維生素d衍生物結晶及其製備方法

2023-07-23 02:19:31 3

專利名稱：維生素d衍生物結晶及其製備方法
技術領域：
本發明涉及新的維生素D衍生物結晶，更具體地講，本發明涉及通過反相色譜法純化維生素D衍生物，然後將純化的衍生物於有機溶劑中結晶獲得的新的維生素D衍生物結晶。本發明還涉及維生素D衍生物的純化方法，該方法包括結晶步驟。
背景技術：
已知各種維生素D衍生物具有生理活性。例如JP 6-23185B/1994公開了可用作鈣代謝障礙引起的疾病的治療劑或者用作抗腫瘤劑的下列通式表示的1α-羥基維生素D3衍生物 其中R1表示氨基或式OR』，其中R』表示未被取代或被羥基、滷原子、氰基或醯氨基取代的具有1-7個碳原子的低級烷基，而R2表示氫原子或羥基。
作為包括在上述通式中的一種化合物，1α，25-二羥基-2β-(3-羥基丙氧基)維生素D3(也稱作ED-71)是具有骨形成作用並因此可用作骨質疏鬆症治療劑的維生素D衍生物的一種活性形式。
一旦此類維生素D衍生物成為治療劑，就應當是高純度的並且能夠以批量並穩定地提供。因此，就需要建立一種維生素D衍生物的生產方法。
特別是，現在僅能以非晶形形式獲得ED-71並且還沒有以結晶形式分離ED-71的報導。
本發明詳述本發明的一個目的是建立一種製備高純度維生素D衍生物，特別是ED-71的方法，該方法使得以批量並穩定地提供所述產物成為可能。
本發明的另一個目的是提供一種維生素D衍生物結晶，其可以通過純化維生素D衍生物粗產物或初步純化的產物獲得。
本發明的另一個目的是提供一種維生素D衍生物的純化方法，該方法包括結晶步驟。
本發明的另一個目的是提供一種純化ED-71前體化合物的方法，該方法包括結晶步驟，並且本發明還提供了由所述方法獲得的純的前體化合物。
本發明還有一個目的是提供在維生素D衍生物合成和純化過程中二次生成的新化合物。
我們已對由前維生素D衍生物(前體)合成和純化ED-71過程中出現的下列問題進行了深入研究(1)前體中的雜質對HPLC製備純化ED-71的影響；(2)ED-71及其前維生素D衍生物(前體)對熱、光和氧的穩定性；(3)對即使在十分小的劑量下仍具有較高生理活性的ED-71的處理；以及(4)通過結晶純化ED-71的可能性。研究結果表明，我們已經發現通過下述方法可以以克水平獲得ED-71結晶，即將所述前體於甲醇中重結晶，於低溫下將重結晶的前體進行光反應，然後進行熱異構化反應，經反相HPLC純化所述異構化產物，濃縮洗脫液，然後殘餘物於乙酸乙酯中析晶並完成本發明。另外，我們已經測定了所述前體中原來含有的或者在所述光反應中形成的副產物的結構並且發現它們中的某些化合物是新的。
本發明一方面提供了下列式(I)所示化合物的結晶
本發明另一方面提供了經反相色譜法純化維生素D衍生物的粗產物或初步純化的產物，然後將純化的衍生物於有機溶劑中析晶獲得的維生素D衍生物結晶。
本發明另一方面提供了一種維生素D衍生物的純化方法，該方法包括將所述維生素D衍生物進行反相色譜純化。
本發明另一方面提供了一種維生素D衍生物的純化方法，該方法包括將所述維生素D衍生物於有機溶劑中析晶。
本發明另一方面提供了一種維生素D衍生物的純化方法，該方法包括經反相色譜法純化維生素D衍生物的粗產物或初步純化的產物，然後將純化的衍生物於有機溶劑中析晶。
本發明另一方面提供了一種下列式(II)所示化合物的純化方法 該方法包括將式(II)所示化合物的粗產物或初步純化的產物於醇中重結晶。
本發明另一方面提供了下列式(II)所示化合物的純化產物
該產物通過將式(II)所示化合物的粗產物或初步純化的產物於醇中重結晶獲得。
本發明另一方面提供了一種下列式(I)所示維生素D衍生物的純化產物的製備方法 該方法包括將下列式(II)所示化合物的粗產物或初步純化的產物於醇中重結晶， 將重結晶的式(II)化合物進行紫外光照射，然後進行熱異構化反應，得到式(I)所示維生素D衍生物，經反相色譜法純化式(I)維生素D衍生物的粗產物或初步純化的產物，並將所述式(I)維生素D衍生物於有機溶劑中析晶。
