表示保留時間，右美沙芬和去甲基右美沙芬的保留時間分別為7.5和4.8分鐘，縱坐標表示信號響應值cps ；
[0018]圖5是實施例2中所示的CYP2D6.1(野生型)、CYP2D6.2(缺陷型突變體)、CYP2D6.10(缺陷型突變體)和本發明的R344Q蛋白針對丁呋洛爾代謝的典型LC-MS/MS檢測圖譜；箭頭所指處分別為底物丁呋洛爾(右)及其代謝產物I』-羥基丁呋洛爾(左)的信號峰；其中橫坐標表示保留時間，丁呋洛爾和1』-羥基丁呋洛爾的保留時間分別為6.9和5.1分鐘，縱坐標表不信號響應值cps。
【具體實施方式】
[0019]通過下述【具體實施方式】說明本發明，但本
【發明內容】
不限於此。
[0020]如無其它說明，本發明的「核酸片段」由核苷酸或其類似物組成，可以是DNA、RNA或其類似物的片段；可以是單鏈或雙鏈；可以是天然的(如基因組的)或合成的。
[0021]本發明中，「突變」指在檢測的基因，即CYP2D6基因中存在與野生型CYP2D6基因序列不同的核苷酸位點。「突變位點」指鹼基發生突變的位置。在本發明中，所述突變位點是對應於SEQ ID N0.1所示序列的第3202位或SEQ ID N0.2所示序列中的第1031位。
[0022]國際P450等位基因命名委員會關於CYP2D6等位基因命名規則中規定:以CYP2D6基因組DNA參考序列(GenBank註冊號M33388)中起始密碼子ATG的第一個鹼基A作為CYP2D6等位基因的第I位(起始密碼子的第一個鹼基A位於M33388序列的第1620位)，則本發明確定的突變點位於CYP2D6等位基因的第3202位(SEQ ID N0.1)。
[0023]本
【發明內容】
涉及CYP2D6基因的非同義突變。由於該突變位點位於基因的編碼序列中，因此，本領域技術人員可知，所述突變位點既可以在基因組DNA中表現，也可以在編碼序列(即CDS)中表現。本領域技術人員根據待檢測樣品，可以在基因組DNA或mRNA水平上對該突變位點進行檢測。本申請中，SEQ ID N0.1是根據國際P450等位基因命名委員會的規定定義的本發明的CYP2D6等位基因序列，其中第3202位是本發明涉及的突變位點。SEQ ID N0.2是具有所述突變位點的CYP2D6基因的cDNA序列，其中第1031位是本發明涉及的突變位點。本領域技術人員可知，在本文中，對應於SEQ ID N0.1的第3202位位點和對應於SEQ ID N0.2的第1031位位點同義互用。
[0024]在本發明中，「等位基因特異性」指特異地與等位基因雜交，如在嚴謹條件下進行雜交，使得鑑定對應於SEQ ID N0.1所示序列的第3202位或SEQ ID N0.2所示序列的第1031位核苷酸為A。
[0025]本發明中，核苷酸和胺基酸的縮寫採用本領域公知的縮寫方式，如核苷酸中A表示腺嘌呤，G表示鳥嘌呤，C表示胞嘧啶，T表示胸腺嘧啶。胺基酸中，A表示丙氨酸，R表示精氨酸，N表示天冬醯胺，D表示天冬氨酸，C表示半胱氨酸，Q表示穀氨醯胺，E表示穀氨酸，G表示甘氨酸，H表示組氨酸，I表示異亮氨酸，L表示亮氨酸，K表示賴氨酸，M表示蛋氨酸，F表不苯丙氨酸,P表不脯氨酸，S表不絲氨酸,T表不蘇氨酸，W表不色氨酸，Y表不酪氨酸，V表示纈氨酸。[0026]本發明的內容是基於CYP2D6基因的新的單鹼基突變位點。所述突變位點是位於CYP2D6基因的編碼區內，對應於SEQ ID N0.2的第1031位，該位點由野生型的G突變為A ;此外，由該突變的CYP2D6基因編碼的蛋白的第344位由精氨酸突變為穀氨醯胺(R344Q)。
[0027]在第一個方面，本發明提供核酸片段，所述核酸片段包含對應於SEQ ID N0.1的第3202位的突變位點，且是SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸，其中第3202位的核苷酸是A ;或者所述核酸片段包含對應於SEQ ID N0.2的第1031位的突變位點，且是SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸，其中第1031位的核苷酸是A ;或者為上述核酸片段的反向互補序列。
