肽製劑及其應用的製作方法

2023-07-12 09:45:51

專利名稱：肽製劑及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及預防和治療藥物領域。本發明具體涉及治療製劑，其包括含有二硫橋的神經垂體九肽，如催產素(oxytocin)、加壓素(vasopressin)或其類似物。本發明提供了熱穩定的催產素製劑及其在諸如引產術、子宮收縮加強(augmentation of labor)、產後出血或子宮收縮弛緩(或子宮張力缺乏，uterine atony)的適應症中的應用。本發明還提供了熱穩定的加壓素製劑及其在諸如尿崩症和血管擴張性休克的適應症中的應用。
背景技術：
催產素(Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly_NH2)和加壓素(Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2)是包括人在內的大多數哺乳動物的腦中產生的肽激素，這些肽激素具有高度的同源性。這兩種九肽均起源於相同的進化祖先，管催產素(或加壓催產素，vasotocin) (Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2)。它們各自胺基酸序列的區別僅在於位置3 (lie對Wie)和位置8 (Leu對Arg)。兩種肽均含有在位置1和6處的半胱氨酸殘基所形成的二硫橋。除了其結構相似性，催產素和加壓素(也稱為精氨酸後葉加壓素(AVP)、精氨酸加壓素和抗利尿激素(ADH))還存在著結構相關性。例如，在大多數物種中，編碼這些肽的基因位於相同的染色體上且間隔少於15000鹼基的相對較小的距離。此外，合成催產素的下丘腦大細胞神經元鄰近合成加壓素的下丘腦大細胞神經元，而且它們在多個方面相似。此外，已知這些激素的結構相似性導致體內的某些功能性交叉反應催產素具有輕微的抗利尿功能，而高水平的加壓素可造成子宮收縮。催產素、加壓素和其類似物被廣泛用於人類和獸類藥物中。加壓素主要用於治療尿崩症和血管擴張性休克，後者例如在膿毒症、器官移植期間或心肺轉流術(人工心肺， cardiopulmonary bypass)之後發生。可商購的加壓素有普通加壓素或合成類似物，如去氨加壓素(1-去氨基-8-D-精氨酸加壓素或DDAVP，商品名Stimate 、Minirin 和 Oetostim )和特利加壓素(商品名Glypressin )。催產素常被用於在分娩無進展的情況下引產和助產(support labor)以及用於治療(產後)出血。目前，催產素被認為是治療產後出血的主要藥劑。它在胃腸道中降解，因此其以水製劑通過注射而給予、或者以鼻噴霧而給予。其在血液中的半衰期一般為約3分鐘。可商購的合成催產素是商品名為Pitocin 和Syntocinon 的即用型(ready-t0-use)的水製劑、或者為普通催產素。催產素類似物去氨催產素和卡貝縮宮素(商品名Duratocin )也可商購。根據世界衛生組織發布的世界健康報告2005 (World Health R印ort2005)，在非洲、亞洲和拉丁美洲，每年有50萬的婦女死於妊娠和分娩過程中的問題。在非洲和亞洲， 這些死亡(病例)中的至少25%可歸咎於出血，其最常見地是由分娩後子宮無法充分收縮 (張力缺乏)所致。這使得出血成為這些洲中孕產婦死亡的首要原因(Khan et al. ,Lancet 367(9516) :1066-1074,2006)。在第三世界國家，要保護藥物製劑不受運輸、儲存和使用過程中高溫的有害影響，在實踐上和/或經濟上常常是不可能的。關於可注射的催產素的報告和穩定性研究已經表明由於暴露於高溫和暴露於光，其具有嚴重的不穩定性(見Groot et al. ，World Health Organization, WHO/DAP/94. 13，1994 禾口 de Groot et al. ，J Clin Pharm Ther 20(2) :115_119，2008以及其中引用的參考文獻)。de Groot等人於1994年的出版物披露了口服催產素或其類似物(也稱為子宮收縮劑)如麥角新鹼、甲麥角新鹼、催產素和去氨催產素的片劑在模擬的熱帶條件(tropical conditions)下是不穩定的，並且得到這樣的結論，即，口服催產素不適合用於預防產後出血。因此，儘管有各種催產素和去氨催產素製劑可用於治療出血，但(亞)熱帶的環境溫度以及在世界上這些區域中對於所謂冷鏈(低溫運輸系統，cold-chain)的缺乏嚴重影響了它們的穩定性和功能性。因此，恰當地預防和/或治療出血幾乎是不可能的，結果導致每年這一驚人的龐大數量的死傷。迄今已知的加壓素製劑類似地也因暴露於高環境溫度或光下而受到影響。已知包括生物活性或治療性肽(如催產素或加壓素)的製劑的穩定性在溫度升高時降低，因而在包括許多第三世界國家的(亞)熱帶國家中，其在治療方法中的應用受到限制。因此，顯然需要熱穩定性提高的肽製劑，該肽製劑優選作為即用型的可注射水溶液。

發明內容