本發明另一方面提供了下列式(III)所示化合物 和下列式(IV)所示化合物 這些化合物包含在紫外光照射以及隨後進行的所述ED-71前體熱異構化反應獲得的反應混合物中。
附圖簡要說明

圖1是說明ED-71結晶結構的分子結構投影圖。
圖2是說明ED-71結晶結構的分子結構立體圖形。
圖3是說明其中關注氫鍵的ED-71結晶結構的分子結構投影圖(1)。
圖4是說明其中關注氫鍵的ED-71結晶結構的分子結構投影圖(2)。
本發明優選實施方案本文所用術語「維生素D衍生物」是指具有下列式(V)部分結構的化合物
所述維生素D衍生物優選地是下列式(VIA)、(VIB)和(VIC)所示化合物 其中R1表示(1)氨基；(2)-OR5，其中R5是低級烷基、低級鏈烯基或低級鏈炔基，其中每一個基團可以被羥基、滷原子、氰基、氨基、醯氨基或低級烷氧基取代；或者(3)低級烷基、低級鏈烯基或低級鏈炔基，其中每一個基團可以被羥基、滷原子、氰基、氨基、醯氨基或低級烷氧基取代；R2、R3和R4分別表示具有1-10個碳原子的烷基、具有2-10個碳原子的鏈烯基或者具有2-10個碳原子的鏈炔基，其中每一個基團可以被一個或多個羥基取代；和A表示硫或氧原子。
在上述取代基定義中，術語「低級」是指所述術語限定的所述基團的碳原子數，例如1-7個碳原子的烷基，分別為2-7個碳原子的鏈烯基和鏈炔基，以及1-7個碳原子的烷氧基。
所述維生素D衍生物更優選地是1α-羥基維生素D3、1α，25-二羥基維生素D3、24，25-二羥基維生素D3或者下列式(VIIA)或(VIIB)所示化合物
其中n表示1-7的整數，或者下列式(VIIIA)或(VIIIB)所示化合物 其中A表示硫或氧原子。
特別優選的維生素D衍生物是下列式(VIIA)所示化合物 其中n表示1-7的整數。
所述最優選的維生素D衍生物是下列式(IX)所示化合物
其也被稱作ED-71。
本文所用術語「結晶」以其最寬含義使用，因此不僅限於結晶體形式、晶系等。
如上所述，作為本發明最優選維生素D衍生物的ED-71結晶並不受任何物理特性的限制。但它們特別優選地是具有下列特性(1)表觀目測或螢光顯微鏡檢測為白色結晶粉末；(2)溶解度在1mg/ml濃度下乙醇中完全溶解；(3)鑑定方法IR或NMR法；(4)熔點用DSC測定，熔點為130℃或者更高；(5)吸收係數在40μg/ml乙醇濃度下在265nm下測定，ε＝16000或者更高；(6)HPLC純度以在下列條件下記錄的相對於HPLC總峰面積的ED-71峰面積為基準，純度為97％或者會更高，所述條件為DIACHROMA ODS N-20 5μm 4.6×250mm，45％乙腈-水，流速為1ml/min，220nm，1mg/ml 10μl，4-90分鐘。
本發明另一方面提供了可經反相色譜法純化維生素D衍生物的粗產物或初步純化的產物，然後將純化的衍生物於有機溶劑中析晶獲得的維生素D衍生物結晶，以及一種維生素D衍生物的純化方法，該方法包括將維生素D衍生物進行反相色譜純化和/或將純化的維生素D衍生物於有機溶劑中析晶。
本文所用術語「粗產物或初步純化的產物」是指由維生素D衍生物合成反應獲得的、在合成反應後未經純化或者立即經常規方法純化並且通常為非晶形的維生素D衍生物產物。
本文所用術語「反相色譜法」是指其中固定相極性低於流動相的色譜體系。作為所述反相色譜法，優選的是高效液相色譜法(HPLC)。
為了有效地分離所述物質，有必要對洗脫劑、柱填充物和柱填充量進行適當選擇。
所述洗脫劑的實例包括，但不僅限於，乙腈/水和乙腈/甲醇/水。用作上述洗脫劑的所述溶劑的混合比可根據下列因素而改變，例如所純化的物質以及所用柱填充物，因此，對於具體應用中所述溶劑的最佳比可由本領域普通技術人員確定。乙腈/甲醇/水的比通常在20-60/0-40/0-80(重量份)範圍內。