[0028]在一種實施方式中，所述核酸片段的長度可以是如10-100、101-200、201-500或501-1000個核苷酸。優選地，所述核酸片段的長度是10-20、21-30、31-40、41-50、51-60、61-100或101-300個核苷酸。
[0029]所述突變位點可以位於所述核酸片段的任何位置。
[0030]在另一種實施方式中，所述核酸片段是SEQ ID N0.1所示的序列。
[0031]在另一種實施方式中，所述核酸片段是SEQ ID N0.2所示的序列。
[0032]在其它實施方式中，所述核酸片段可以是SEQ ID N0.14-18所示的序列。
[0033]本發明的第二個方面是提供與含有對應於SEQ ID N0.1的第3202位或對應於SEQID N0.2的第1031位的突變位點的等位基因片段或其反向互補序列全部或部分雜交的等位基因特異性寡核苷酸，其中SEQ ID N0.1的第3202位或SEQ ID N0.2的第1031位的突變位點的核苷酸是A ;所述等位基因片段是SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸或其反向互補序列。
[0034]在一種實施方式中，所述的寡核苷酸用作探針。所述探針能夠在嚴謹條件下與包含突變位點的靶序列特異性雜交。本領域技術人員已知，所述探針不需要與靶序列完全互補，只要能與靶序列特異雜交即可。在優選的實施方案中，所述雜交條件可以滿足使探針僅與靶序列特異性雜交。所述探針的長度可以是5-100個核苷酸，如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、70、80、90或100個核苷酸。所述突變位點可以出`現在探針的任何位置。在優選的實施方式中，所述突變位點出現在探針序列的中心或大約中心處。
[0035]在另一種實施方式中，所述寡核苷酸用作指導DNA合成的引物，如本領域公知的測序引物或合成引物等。所述引物不需要與模板完全互補，但應當與模板互補雜交以指導DNA合成。所述引物的長度可以是15-40個核苷酸長度，優選地為18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。所述突變位點可以出現在所述引物的任何位置；優選地，所述突變位點出現在所述引物的3』末端。
[0036]在一些優選的實施方式中，所述寡核苷酸是如SEQ ID N0.19_23所示的序列。
[0037]基於此，本發明的第三個方面是提供用於檢測和/或分析單鹼基突變的試劑盒，所述試劑盒包含本發明的核酸片段或等位基因特異性寡核苷酸，或包含能夠作為引物擴增所述單鹼基突變但不包含該單鹼基的核酸片段；所述單鹼基對應於SEQ ID N0.1的第3202位或SEQ ID N0.2的第1031位。優選地，所述試劑盒包含SEQ ID N0.6和/或SEQ IDN0.7和/或SEQ ID N0.12所示的序列片段。
[0038]本發明的第四個方面是提供本發明的核酸片段或寡核苷酸用於檢測CYP2D6基因突變的應用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探針或引物；或者本發明的核酸片段或寡核苷酸用於製備檢測CYP2D6基因突變的藥物的應用；或者本發明的核酸片段或寡核苷酸用作檢測CYP2D6基因突變的檢驗標誌物的應用。
[0039]本發明的第五個方面是提供用藥指導，包括檢測待測樣品中CYP2D6基因的對應於SEQ ID N0.1的第3202位或SEQ ID N0.2的第1031位的鹼基。當檢測到的CYP2D6基因在對應於SEQ ID N0.1的第3202位或SEQ ID N0.2的第1031位的位點為A時，相對應地調整經CYP2D6代謝的藥物的給藥量。在具體的實施例中，當CYP2D6基因在SEQ ID N0.2的第1031位的位點為A時，該基因編碼的CYP2D6蛋白酶活性下降，故需要調整經CYP2D6代謝的藥物的給藥量，如下調給藥量。