本發明的一個目的是提供用於提高包括催產素、加壓素或它們的類似物的水性製劑的熱穩定性的手段(means)和方法。另一目的是提供治療性或預防性的催產素製劑或加壓素製劑，例如可給予需要其的主體(受試者、受治療者，subject)的即用型的藥物，該藥物具有穩定性，可耐受(亞)熱帶環境溫度，並且生產成本低和/或無副作用。在具體方面， 本發明旨在提供包括催產素或加壓素的可注射製劑，該製劑與現有製劑相比表現出提高的熱穩定性。本發明的發明人出乎意料地發現由於存在緩衝劑和濃度為至少2mM的至少一種二價金屬離子非毒性源(source)，水性肽製劑的穩定性大大提高。例如，在緩衝劑存在下， 利用濃度為至少2mM的二價金屬離子配製時，水性催產素製劑在55°C下保持至少4周而表現出顯著更低的降解。優選二價金屬離子源是金屬鹽。由於至今只能在非熱帶條件獲得穩定性提高的較小的含Cys的治療性肽(如催產素)，因而這成為一項重要的發現。例如，當將催產素溶解在普通NaCl輸注液中時，只在鄰近 23°C (Trissel et al.，Int J Pharm Comp2006 10(2) :156-158)或 35°C (Kalis et al. , Latvijas Psr Zinatnu Akademijas Vestis, Kimijas Serija 197029(1) :29-32)的溫度下觀察到催產素的穩定性。本發明提供了包括治療有效量的催產素、加壓素或它們的類似物以及濃度為至少 2mM的至少一種二價金屬離子非毒性(即，生物相容性)源的PH緩衝的水性製劑。這類製劑在本領域中是未知的。Trissel等人證明了 將催產素溶解在另一種普通輸注液(即，可商購的乳酸林格氏溶液)中對於催產素的穩定性根本沒有影響。林格氏乳酸鹽溶液不含至少2mM的二價金屬離子。當被保持在室溫下時，即使催產素的濃度低至0. 08IU/ml，林格氏溶液中催產素的穩定性在30天後也已經降低。MX 9 707 899披露了組合一種或多種陰離子來使用鈉離子和/或鉀離子以穩定包括合成加壓素或催產素類似物的製劑。其教導了強烈優選檸檬酸、磷酸鹽和鈉離子的混合物。其並未披露包括至少2mM的二價金屬離子的緩衝製劑。
如上所述，至少2mM的二價金屬離子和緩衝劑的存在，大大提高了可注射水性催產素溶液的穩定性。因此，本發明涉及緩衝劑和濃度為至少2mM的至少一種二價金屬離子非毒性源的組合在穩定包括催產素或加壓素或它們的類似物的水性製劑中的應用。此外，本發明涉及催產素製劑及其在預防或治療需要其的主體出血的方法中的應用。其還涉及加壓素製劑及其在預防或治療需要其的主體尿崩症或血管擴張性休克的方法中的應用。本發明還提供了催產素製劑在製造用於治療和/或預防性治療出血的藥物中的應用。本發明還提供了用於治療或預防需要其的主體出血的方法，包括給予所述主體有效劑量的本發明的催產素製劑。此外，本發明提供了用於治療或預防需要其的主體尿崩症或血管擴張性休克的方法，該方法包括給予所述主體有效劑量的本發明的加壓素製劑。在一個方面，本發明提供了包括治療有效量的催產素或其類似物以及濃度為至少 2mM的至少一種二價金屬離子非毒性(即，生物相容性)源的pH緩衝的水性製劑。本文所用的術語「催產素」同時包括具有上文所述的胺基酸序列的原始 (original)九肽以及功能性類似物，如去氨催產素、卡貝縮宮素、4-蘇氨酸-1-羥基-去氨催產素、9-去氨催產素、7-D-脯氨酸-催產素及其去氨基類似物、(2，4_二異亮氨酸)-催產素、1-去氨基-I-單卡貝(monocarba) _E12_Tyr (OMe) ] -OT (dCOMOT)、[Thr4-Gly7]-催產素 (TG-OT), Olson et al.，(P印tidesl2 (1) :113-118,1991)描述的催產素激動劑、催產加壓素和去氨基-6-卡貝(carta)-催產素(dC60)。催產素類似物(子宮收縮劑)的其它實例比如可以在MX 9707899中找到，其披露了催產素類似物(Mpa1)催產素、(Mpa1，D-Tyr (Et)2， Thr4, Orn8)催產素、(Mpa1, Ile2)催產素、(Mpa1, Ala2)催產素、(lie2)催產素、Gly-(Leu4， Ile8)催產素、(D-Asn5)催產素、(D-Cys1)催產素、(Gly4)催產素、(Leu4, D-Arg8)催產素、 (Mpa1, Leu4, D-Arg8)催產素、(Arg8)催產素和(lie8)催產素。在另一實施方式中，製劑包括加壓素或其類似物。本文所用的「加壓素」被定義為同時包括具有上文描述的胺基酸序列的原始九肽和加壓素類似物，如去氨加壓素(1-去氨基-8-D-精氨酸加壓素或DDAVP，商品名stimate 、Minirin 和Octostim )、苯賴加壓素、苯丙加壓素(phenypressin)、賴氨加壓素(也被稱為賴氨酸加壓素或LVP)、鳥氨加壓素、特利加壓素(商品名Glypressin )、抗利尿激素(pitressin) (8-L-精氨酸加壓素、 NC-1900、AVP4_9、去甘氨醯胺-精氨酸 8_ 加壓素(DGAVP)、d (CH2) 5-Cys-d-Tyr (Et) -Arg-Val -Asn-Cys-Lys-Lys-乙二胺(TA-LVP), d (CH2) 5-Tyr (Me)精氨酸加壓素、4-纈氨酸-8-D-精氨酸加壓素(VDAVP)、[His1-6JAVP和US 5，698，516中披露的加壓素類似物。