考慮到所述柱填充物與所純化的物質以及所用柱子的相容性，可對柱填充物的粒徑和孔徑大小作出選擇。
所述柱的填充量也可根據柱子的內徑等而改變。但是例如，當於內徑為50mm時，填充量可以是約25μg-10g，優選約25μg-3g。
對進行如上所述色譜純化所得的流份應當進行處理，分離出所述流份中含有的溶解物，然後結晶。所述分離方法包括蒸發法、冷凍乾燥法、萃取法和過濾法。根據所述物質的特性，技術人員可以由所述的這些分離方法中選擇出一種或多種與所純化的物質相適宜的方法。例如，由於蒸發法具有重現性並且ED-71不分解，因此蒸發法對於ED-71的純化在操作上是有利的。
可用於維生素D衍生物析晶的有機溶劑優選是非質子傳遞有機溶劑。所述非質子傳遞有機溶劑的實例包括酯例如乙酸乙酯、酮例如丙酮、醚例如乙醚和二異丙基醚、乙腈以及它們的混合物，優選乙酸乙酯、丙酮、乙腈及其混合物。
結晶條件可以根據下列因素而改變，例如所純化的物質以及所用溶劑，因此，對於某一具體應用的適宜條件可以由本領域普通技術人員確定。但通常，所述結晶可以在不高於30℃並且優選不高於-10℃溫度下，用比粗維生素D衍生物多1-100倍並且優選5-10倍的溶劑進行。
本發明另一方面提供了一種下列式(II)所示化合物的純化方法 該方法包括將所述化合物的粗產物或初步純化的產物於醇中重結晶，以及用所述方法純化式(II)化合物。
用於此重結晶中的所述醇為甲醇。
對於如上所述於醇中重結晶純化的式(II)所示化合物的物理特性並沒有任何意義的限定。但是，其特別優選地是具有下列特性(1)表觀目測或螢光顯微鏡檢測為白色至黃色結晶粉末；(2)溶解度在2mg/ml濃度下乙醇中完全溶解(水溶液-白色至黃色)；(3)鑑定方法IR和NMR法；(4)水含量用100mg樣品經費歇爾法測定，水含量為3.0％或者更低；(5)吸收係數在100μg/ml乙醇濃度下於282nm下測定，ε＝10000或者更高；(6)HPLC純度以在下列條件下相對於記錄的HPLC總峰面積以及HPLC中前體和unP4峰之間沒有可觀測到的峰時的式(II)所示化合物峰面積為基準，純度為85％或者更高，所述條件為DIACHROMAODS N-20 5μm 4.6×250mm，55％乙腈-水，流速為1ml/min，220nm，1mg/ml 10μl，4-70分鐘；和(7)含量在下列條件下用內標進行HPLC，含量為85％或者更高，所述條件為YMC填充物ODS A-303 5μm 4.6×250mm，55％乙腈-水，流速為1ml/min，220nm。
下列實施例用於進一步闡明本發明，但對本發明保護範圍不起限定作用。
實施例實施例12β-(3』-羥基丙氧基)-5，7-二烯膽甾-1α，3β-三醇(前體型)的合成和純化 環氧化物(1)前體型(2)將環氧化物(1)(1.00g，2.41mmol)、叔丁醇鉀(0.75g，6.68mmol)和1，3-丙二醇(20ml)的混合物於室溫下攪拌10分鐘，然後，將反應混合物加熱至內溫95℃並於此溫度下攪拌5小時。攪拌下，將反應混合物傾入到飽和氨水溶液(40ml)中。於室溫(25-35℃)下攪拌10分鐘後，在過濾器上收集形成的結晶並用蒸餾水(20ml)洗滌三次。將含水粗結晶產物(6.3g)在室溫(27-22℃)下於乙腈(20ml)中攪拌1小時。在過濾器上收集結晶並用乙腈(5ml)洗滌兩次，然後乾燥，得到所述前體化合物(2)(0.96g，產率為81％)。
在通入氬氣進行預處理之前，將如此獲得的前體化合物(2)(29.0g)加熱溶於甲醇(290ml)，然後將所得溶液趁熱經Kiriyama濾紙(4號)過濾。冷卻至室溫後，向溶液中加入晶種以誘導結晶。進一步冷卻至低於-10℃後，於過濾器上收集所生成的結晶並用29ml冷甲醇洗滌兩次，然後，將所述結晶於室溫真空下乾燥，得到22.9g純化的前體(回收率為79.1％，淨回收率為92.1％)。所述純化的前體的物理數據如下所示NMR(CD3OD)和IR(KBr)表明是所述標題化合物；TLC(CH2Cl2∶EtOH＝9∶1)展開僅呈一個點(Rf0.5)；HPLC純度(220nm)98.7％；含量97.1％(內標法)；和DSC出峰時間(min)95.6℃和163.2℃，峰最大值120.2℃。