[0040]本發明中所述的經CYP2D6代謝的藥物包括:β受體阻滯劑，普萘洛爾、美託洛爾、烯丙洛爾、丁呋洛爾、噻嗎洛爾、布尼洛爾、卡維地洛、阿普洛爾、奈必洛爾；抗心律失常藥，英卡胺、司巴丁、氟卡胺、普羅帕酮、阿普林定、美西律、恩卡胺、普魯卡因胺；抗高血壓藥，異喹胍、吲哚拉明；抗心絞痛，哌克昔林、特羅地林；鎮痛藥，曲馬多；抗精神藥，氯丙嗪、奮乃靜、氟哌啶醇、利培酮、硫利達嗪、珠氯噻醇、阿立哌唑；三環類抗抑鬱藥，阿米替林、丙咪嗪、氯丙咪嗪、地昔帕明、去甲替林；其他抗抑鬱藥，氟西汀、帕羅西汀、文拉法辛、氟伏沙明、阿米夫胺、米安色林、溴法羅明、馬普替林、託莫西汀、苯丙胺、西酞普蘭、氟戊肟胺、米那普林、度洛西汀、嗎氯貝胺；止咳平喘藥，雙氫可待因、乙基嗎啡、可待因、右美沙芬；抗糖尿病藥，苯乙雙胍；其他，撲爾敏、甲氧氯普胺、阿託西汀、右旋芬氟拉明、昂丹司瓊、安非他命、利多卡因、奧坦西隆、非那西丁、三苯氯胺、右芬氟拉明、異丙嗪。
[0041 ] 本發明的第六個方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID N0.1的序列的核酸中對應於第3202位的核苷酸或分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID N0.2的序列的核酸中對應於第1031位的核苷酸。
[0042]在一種實施方式中，所述方法可以是限制性片段長度多態性分析(RFLP)。本領域技術人員可以根據本
【發明內容】
設計實驗以分析SEQ ID N0.1的序列的核酸中的第3202位的核苷酸或SEQ ID N0.2的序列的核酸中的第1031位的核苷酸是否為Α。
[0043]在另一種實施方式中，所述方法可以是測序法，包括分離並測定來自基因組DNA或RNA的核酸序列，分析其中包含對應於SEQ ID N0.1的序列的核酸中的對應於第3202位的核苷酸或包含對應於SEQ ID N0.2的序列的核酸中的對應於第1031位的核苷酸是否為Α。測序法可以是本領域已知的任何可用的測序方法。測序引物可以根據本領域技術人員的常識進行設計，如在待檢測位點的上下遊適當位置處設計引物，`以擴展包含該待測位點的片段，從而判斷該位點的核苷酸。也可以採用本發明的寡核苷酸作為引物序列。
[0044]在另一種實施方式中，所述方法是利用探針雜交的方法，特異性地鑑定檢測樣品中包含對應於SEQ ID N0.1的序列的核酸中的對應於第3202位的核苷酸或包含對應於SEQID N0.2的序列的核酸中對應於第1031位的核苷酸是否為A ;所述方法中採用的探針是本發明的寡核苷酸。例如，從待測樣品中分離出核酸，在允許探針與核酸中可能存在的特異性靶序列雜交的條件下使探針與核酸接觸；可被檢測的雜交可以通過使用由可檢測的試劑標記過的探針來實現；例如，用放射性同位素、螢光染料或能催化形成可檢測產物的酶來標記探針。標記探針、用標記探針檢測樣品中是否存在靶序列的方法都是本領域技術人員所熟知的。
[0045]在一種具體的實施方式中，提供以Taqman探針SNP檢測法檢測對應於SEQ IDN0.1的第3202位的核苷酸的方法，包括:
[0046]I)設計引物用於特異性擴增包含對應於SEQ ID N0.1的第3202位的PCR產物，同時設計兩條Taqman-MGB探針，分別針對對應於SEQ ID N0.1的第3202位的G和A等位基因。
[0047]引物設計原則為:[0048](I)序列選取應在基因的保守區段；
[0049](2)避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對，避免引物自身形成環狀發卡結構；
[0050](3)引物長度在18到24個核苷酸；
[0051](4) Tm 值在 55-65°C，GC 含量在 40%_60% ；
[0052](5 )引物之間的Tm值相差避免超過2 V ；
[0053](6)引物的3』端避免使用鹼基A，引物的3』端避免出現3個或3個以上連續相同的喊基；