加壓素類似物的其它實例比如可以在MX 9707899中找到，其披露了加壓素類似物(Phe4，Arg8)加壓素、 (Mpa1, Arg8)加壓素、(Lys8)加壓素、去(des)-GlyNH2-(Lys8)加壓素、Gly-Gly-Gly-(Lys8) 加壓素、(Mpa1jD-Arg8)加壓素、去(des)-GlyNH2-(Mpa1，D-Arg8)加壓素、(Mpa1，Gly4，D-Arg8) 加壓素、(Mpa1，Ala4, D-Arg8)加壓素、(Mpa1，Val4, D-Arg8)加壓素、(Mpa1，lie4, D-Arg8)加壓素、(Mpa1，Leu4, D-Arg8)加壓素和(Mpa1，D-Gly8)加壓素。二價金屬離子源可以是一種或多種金屬鹽。優選該源是金屬氯化物鹽(metal chloride salt)。任意類型的生物相容性金屬氯化物鹽可用作金屬離子源。二價金屬離子優先選自Ca2+、Mg2+、Cu2+和加2+構成的組，並且以非毒性濃度和量來使用。優選的二價金屬離子是Ca2+。可用的金屬氯化物鹽包括CaCl2、MgCl2、CuCl2和&iCl2。優選使用CaCl2和/或&iCl2。如本文所用的，至少2mM的二價金屬離子濃度是指在使用兩種或更多種不同 (來源的)二價金屬離子的情況下，二價金屬離子的總量。如下文所示，通過測量長期高溫(例如，55°C )儲存後催產素的回收率(剩餘催產素，以初始量的％計)、催產素單體的量(總剩餘催產素的％ )和/或凝聚水平(凝聚的催產素，以總剩餘催產素的％計)，來確定緩衝劑和濃度為至少2mM的至少一種二價金屬離子源的組合對水性催產素製劑的穩定效應。可使用本領域技術人員認為合適的任意分析方法來評價這些參數。合適的分析方法的實例包括但不限於反相高效液相色譜法(RP-HPLC) 和高效尺寸排阻色譜法(HP-SEC)。因此，本領域技術人員可確定在高溫下實現穩定效應的二價金屬離子的合適濃度。例如，取決於製劑組成或其預期應用，其可以改變。在一個實施方式中，製劑包括催產素或加壓素和至少2mM、優選至少5mM、更優選至少IOmM的二價金屬離子以及緩衝劑。在另一實施方式中，PH緩衝的製劑包括濃度達到150mM、優選達到 lOOmM、更優選達到50mM的二價金屬離子。例如，製劑包括濃度為5mM至150mM、優選IOmM 至lOOmM、更優選IOmM至50mM的二價金屬離子。在一個實施方式中，使用2mM至150mM、優選5-100mM(如10福、201111、251111、301111、401111或501111)的二價金屬離子和緩衝劑來穩定水性肽製劑。在另一實施方式中，使用20mM至IOOmM濃度範圍內的二價金屬離子，如30_100mM、 40-80mM或50-70mM。其它合適的範圍包括2mM至50mM、30mM至60mM和40mM至70mM的二價金屬離子。通過加入濃度為至少2mM的至少一種二價金屬離子源和用來維持穩定pH的緩衝劑，提高了催產素或加壓素水製劑的穩定性。在弱酸性PH下觀察到良好的穩定性。因此， 本發明提供了包括催產素或加壓素或它們的類似物、濃度為至少2mM的至少一種二價金屬離子非毒性源和緩衝劑的PH為3至6、優選3至5、更優選3. 8至4. 8的製劑。可用的緩衝劑包括磷酸鹽緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑、天門冬氨酸鹽緩衝劑和檸檬酸 (也稱為檸檬酸鹽)緩衝劑。在一個實施方式中，本發明提供了包括催產素、加壓素或它們的類似物和非毒性金屬離子源的製劑，該製劑還包括選自磷酸鹽緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑、天門冬氨酸鹽緩衝劑和檸檬酸緩衝劑構成的組的緩衝劑。緩衝劑濃度可根據具體情形而變化。一般使用2mM-200mM的緩衝劑。其它可用的範圍包括5_150mM或5_100mM，如5_50mM 或5-25mM。在一個實施方式中，本發明提供了包括催產素或加壓素、至少2mM 二價金屬離子(優選至少5mM 二價金屬離子、更優選至少IOmM 二價金屬離子)和IOmM至IOOmM醋酸鹽緩衝劑的製劑。例如，製劑可包括催產素、IOmM Mg2+和IOmM醋酸鹽緩衝劑。在另一實施方式中，本發明提供了包括催產素或加壓素或它們的類似物、5mM至60mM二價金屬離子和/ 或IOmM至50mM天門冬氨酸鹽緩衝劑的製劑。例如，製劑包括催產素、50mM CaCl2和50mM 天門冬氨酸鹽緩衝劑。使用檸檬酸緩衝劑，例如2mM-100mM或5mM-50mM檸檬酸鹽，觀察到良好的結果。因此，在優選的實施方式中，本發明提供了包括催產素或加壓素(例如濃度達到50IU/ml)、二價金屬離子(優選達到50mM)和檸檬酸緩衝劑的製劑。在一個實施方式中，製劑包括5IU/ml至60IU/ml催產素、50mM至IOOmM 二價金屬離子和檸檬酸緩衝劑，同時具有4至5的pH值。在另一實施方式中，製劑包括30IU/ml至 200IU/ml的催產素或加壓素、IOmM至80mM的二價金屬離子和緩衝劑，同時具有4至5的pH 值。在優選的實施方式中，製劑包括5IU/ml至100IU/ml的催產素、5mM至50mM的二價金屬離子和檸檬酸緩衝劑，同時具有4. 0至4. 5的pH值。例如，製劑可包括10IU/ml催產素、20mM MgCl2和IOmM檸檬酸緩衝劑。在另一實施方式中，製劑包括天門冬氨酸鹽緩衝劑和至少2mM的Si2+離子(例如， 通過至少2mM ZnCl2提供)。作為另一實施例，製劑可包括催產素、20mM NaClUOmM CaCl2 和檸檬酸鹽緩衝劑。對於另一實施例，製劑可包括催產素或加壓素、醋酸鹽緩衝劑、5_50mM MgCl2或5-50mM CaCl20在一個實施方式中，製劑包括催產素、緩衝劑和2mM至50mMMgCl2。 