實施例2(1R，2R)-1，25-二羥基-2-(3』-羥基丙氧基)-膽鈣化甾醇；2β-(3』-羥基丙氧基)-(1α，3β，5Z，7E)-9.10-開環膽甾-5，7，10(19)-三烯-1，3，25-三醇(ED-71)的合成和純化 前體(2)前體 ED-71在1L容器中，將實施例1所得純化的前體(2)(6.02g)溶於THF(1L)並將溶液於氬氣流中冷卻條件(內溫低於-13℃)下，經Vycor過濾器用具有高壓汞蒸汽的400W燈UV光照射150分鐘。令其升至室溫後，將反應溶液由所述容器傾入2L茄形燒瓶中，所述容器用新制的THF(100ml)洗滌，將合併的溶液回流下加熱180分鐘。將反應混合物濃縮後，所得殘餘物溶於甲醇(80ml)，以形成供分離的樣品。將經過計算並表示為所述前體的含有1.5g溶解物的20ml樣品用泵加入到製備色譜柱上，所述色譜柱內徑為50mm，長300mm並用由MitsubishiKakouki Co.市售獲得的粒徑為5μm的DIACHROMA ODS N-20裝填。45％乙腈水溶液以60ml/min的流速通過所述色譜柱，洗脫液在220和305nm下用UV-光檢測。開始進行色譜分離後約130-170分鐘內，收集到約2.4L含ED-71的流份。此連續過程再重複三次，總共得到合併的ED-71流份約9L。然後，將合併的流份用10L旋轉蒸發儀濃縮，將殘餘物溶於乙醇，將溶液再次蒸發至幹。所得殘餘物再用乙酸乙酯(20ml)處理，溶液於室溫下進行攪拌以沉澱出結晶，將懸浮液進一步冷卻至低於-10℃並在此溫度下攪拌15分鐘。濾出結晶產物，用冷乙酸乙酯(6ml)洗滌三次並於室溫真空下乾燥過夜，得到ED-71(2.17g，產率為36.1％)。
HPLC純度99.8％(220nm)，99.9％(265nm)UV(EtOH)λmax265.4nm(ε17100)DSC135.3℃(出峰(min))，122mJ/mg殘餘溶劑(GC 方法)1.24％(EtOAc)，0.24％(EtOH)IR(cm-1)3533，3417，3336，2943，2918，2862，1649，1470，1444，1416，1381，1377，1342，1232，1113，1078，1072，1045，999，974，957，955，924，910，895，868，833，796，764，663，634，594，472實施例3相關化合物的物理數據分離在所述光和熱異構化反應中形成的某些類似物並進行結構測定，然後進行表徵鑑定。並且對實施例1和2所得ED-71及其前體進行更具體的表徵鑑定。應注意的是，下列物理數據是經重結晶和類似方法進一步純化所得樣品的數據。
熔點未校正。IR譜用溴化鉀壓片法用JEOL JIR-6000測定。1H-NMR和13C-NMR譜用JEOL JNM-270EX測定。TMS用作1H-NMR內標，而CHCl3峰用作13C-NMR的標準峰。UV在室溫下於乙醇中用HITACHI U-3210測定。
實施例1所得ED-71前體的物理數據1H-NMR(ppm)0.63(3H，s)，0.96(3H，d，J20-21＝6.3Hz)，1.07(3H，s)，1.22(6H，s)，3.6-4.0(7H，m)，5.36-5.40(1H，m)，5.70-5.73(1H，m)13C-NMR(ppm)141.1，136.6，120.8，115.1，82.2，71.0，70.9，68.3，66.7，59.8，55.7，54.4，44.1，