[0054](7) PCR 擴增片段長度在 50bp — 150bp ；
[0055](8)引物末端最後5個核苷酸不能有超過2個的G和C。Taqman MGB探針設計原則為:
[0056](I)探針的5』端避免出現G ;
[0057](2) Tm 值應為 65-67°C ；
[0058](3)儘量縮短Taqman MGB探針 ,但探針長度不少於13bp ；
[0059](4)儘量避免出現重複的鹼基，尤其是G鹼基，避免出現4個或4個以上的G重複出現；
[0060](5)將探針的突變位點儘量放在中間1/3的地方。
[0061]螢光基團可以採用FAM、VIC等來標記兩個等位基因。
[0062]2)利用上述引物和探針，對待測樣本進行實時定量PCR。
[0063]PCR條件:95°C預變性10分鐘後進入30個擴增循環:92°C變性12秒，60°C退火及延伸I分鐘(此階段檢測螢光信號)。
[0064]3)數據分析。
[0065]分析實驗結果，根據樣本兩種螢光的強弱判定待測樣本CYP2D6基因是否存在3202G>A 突變。
[0066]本發明中，所述樣品可以是任何包含核酸的樣品，如血液；優選所述樣品來自於人。所述核酸可以是DNA或編碼RNA，優選為基因組DNA。本發明的分析核酸的方法可以以DNA或RNA為目標物。本領域技術人員可知，當以DNA為檢測目標物時，分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID N0.1的序列的核酸中對應於第3202位的核苷酸，所使用的探針或引物根據SEQ ID N0.1的序列設計；當以RNA為檢測目標物時，分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID N0.2的序列的核酸中對應於第1031位的核苷酸，所使用的探針或引物根據SEQ IDN0.2的序列設計。
[0067]本發明的第七個方面是提供CYP2D6蛋白或其片段或變異體，所述蛋白序列為SEQID N0.3所示的序列；所述片段或變異體包含對應於SEQ ID N0.3的第344位的穀氨醯胺，且為SEQ ID N0.3所示的胺基酸序列的至少10個連續胺基酸，如10_20、21_50或51-100
個胺基酸。
[0068]下面將通過具體的實施例進一步說明本發明，但以下具體的實施例僅出於示例性的目的。
[0069]實施例1:人CYP2D6基因新的突變位點的鑑定
[0070]本實施例中，採集漢族正常健康人群血液樣本，提取血液中的基因組DNA，設計測序引物對CYP2D6基因的9個外顯子進行序列擴增、測序，分析其CYP2D6基因是否存在突變位點。
[0071]I)提取 DNA:
[0072]從被測者採取5ml靜脈EDTA抗凝血液樣本；然後按照普通鹽析法和/或採用專門的DNA提取試劑盒(購自美國Omega公司的DNA提取試劑盒)提取待測血樣的基因組DNA。
[0073]2) PCR 擴增:
[0074]設計擴增引物，對獲得的基因組DNA樣品中CYP2D6基因的9個外顯子序列進行擴增。所述擴增引物對序列見表I。
[0075]採用30yL PCR反應體系，包括:I XGC PCR緩衝液、L5mM MgCl2、IOOng的基因組DNA、上下遊引物均為0.2 μ M、dNTP為0.2mM,TaKaRa公司的LATaq DNA聚合酶1.5U。使用美國ABI公司的GeneAmp PCR System9700擴增儀擴增。PCR擴增循環參數如下:94°C預變性2分鐘，94°C變性30秒，60°C退火30秒，68°C延伸3分鐘，35個循環後再延伸3分鐘。引物序列信息見表I。
[0076]表1:擴增引物對序列信息
[0077]
【權利要求】