在另一實施方式中，製劑包括催產素或加壓素、緩衝劑和30mM至60mM 二價金屬離子(如 CaCl2)。在另一實施方式中，製劑包括催產素或加壓素和60mM至SOmM的二價金屬離子。例如，製劑可包括70mMZnCl2和天門冬氨酸鹽緩衝劑。在另一實施方式中，製劑包括催產素、緩衝劑和30mM至IOOmM的二價金屬離子。在優選的實施方式中，製劑包括催產素或加壓素、 檸檬酸鹽緩衝劑或天門冬氨酸鹽緩衝劑和5mM至50mM的二價金屬離子。在另一方面，本發明提供了包括催產素、加壓素或它們的類似物和非毒性氯陰離子源的PH緩衝的水製劑。氯離子源可以是二價氯化物鹽(chloride salt)、優選二價金屬氯化物鹽。本領域技術人員可確定合適的氯陰離子濃度，並且其可根據製劑組成或其預期應用而變化。在一個實施方式中，本發明的製劑包括催產素、緩衝劑和至少0. 05mM的氯陰離子(優選至少0. 5mM、更優選至少2mM)。製劑可包括催產素、緩衝劑和達到150mM的氯陰離子(優選達到IOOmM的氯陰離子、更優選達到50mM的氯陰離子)。在一個實施方式中，製劑包括催產素和2mM至IOOmM的氯陰離子(優選5mM至50mM氯陰離子)。在另一實施方式中，製劑包括IOmM至50mM氯陰離子。在至少2mM CaCl2、MgCl2或SiCl2和檸檬酸緩衝劑的存在下，獲得了良好的結果。 因此，在一個實施方式中，本發明提供了包括催產素或加壓素或它們的類似物、和檸檬酸鹽緩衝劑的製劑。優選，該製劑包括檸檬酸鹽緩衝劑和Ca2+、Mg2+或加2+。例如，其含有2mM至 60mM的CaCl2和/或5mM至200mM的檸檬酸緩衝劑。在另一實施方式中，製劑包括50mM至 IOOmM的MgCl2、ZnCl2或CaCl2和/或5mM至50mM的檸檬酸緩衝劑。例如，製劑包括催產素或加壓素(例如濃度達到50IU/ml)、50mM MgCl2和50mM檸檬酸緩衝劑。在另一實施方式中，製劑包括 lIU/ml 至 100IU/ml 催產素、30mM 至 80mM MgCl2, ZnCl2 或 CaCl2 和 / 或 30mM 至50mM檸檬酸緩衝劑。在優選的實施方式中，製劑包括10IU/ml至100IU/ml催產素或加壓素、5mM至50mM CaCl2和IOmM至50mM檸檬酸緩衝劑。例如，製劑可包括催產素或加壓素 (例如濃度達到50IU/ml)、10mM CaCl2和IOmM檸檬酸緩衝劑。在至少2mM Zn2+和天門冬氨酸鹽緩衝劑存在下，也觀察到良好的穩定性。因此， 在一個實施方式中，本發明提供了包括催產素或加壓素或它們的類似物和天門冬氨酸鹽緩衝劑的製劑。優選，製劑包括催產素或加壓素、天門冬氨酸鹽緩衝劑和Si2+。例如，其含有 2mM至60mM ZnCl2和/或IOmM至70mM天門冬氨酸鹽緩衝劑。在另一實施方式中，該製劑包括30mM至70mM Zn2+和IOmM至50mM天門冬氨酸鹽緩衝劑。例如，製劑包括催產素或加壓素(例如，濃度達到50IU/ml)、40mM ZnCl2和20mM天門冬氨酸鹽緩衝劑。在另一實施方式中，製劑包括lIU/ml至100IU/ml催產素或加壓素、IOmM至50mM Si2+和/或30mM至60mM 天門冬氨酸鹽緩衝劑。在優選的實施方式中，製劑包括5IU/ml至100IU/ml催產素或加壓素、5mM至50mM Zn2+和IOmM至50mM天門冬氨酸鹽緩衝劑。例如，製劑包括催產素或加壓素(例如，濃度達到80IU/ml)、50mM ZnCl2和IOmM天門冬氨酸鹽緩衝劑。應當理解的是，本文提供的製劑包括治療有效量的上文列舉的催產素或加壓素或它們的類似物。在一個方面，本發明提供了包括至少5mIU/ml、更優選至少50mIU/ml、更優選至少500mIU/ml的催產素或加壓素或它們的類似物的製劑。在另一方面，本發明提供了包括達到1000IU/ml、更優選達到500IU/ml、更優選達到100IU/ml的催產素或加壓素或它們的類似物、濃度為至少2mM的至少一種二價金屬離子非毒性源、和緩衝劑的製劑。在一個實施方式中，製劑包括至少500mIU/ml催產素、緩衝劑和優選至少2mM的二價金屬離子，如 Ca2+。在另一實施方式中，製劑包括5IU/ml至300IU/ml催產素、緩衝劑和優選2mM至50mM 的二價金屬離子。在另一實施方式中，製劑包括lIU/ml至60IU/ml催產素或加壓素和優選 IOmM至90mM的二價金屬離子，如Mg2+。在另一實施方式中，製劑包括10IU/ml至200IU/ml 催產素、緩衝劑和優選50mM至SOmM 二價金屬離子。在優選的實施方式中，製劑包括5IU/ ml至100IU/ml催產素或加壓素、緩衝劑和優選5mM至50mM 二價金屬離子，如CaCl2。還提供了包括濃度為5IU/ml至100IU/ml的催產素或加壓素或其類似物、5mM至50mM Ca2+UOmM 至50mM檸檬酸鹽緩衝劑的製劑，並且其中所述製劑的pH為3. 8至4. 8。另一優選的製劑包括濃度為5IU/ml至100IU/ml的催產素、加壓素或它們的類似物、5mM至50mM Zn2+UOmM至 50mM天門冬氨酸鹽緩衝劑，並且其中所述製劑的pH為3. 8至4. 8。根據本發明的另一目的，本發明提供了緩衝劑和濃度為至少2mM的至少一種二價金屬離子和/或氯陰離子非毒性源的組合在穩定催產素、加壓素或其類似物的水溶液中的應用。可使用的這些二價金屬離子的源(一種或多種來源)和濃度如上文所描述的。