42.9，41.3，39.0，38.3，36.3，36.0，34.6，32.0，28.8，28.7，27.9，22.9，20.7，20.5，18.6，15.8，11.7UV；λmax(ε)294.2nm(6550)，282.2nm(11300)，271.9nm(10500)，204.7nm(2420)IR(cm-1)3385，2941，2872，1471，1468，1381，1379，1327，1138，1082，1080，1053ED-71的物理數據1H-NMR(ppm)6.37(1H，d；11.4Hz)，6.05(1H，d；11.4Hz)，5.50(1H，t；2.1Hz)，5.08(1H，t；2.1Hz)，4.32(1H，d；8.9Hz)，4.26(1H，m)，3.88-3.96(1H，m)，3.85(2H，t；5.7Hz)，3.69-3.77(1H，m)，3.27(1H，dd；9.0Hz，2.8Hz)，2.78-2.83(1H，m)，2.55(1H，dd；10.6Hz，4.0Hz)，2.42(1H，bd；13.6Hz)，1.8-2.1(5H，m)，1.22(6H，s)，1.2-1.7(11H，m)，0.94(3H，d；6.3Hz)，0.9-1.1(1H，m)，0.55(3H，s)13C-NMR(ppm)144.2，143.0，132.2，124.9，117.2，111.8，85.4，71.6，71.1，68.3，66.6，61.1，56.6，56.4，45.9，44.4，40.5，36.4，36.1，31.9，29.3，29.2，29.1，27.7，23.7，22.4，20.8，18.8，11.9UV；λmax265.4nm(ε17900)m.p.134.8-135.8℃(1℃/min)，DSC137℃(出峰(min)，115mJ/mg)，TG/DTA138℃(出峰(min)，熔融乾重損失約1％，試驗樣品1.96mg)，IR(cm-1)3533，3417，3336，2943，2918，2862，1649，1470，1444，1416，1381，1377，1342，1232，1113，1078，1072，1045，999，974，957，955，
924，910，895，868，833，796，764，663，634，594，472下式所示ED-71的照射形成體 HPLC純度97.5％(220nm)1H-NMR(ppm)5.75(1H，d，J＝5.3Hz)，5.42-5.44(1H，m)，4.19(1H，q，J＝2.9Hz)，3.8-4.0(4H，m)，3.6-3.7(1H，m)，3.25(1H，dd，J＝2.6Hz，9.6Hz)，1.21(6H，s)，0.90(3H，d，J＝5.6Hz)，0.82(3H，s)，0.58(3H，s)C-NMR(ppm)141.9，136.2，123.3，115.5，82.8，77.9，71.1，67.4，64.9，61.1，57.2，49.5，46.7，44.4，43.8，41.4，37.5，36.2，35.9，32.0，29.4，29.2，28.8，22.6，21.4，20.9，18.5，18.3，8.5UV；λmax273.5nm(ε9010)IR(cm-1)3437，3383，3309，3041，2960，2935，2872，2787，1657，1641，1470，1441，1375，1257，1205，1203，1167，1128，1097，1074，1039，1011，980，935，908，885，820，781，779，723，671，613下式所示ED-71的快速形成體