1.核酸片段，所述核酸片段包含對應於SEQID N0.1的第3202位的突變位點，且是SEQID N0.1所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸，其中第3202位的核苷酸是A ;或者所述核酸片段包含對應於SEQ ID N0.2的第1031位的突變位點，且是SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸，其中第1031位的核苷酸是A ;或者為上述核酸片段的反向互補序列。
2.根據權利要求1所述的核酸片段，其特徵在於，所述核酸片段的長度是10-100、101-200,201-500或501-1000個核苷酸；優選地，所述核酸片段的長度是10_20、21_30、31-40,41-50,51-60,61-100或101-300個核苷酸；進一步優選地，所述核酸片段是SEQ IDN0.1、2或14-18所示的序列。
3.等位基因特異性寡核苷酸，所述寡核苷酸與含有對應於SEQID N0.1的第3202位或對應於SEQ ID N0.2的第1031位的突變位點的等位基因片段或其反向互補序列全部或部分雜交，其中SEQ ID N0.1的第3202位或SEQ ID N0.2的第1031位的突變位點的核苷酸是A ;所述等位基因片段是SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸或其反向互補序列。
4.根據權利要求3所述的等位基因特異性寡核苷酸，其特徵在於，所述寡核苷酸是探針或引物；優選地，當所述寡核苷酸是探針時，所述寡核苷酸的長度是5-100個核苷酸；當所述寡核苷酸是引物時，所述寡核苷酸的長度是15-40個核苷酸；優選地，當所述寡核苷酸是探針時，所述突變位點位於探針序列的中心或大約中心處；當所述寡核苷酸是引物時，所述突變位點位於引物的3』末端。
5.根據權利要求4所述的等位基因特異性寡核苷酸，其特徵在於，所述寡核苷酸是如SEQ ID N0.19-23所示的序列。
6.一種用於檢測和/或分析單鹼基突變的試劑盒，包括根據權利要求1或2所述的核酸片段或根據權利要求3-5任一項所述的等位基因特異性寡核苷酸，或包含能夠作為引物擴增所述單鹼基突變但不包含該單鹼基的核酸片段；所述單鹼基對應於SEQ ID N0.1的第3202位或SEQ ID N0.2的 第1031位；優選地，所述試劑盒包含SEQ ID N0.6和/或SEQ IDN0.7和/或SEQ ID N0.12所示的序列片段。
7.根據權利要求1或2所述的核酸片段或根據權利要求3-5任一項所述的等位基因特異性寡核苷酸在檢測CYP2D6基因突變中的應用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探針或引物；或者在製備檢測CYP2D6基因突變的藥物中的應用；或者用作檢測CYP2D6基因突變的檢驗標誌物的應用。
8.一種用藥指導，包括檢測待測樣品中CYP2D6基因的對應於SEQ ID N0.1的第3202位或SEQ ID N0.2的第1031位的鹼基，當所述位點的鹼基是A時，調整經CYP2D6代謝的藥物的給藥量。
9.一種分析核酸的方法，所述方法包括分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID N0.1的序列的核酸中對應於第3202位的核苷酸或分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID N0.2的序列的核酸中對應於第1031位的核苷酸；優選地，所述方法是測序法、限制性片段長度多態性分析或探針雜交法。
10.CYP2D6蛋白或其片段或變異體，所述蛋白序列為SEQ ID N0.3所示的序列；所述片段或變異體包含對應於SEQ ID N0.3的第344位的穀氨醯胺，且為SEQ ID N0.3所示的胺基酸序列的至 少10個連續胺基酸。
【文檔編號】C12Q1/68GK103451207SQ201310403281
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月6日 優先權日:2013年9月6日
【發明者】胡國新, 蔡劍平, 戴大鵬, 耿培武, 蔡傑 申請人:胡國新