優選該源是金屬鹽。更優選該源是金屬氯化物鹽。例如，金屬氯化物鹽選自CaCl2、MgCl2、CuCl2 和ZnCl2構成的組。優選緩衝劑是檸檬酸鹽緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑或天門冬氨酸鹽緩衝劑。 優選的組合包括天門冬氨酸鹽緩衝劑加Si2+離子；以及檸檬酸鹽緩衝劑加Ca2+和/或Mg2+ 1 子。本發明還提供了包括催產素、加壓素或其類似物和濃度為至少2mM的二價金屬離子非毒性源的水性製劑(水製劑、含水製劑)，該製劑用作藥物。還提供了包括本發明製劑的容器，如包裝(package)或噴霧容器(spray container) 0由於催產素或加壓素注射劑的光敏感性，包裝優選是耐光的。示例性包裝包括小瓶、安瓿、塑料容器或噴霧器。包裝可包含使用說明。根據本發明的另一個方面，本發明提供了包括催產素或其類似物、緩衝劑和濃度為至少2mM的至少一種二價金屬離子非毒性源的水性製劑在製造用於治療和/或預防性治療出血(如產後出血)的藥物中的應用。還提供了包括加壓素或其類似物、緩衝劑和濃度為至少2mM的至少一種二價金屬離子非毒性源的水性製劑在製造治療和/或預防性治療尿崩症或血管擴張性休克的藥物中的應用。可以通過本領域技術人員已知的任何合適方式將這些藥物給予需要其的主體，包括靜脈、皮下、肌肉和黏膜給予。因此可配製製劑，用於經靜脈、皮下、肌肉和黏膜途徑進行給予。優選經皮下途徑、 黏膜途徑或其組合給予製劑。黏膜途徑例如為、但不限於肺、鼻、舌下或口腔途徑。因此， 在一個實施方式中，本發明提供了本發明的製劑在製造用於皮下或黏膜給予或其組合而配製的藥物中的應用。對於靜脈、皮下或肌肉給予，該製劑可提供為無菌溶液、懸浮液或乳劑。可通過注射或輸注而應用該製劑。對於黏膜給予，該製劑可提供為水噴霧並且可通過噴霧容器或吸入器直接應用。可替換地，該製劑可作為水凝膠而給予黏膜，但不限於此。
根據本發明的另一方面，本發明提供了用於治療或預防需要其的主體出血的方法，包括給予所述主體有效劑量的本發明的催產素製劑。出血可以是產後出血。還提供了用於治療或預防需要其的主體尿崩症或血管擴張性休克的方法，包括給予所述主體有效劑量的本發明的加壓素製劑。主體可以在(亞)熱帶條件下生活。可通過靜脈、皮下或肌肉途徑、黏膜途徑或其組合給予根據本發明方法的有效劑量。如上所述，黏膜途徑例如為、但不限於肺、鼻、舌下或口腔途徑。催產素或其類似物的有效量是足以產生有效抵抗出血相關性症狀的效果的量，本領域技術人員可通過常規實驗確定該有效量。可以相似方式確定抗尿崩症或血管擴張性休克的加壓素或其類似物的有效量。此外，關於催產素或加壓素用於各種適應症的專業指導是存在的，在手冊中描述了其應用(例如，AHFS Drug Information或Martindale，The Extra Pharmacopoeia)。通常，出於本發明的目的，催產素或其類似物的有效劑量預期包括2IU至IOIU的藥劑量(bolus amount)。據此，可通過輸注給予5-10IU或在嚴重的情況下達到20IU的催產素或其類似物。在一個方面，本發明提供了用於治療或預防需要其的主體出血的方法，包括給予所述主體藥劑量達到2IU的催產素或其類似物(優選達到5IU、更優選達到10IU)。在另一方面，本發明提供了用於治療或預防需要其的主體出血的方法，包括給予所述主體藥劑量達到2IU、優選達到5IU、更優選達到10IU的催產素或其類似物，還包括輸注達到20IU、 優選達到10IU的催產素或其類似物。對於加壓素或其類似物，在血管擴張性休克情況下可靜脈給予達到20IU的藥劑量，或者在尿崩症情況下可皮下、肌肉或鼻內給予達到20IU的藥劑量。因此，在另一個方面，本發明提供了用於治療或預防需要其的主體尿崩症或血管擴張性休克的方法，包括給予所述主體藥劑量達到20IU的加壓素或其類似物(優選達到10IU、更優選達到5IU)。在血管擴張性休克的情況下，可據此通過輸注給予劑量為0. 2IU/min至0. 4IU/min的加壓素或其類似物，優選連同去甲腎上腺素一起給予。根據FDA導則，如必要可將該劑量增大到 0. 9IU/min。在尿崩症的情況下，可根據需要每天重複給予5IU至10IU的藥劑量兩到三次。 當鼻內(如通過噴霧)給予加壓素時，必須針對每一主體來確定劑量和治療間隔。通過以下實施例來例示本發明。


圖1 在未緩衝的純水(W)中、於二價金屬離子存在下，催產素的回收率。二價金屬離子(Ca2+、Mg2+和Si2+)的使用濃度是2mM、5mM、10mM和50mM。製劑在4或55°C溫度下、 於pH 4. 5下，儲存4星期。A圖通過RP-HPLC確定的回收率。B圖通過HP-SEC確定的催產素單體回收率。結果表示為三次獨立測量的平均值士SD。圖2 在具有或不具有緩衝劑的純水(W)中，催產素的回收率。使用濃度為5mM、 IOmM或50mM的檸檬酸鹽緩衝劑(CB)、濃度為IOmM的醋酸鹽緩衝劑(AC)、濃度為IOmM的天門冬氨酸鹽緩衝劑(AP)或林格氏乳酸鹽緩衝劑(ORL)。製劑不含有金屬離子，且在4或 55°C溫度下、於pH 4. 5或6.4(0RL)下儲存4星期。A圖通過RP-HPLC確定的回收率。B 圖通過HP-SEC確定的催產素單體回收率。結果表示為三次獨立測量的平均值士SD。圖3 在緩衝劑和單價金屬離子存在下，催產素的回收率。使用濃度為IOmM的檸檬酸鹽緩衝劑(CB)、醋酸鹽緩衝劑(AC)和天門冬氨酸鹽緩衝劑(AP)。