HPLC純度97.6％(220nm)1H-NMR(ppm)6.65(1H，d，J-16.1Hz)，6.10(1H，d，J＝16.1Hz)，5.73(1H，d，J＝2.8Hz)，4.21-4.25(2H，m)，3.70-3.90(4H，m)，3.45(1H，dd，J＝2.4Hz，6.0Hz)，1.91(3H，s)，1.22(6H，s)，0.98(3H，d，J＝6.5Hz)，0.69(3H，s)13C-NMR(ppm)138.1，130.9，129.5，127.8，126.0，124.5，83.1，72.4，71.1，68.5，65.3，61.1，54.0，50.0，44.4，42.8，36.4，36.0，35.9，31.9，31.4，29.4，29.2，28.7，25.1，24.3，20.8，18.7，15.1，11.2UV；λmax281.4nm(ε26100)IR(cm-1)3375，2945，2875，1664，1632，1612，1468，1429，1377，1215，1157，1095，1068，957，908，879，764，710，646下式所示ED-71的前體
HPLC純度97.2％(220nm)1H-NMR(ppm)5.91，5.78(1H×2，d，J＝12Hz)，5.52(1H，d，J＝3.3Hz)，4.0-4.2(2H，m)，3.7-4.0(4H，m)，3.43(1H，dd)，1.76(3H，s)，1.22(6H，s)，0.96(3H，d，J＝6.6Hz)，0.70(3H，s)UV；λmax206nm(ε10300)IR(cm-1)3377，2949，2947，2872，1643，1470，1435，1406，1379，1377，1263，1215，1140，1119，1088，1063，1047，1032，1030，962，937，935，756，735，542實施例4ED-71的X-射線晶體結構分析用選自所述樣品粉末的結晶粉末進行ED-71 X-射線衍射試驗，部分樣品粉末也可用於實施例3中。結果發現，所述結晶是正交晶系並含有P212121空間群，晶格常數為a＝10.352(2)，b＝34.058(2)和c＝8.231(1)，並且Z＝4。由此試驗，得到2520反射數據。
結構分析如下所述進行。測定相中使用SHELXS86直接法，然後通過付裡葉映象(Fourier mapping)測定每個非氫原子的位置。對於與碳鍵合的氫原子，它們中每個的位置可用所述碳原子的位置通過計算測定。對於與氧鍵合的氫原子，它們中每個的位置可以在測定了其他每個原子的位置後通過D映象測定。
在改進了所述非氫原子和與氧鍵合的氫原子位置的精確度以及最小二乘法對所述非氫原子各向異性溫度因子以後，所述分析結果的可靠性因子共計3.9％。然而，由所述結果不能直接測定所述結晶的絕對結構，但通過進一步計算，ED-71的13、14、17和20位構象結果與膽甾醇的相應構象相同。
圖1-4分別表明了在所述分析結果的基礎上測定的ED-71的結構及其中的氫鍵。
參考實施例1ED-71結晶化合物的穩定性在10℃、25℃和40℃下，對非晶形和結晶ED-71化合物的穩定性進行試驗。用HPLC定量試驗以及吸收度和純度測定，以對所述穩定性作出評價。所述純度以HPLC中峰面積百分比表示(％P.A.R.)。所述試驗用下述方法進行(1)穩定性試驗在帶有螺絲帽的透明的10ml試管中分別精確稱取所述非晶形和結晶樣品約2mg.
所述試管用真空乾燥器和手套箱用氬氣清洗。此清洗過程不適用於下表中記作「1M(空氣)」的試管。
將所述多組試管固定於恆溫浴器中並於黑暗中靜置，所述恆溫浴器分別控制在上述溫度下。1周(1W)或兩周(2W)和1個月(1M)後，由所述恆溫浴器中取出試管並進行下列試驗和測定(2)HPLC定量試驗將5ml無水乙醇精確地加入到所述試管中，以形成樣品溶液。將1ml所述樣品溶液和1ml內標溶液精確地加入到另一試管中並將所得混合物用二氯甲烷稀釋，至總體積為20ml。此稀釋溶液記作溶液1。通過將2-氨基嘧啶溶於甲醇達到濃度為0.6mg/ml，製得所述內標溶液。
下一步，將1ml另一種用於定量試驗的標準液(通過將ED-71結晶溶於無水乙醇達到濃度為0.4mg/ml製得)和1ml所述內標溶液精確地加入到另一試管中並將所得混合物用二氯甲烷稀釋，至總體積為20ml。此稀釋溶液記作溶液2.