使用濃度為IOmM或 20mM的單價金屬離子Na+和K+。製劑在4或55°C的溫度下於pH 4. 5儲存4星期。A圖通過RP-HPLC確定的回收率。B圖通過HP-SEC確定的催產素單體回收率。結果表示為三次獨立測量的平均值士SD。圖4 在不存在或存在Ca2+的情況下，檸檬酸鹽緩衝劑中的催產素的回收率。使用濃度為5mM、10mM和50mM的檸檬酸鹽緩衝劑(CB)。使用濃度為2mM、5mM、10mM和50mM的 Ca2+。所有製劑在4或55°C溫度下於pH 4. 5儲存4星期。A圖通過RP-HPLC確定的回收率。B圖通過HP-SEC確定的催產素單體回收率。結果表示為三次獨立測量的平均值士SD。圖5 在不存在或存在Mg2+的情況下，檸檬酸鹽緩衝劑中的催產素的回收率。使用濃度為5mM、10mM和50mM的檸檬酸鹽緩衝劑(CB)。使用濃度為2mM、5mM、10mM和50mM的 Mg2+。所有製劑在4或55°C溫度下於pH 4. 5儲存4星期。A圖通過RP-HPLC確定的回收率。B圖通過HP-SEC確定的催產素單體回收率。結果表示為三次獨立測量的平均值士SD。圖6 在不存在或存在Si2+的情況下，檸檬酸鹽緩衝劑中的催產素的回收率。使用濃度為5mM、10mM和50mM的檸檬酸鹽緩衝劑(CB)。使用濃度為2mM、5mM、10mM和50mM的 Zn2+0所有製劑在4或55°C溫度下於pH 4. 5儲存4星期。A圖通過RP-HPLC確定的回收率。B圖通過HP-SEC確定的催產素單體回收率。結果表示為三次獨立測量的平均值士SD。圖7 在具有或不具有二價金屬離子的情況下，於IOmM醋酸鹽緩衝劑(AC)存在下，催產素的回收率。使用濃度為0識、21111、51111、101111和50mM的二價金屬離子(Ca2+、Mg2+和 Zn2+)。A圖在4或55°C以及pH 4. 5下儲存4星期後通過RP-HPLC確定的回收率。B圖 在55°C溫度下於pH 4. 5儲存4星期後通過HP-SEC確定的催產素單體回收率。結果表示為三次獨立測量的平均值士SD。圖8 在具有或不具有二價金屬離子的情況下，於IOmM天門冬氨酸鹽緩衝劑(AP) 存在下，催產素的回收率。使用濃度為0mM、2mM、5mM、10mM和50mM的二價金屬離子(Ca2+、 Mg2+和Si2+)。A圖在4或55°C以及pH 4. 5下儲存4星期後通過RP-HPLC確定的回收率。 B圖在55°C溫度下於pH 4. 5儲存4星期後通過HP-SEC確定的催產素單體回收率。結果表示為三次獨立測量的平均值士SD0圖9 在IOmM檸檬酸鹽緩衝劑(CB)和IOmM或50mM 二價金屬離子(Ca2+)中，催產素的回收率。製劑於40°C和pH 4.5儲存1、2、3或6個月。A圖通過RP-HPLC確定的回收率。B圖通過HP-SEC確定的催產素單體回收率。結果表示為三次獨立測量的平均值士SD。
具體實施例方式實驗部分樣品編號英文首字母(或最初的多個字母)表示緩衝劑(或水)的類型W:水CB 檸檬酸鹽緩衝劑pH 4. 5AC 醋酸鹽緩衝劑pH 4. 5AP 天門冬氨酸鹽緩衝劑pH 4. 5ORL 林格乳酸鹽緩衝劑
接下來的數字(或多個數字)表示以mM計的緩衝劑濃度，接下來的字母(或多個字母)表示金屬離子的類型，接下來的數字(或多個數字)表示以mM計的金屬離子濃度。所有鹽均為氯化物(MClx)例如，CB5MglO表示5mM檸檬酸鹽緩衝劑pH 4. 5和IOmM MgCl2。實施例1(比較例)這個比較例證實了二價金屬離子的催產素穩定效應。將作為金屬氯化物鹽(MCl2) 的二價金屬離子(Ca2+、Mg2+*ai2+)加入到包括催產素和純水(W)的非緩衝製劑中。使用濃度為0mM、2mM、5mM、10mM和50mM的二價金屬離子。然後於4°C (參考對照)或55°C (測試)以pH 4. 5儲存製劑樣品4星期。此後，在RP-HPLC和HP-SEC分析之前，所有樣品均儲存在冷卻條件)下。通過測量催產素回收率和催產素單體百分比來確定對穩定性的影響。圖IA和IB中示出結果。圖IA示出在不存在或存在二價金屬離子的未緩衝純水(W)中於55°C儲存4星期後的催產素回收率。在Ca2+或S12+存在下，4°C的催產素回收率升高。以濃度依賴性方式觀察到這種效應。但在55°C只觀察到較差的穩定效應。圖IB示出在不存在或存在二價金屬離子的未緩衝純水(W)中於55°C儲存4星期後的剩餘催產素單體的百分比。同樣，在Ca2+ 或Si2+存在下，僅在4°C避免了單體損失。這些結果證實了二價金屬離子對催產素水製劑的較小穩定效果。實施例2 (比較例)將濃度為0mM、5mM、10mM或50mM的檸檬酸鹽緩衝劑(CB)、濃度為IOmM的醋酸鹽緩衝劑(AC)、濃度為IOmM的天門冬氨酸鹽緩衝劑(AP)或林格氏乳酸鹽緩衝劑(ORL)加入到包括純水(W)中催產素的製劑中。使用的林格乳酸鹽是用於靜脈輸注的Baxter Viavlo 500mLWE2323林格乳酸鹽溶液。批號09B04E1P，到期日期(exp. date) 2011。製品的pH為 6. 4。每IOOmL中的組成
氯化鈉6g鈉 13 Immol氯化鉀0.4g鉀 5 mmol二水合氯化鈣0.27g 丐 2 mmol,氯 Illmmol乳酸鈉3.2g重碳酸鹽(如乳酸鹽)29 mmol
注射水適量(qs)所有製劑均沒有二價金屬離子(除了 0RL)，並且具有0. lmg/ml的催產素終濃度和 4. 5 (CB, AC和AP)或6. 4 (ORL)的pH值。每一製劑的樣品於4°C (對照)或55°C (測試) 儲存4星期。此後，在RP-HPLC和HP-SEC分析之前，所有樣品儲存在冷卻條件)下。 通過測量催產素的回收率和催產素單體的百分比來確定對穩定性的影響。圖2A和2B中示
出結果ο圖2A示出在不存在二價金屬離子的情況下，在添加或不添加緩衝劑的純水中，於 55°C儲存4星期後的催產素回收率。在4°C下，在緩衝劑存在下，催產素回收率顯著提高。在55°C下，在存在檸檬酸鹽緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑或天門冬氨酸鹽緩衝劑、但卻不存在林格氏乳酸鹽緩衝劑的情況下，可觀察到催產素穩定性小幅提高。通過如圖2B描繪的剩餘催產素單體的百分比來反映這些結果。這些結果證實了檸檬酸鹽緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑或天門冬氨酸鹽緩衝劑(而非林格氏乳酸鹽緩衝劑)對熱帶條件下催產素水製劑的較小穩定效應。實施例3 (比較例)研究了在緩衝劑和單價金屬離子的組合的存在下催產素的熱穩定性。使用濃度為 IOmM的檸檬酸鹽緩衝劑(CB)、醋酸鹽緩衝劑(AC)或天門冬氨酸鹽緩衝劑(AP)。加入以其氯化物鹽形式(NaCl和KCl)的單價金屬離子Na+和K+，使用的終濃度為IOmM和20mM。所有製劑具有的催產素終濃度為0. lmg/ml, pH值為4. 5。每一製劑的樣品於4°C (對照)或 550C (測試)儲存4星期。此後，在RP-HPLC和HP-SEC分析之前，所有樣品儲存在冷卻條件)下。通過測量催產素的回收率和催產素單體的百分比來確定對穩定性的影響。 圖3A和;3B中示出了結果。在圖3A中，可觀察到在55°C儲存的催產素的較小熱穩定性效果。儘管與單獨存在緩衝劑(見圖2A和2B)相比催產素穩定性稍微提高，但仍然只回收到不超過約35%原始量的催產素(IOmM醋酸鹽緩衝劑&10mM Na+)。該剩餘部分中，只有大約30%保持其單體形式 (圖:3B)。這些結果清楚地證實了緩衝劑和單價金屬離子的組合的存在不足以穩定熱帶條件下的催產素。實施例4該實施例證實了包括檸檬酸鹽緩衝劑和二價金屬離子的催產素製劑的較強的熱穩定性。使用濃度為5mM、10mM或50mM的檸檬酸鹽緩衝劑(CB)。加入其氯化物鹽(CaCl2、 MgCldnaiCl2)形式的二價金屬離子(&2+、1%2+和2112+)，並且使用的終濃度為01111、21111、51111、 IOmM或50mM。所有製劑具有的催產素終濃度為0. lmg/ml，pH值為4. 5。每一製劑的樣品於4°C (對照)或55°C (測試)儲存4星期。此後，在RP-HPLC和HP-SEC分析之前，所有樣品儲存在冷卻條件)下。通過測量催產素的回收率和催產素單體的百分比來確定對穩定性的影響。在圖4A和4B (具有Ca2+的檸檬酸鹽緩衝劑)、圖5A和5B (具有Mg2+的檸檬酸鹽緩衝劑)和圖6A和6B (具有Si2+的檸檬酸鹽緩衝劑)中示出了結果。圖4A和4B示出了在不存在或存在Ca2+的檸檬酸鹽緩衝劑(CB)中於55°C儲存4 星期後的催產素回收率和剩餘催產素單體的百分比。在Ca2+存在下，催產素回收率和催產素單體的百分比均以濃度依賴性方式提高到80%。這些結果證實了檸檬酸鹽緩衝劑和Ca2+ 對催產素水製劑的穩定效果。在5mM或IOmM檸檬酸鹽緩衝劑和50mM Ca2+存在下，觀察到穩定性的最大提高。在50mM檸檬酸鹽緩衝劑中，只有連同50mM Ca2+—起，才能提高催產素的穩定性。在IOOmM Ca2+情況下，觀察到催產素沉澱。在圖5A和5B中觀察到相似的效果，其示出了在不存在或存在Mg2+的檸檬酸鹽緩衝劑(CB)中於55°C儲存4星期後催產素的回收率和剩餘催產素單體的百分比。在5mM或 IOmM檸檬酸鹽緩衝劑和50mM Mg2+存在下，再次觀察到穩定性的最大提高。在50mM的檸檬酸鹽緩衝劑的情況下，同樣只是在具有50mM Mg2+時，催產素穩定性提高。圖6A和6B示出了在不存在或存在Si2+的檸檬酸鹽緩衝劑(CB)中於55°C儲存4 星期後催產素的回收率和剩餘催產素單體的百分比。在Si2+存在下，催產素回收率和剩餘催產素單體百分比均以濃度依賴性方式提高到90%。但是，在僅存在2mM或5mM Si2+的情況下已經觀察到穩定性的大幅提高。這表示對於催產素的穩定性，檸檬酸鹽緩衝劑和Si2+ 的組合產生甚至比檸檬酸鹽緩衝劑和Ca2+或Mg2+的組合更強的效果。在50mM的檸檬酸鹽緩衝劑的情況下，僅在具有50mM Zn2+的情況下催產素穩定性提高。實施例5本實施例證明了包括IOmM醋酸鹽緩衝劑(AC)和二價金屬離子的催產素製劑的熱穩定性的小幅提高。加入其氯化物鹽形式(CaCl2、MgCl2和SiCl2)的二價金屬離子(Ca2+、 Mg2+和Si2+)，並且使用的終濃度為0mM、2mM、5mM、10mM或50mM。所有製劑具有的催產素終濃度為0. lmg/ml,pH值為4. 5。每一製劑的樣品於4°C (對照)或55°C (測試)儲存4星期。此後，在RP-HPLC和HP-SEC分析之前，所有樣品儲存在冷卻條件)下。通過測量催產素的回收率和催產素單體的百分比來確定對穩定性的影響。圖7A和7B中示出了結果。圖7A示出了在不存在或存在二價金屬離子的IOmM醋酸鹽緩衝劑(AC)中於55°C 儲存4星期後的剩餘催產素百分比。