分別用20μl溶液1和2進行HPLC。對於每種溶液，由所述HPLC數據測定ED-71峰與內標物峰的面積比。由溶液1面積比與溶液2面積比的比值測得所述樣品中ED-71的含量。
將所述ED-71含量被上述處理之前相同樣品中的ED-71含量除，測得耐受性(survivability)(％)。
所用HPLC的條件為色譜柱；YMC A-004SIL(4.6×300mm)流動相；二氯甲烷/甲醇混合物(95/5)
流速；1ml/min檢測；UV 265nm。
(3)吸收度測定將上述「HPLC定量試驗」中製備的1ml樣品溶液用無水乙醇稀釋，達到總體積為10ml，然後將此稀釋溶液在265nm下用紫外分光光度計進行吸收度檢測。將所述吸收度轉換成E1％值，其由朗伯比爾(Lambert-Beer)定律得到並可按下列等式轉換E1％＝A/cb其中A是吸收度，c是濃度(g/100ml)，而b是經過試驗溶液的光路長度(cm)，通常為1。
(4)純度測定(4-1)正相HPLC將上述「HPLC定量試驗」中製備的1ml樣品溶液進行真空乾燥，以除去所述溶劑(無水乙醇)。將殘餘物溶於1ml二氯甲烷，用25μl此溶液進行HPLC試驗。
所用HPLC的條件為色譜柱；YMC A-004SIL(4.6×300mm)流動相；二氯甲烷/甲醇混合物(96/4)流速；1.8ml/min檢測；UV 265nm。
(4-2)反相HPLC用上述「HPLC定量試驗」中製備的25μl樣品溶液進行HPLC。
所用HPLC的條件為色譜柱；Inertsil ODS-2(5×250mm)流動相；乙腈/水混合物(55/45)流速；1ml/min檢測；UV 265nm和220nm。
所述HPLC定量試驗和純度測定的數值是兩輪的平均值。所得結果如下列表1-5所示。
表1HPLC定量試驗結果(耐受性％)

注除1M(空氣清洗)以外，所有樣品用氬氣清洗。
表2E1％

注除1M(空氣清洗)以外，所有樣品用氬氣清洗。
表3用正相HPCL測定純度(265nm下P.A.R.％)

注除1M(空氣清洗)以外，所有樣品用氬氣清洗。
表4用反相HPLC測定純度(265nm下P.A.R.％)

注除1M(空氣清洗)以外，所有樣品用氬氣清洗。
表5220nm(％)

注除1M(空氣清洗)以外，所有樣品用氬氣清洗。
由上表可以看出，在25℃和40℃下，所述結晶體比非晶體的穩定性至多高至2星期。
工業應用本發明所述維生素D衍生物結晶是具有改善的純度和穩定性以及穩定的產量的所述維生素D衍生物，並因此可用於製備含有所述維生素D衍生物的藥物。而且，本發明所述維生素D衍生物的純化方法使得以批量(克水平)並且穩定地提供高純度維生素D衍生物成為可能。另外，分別作為ED-71和ED-71前體的快速形成體和照射形成體是新的化合物並可用於維生素D衍生物合成中所進行的試驗或分析中。
權利要求
1.一種下列式(II)所示化合物的純化方法 該方法包括將式(II)所示化合物的粗產物或初步純化的產物於醇中重結晶。
2.權利要求1所述方法，其中所述醇是甲醇。
3.下列式(II)所示化合物的純化產物 該產物通過將式(II)所示化合物的粗產物或初步純化的產物於醇中重結晶獲得。
4.權利要求3所述方法，其中所述醇是甲醇。
5.下列式(III)所示化合物
6.下列式(IV)所示化合物
7.下列式所示化合物前體
8.下列式所示化合物的純化產物前體
全文摘要
本發明提供了下列式(I)所示化合物的結晶；經反相色譜法純化維生素D衍生物的粗產物或初步純化的產物，然後將純化的衍生物於有機溶劑中析晶獲得的維生素D衍生物結晶；維生素D衍生物合成過程中形成的作為副產物的新的化合物；以及維生素D衍生物或其前體的純化方法。本發明所述方法使得以批量並且穩定地提供高純度維生素D衍生物，特別是ED－71成為可能。
文檔編號C07J71/00GK1637017SQ20041009261
公開日2005年7月13日 申請日期1997年6月16日 優先權日1996年7月1日
發明者山內剛 申請人:中外製藥株式會社