在50mM Ca2\50mM Mg2+或5OmM Si2+存在下，可觀察到剩餘催產素百分比的小幅提高。在圖7B中也觀察到了這樣的效果。這些結果證明了醋酸鹽緩衝劑和二價金屬離子對催產素水製劑的穩定性增強的效果。實施例6本實施例例證了 &ι2+組合天門冬氨酸鹽緩衝劑(AP)的催產素穩定效果。將濃度為IOmM的天門冬氨酸鹽緩衝劑加入到包括催產素和0mM、2mM、5mM、10mM或50mM CaCl2, MgCl2或SiCl2的製劑中。所有製劑具有的催產素終濃度為0.1!^/!111，？!1值為4.5。每一製劑的樣品於4°C (對照)或55°C (測試)儲存4星期。此後，在RP-HPLC和HP-SEC分析之前，所有樣品儲存在冷卻條件)下。通過測量催產素的回收率和催產素單體的百分比來確定對穩定性的影響。圖8A和8B中示出了結果，證明了 Si2+與天門冬氨酸鹽緩衝劑的較強的濃度依賴性穩定效果。在55°C和pH 4. 5下儲存4星期後剩餘多達75%的催產素。當天門冬氨酸鹽緩衝劑與Ca2+或Mg2+ —起使用時，只觀察到較小的效果。實施例7進行長期的穩定性研究，從而評價包括二價金屬離子的PH緩衝的催產素製劑經延長的時間後的熱穩定性。將濃度為5mM、10mM或50mM的檸檬酸鹽緩衝劑(CB)加入到包括0. lmg/ml催產素和OmMUOmM或50mM Ca2+(CaCl2)的製劑中。最終的製劑具有pH 4.5。 每一製劑的樣品於40°C儲存1、2、3或6個月。此後，在RP-HPLC和HP-SEC分析之前，所有樣品儲存在冷卻條件)下。通過測量催產素的回收率和催產素單體的百分比來確定對穩定性的影響。圖9A和9B中示出了該研究的結果圖9A示出了在不同濃度CaCl2和5mM或IOmM檸檬酸鹽緩衝劑的存在下隨時間 (變化)的催產素回收率。在檸檬酸鹽緩衝劑(CB)和Ca2+存在下，當與單獨存在檸檬酸相比，每個時間點的催產素回收率均升高。可觀察到檸檬酸鹽緩衝劑和Ca2+以濃度依賴性方式的較強的穩定性提高效果。儘管這種效果隨著時間逐漸降低，但其仍然很強。例如，當使用IOmM檸檬酸鹽緩衝劑和50mM Ca2+時，即使於40°C儲存6個月後，製劑中仍保留約70% 原始量的催產素。如圖9B中觀察到的，該部分中超過80%保持為其單體形式。這些結果清楚地證實了緩衝劑和至少2mM 二價金屬離子的組合對催產素的穩定效應。
權利要求
1.一種水性製劑，包括治療有效量的催產素、加壓素或它們的類似物、緩衝劑和濃度為至少2mM的至少一種二價金屬離子非毒性源。
2.根據權利要求1所述的製劑，包括濃度為5-150mM、優選10-100mM、更優選10_50mM的二價金屬離子。
3.根據權利要求1或2所述的製劑，其中，所述二價金屬離子源是金屬鹽、優選金屬氯化物鹽。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的製劑，包括選自檸檬酸鹽緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑和天門冬氨酸鹽緩衝劑構成的組中的緩衝劑。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的製劑，其中，所述二價金屬離子選自Ca2+、Mg2+、 Cu2+和Si2+構成的組，優選其中所述金屬離子源選自CaCl2、MgCl2、CuCl2和ZnCl2構成的組。
6.根據權利要求5所述的製劑，其中，所述金屬離子源是CaCl2。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的製劑，其pH值為3-6、優選3-5、更優選 3. 8-4. 8。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的製劑，包括檸檬酸鹽緩衝劑，以及Ca2+、Mg2+和 Si2+中的一種或多種。
9.根據權利要求8所述的製劑，包括濃度為5-100IU/ml的催產素或加壓素或它們的類似物、5-50mM Ca2+、10-50mM檸檬酸鹽緩衝劑，並且其中，所述製劑的pH值為3.8-4.8。
10.根據權利要求1至7中任一項所述的製劑，包括天門冬氨酸鹽緩衝劑和Zn2+。
11.根據權利要求10所述的製劑，包括濃度為5-100IU/ml的催產素或加壓素或它們的類似物、5_50mM ai2+、10-50mM天門冬氨酸鹽緩衝劑，並且其中，所述製劑的pH值為 3. 8-4. 8。
12.根據權利要求1至11中任一項所述的製劑，其中，所述製劑包括催產素或其類似物。
13.根據權利要求1至11中任一項所述的製劑，其中，所述製劑包括加壓素或其類似物。
14.根據權利要求1至13中任一項所述的製劑，其用作藥物。
15.一種容器，優選耐光性容器，其包括根據權利要求1至14中任一項所述的製劑和使用說明。
16.根據權利要求12所述的製劑在製造用於治療和/或預防性治療出血，如產後出血的藥物中的應用，優選其中所述藥物是溶液、懸浮液、乳劑、噴霧或凝膠的形式。
17.根據權利要求13所述的製劑在製造用於治療和/或預防性治療尿崩症或血管擴張性休克的藥物中的應用，優選其中所述藥物是溶液、懸浮液、乳劑、噴霧或凝膠的形式。
18.根據權利要求16或17所述的應用，其中，所述藥物是經由靜脈、皮下或肌肉途徑、 黏膜途徑或它們的組合進行給予而用於治療，優選其中所述黏膜途徑是肺、鼻、舌下或口腔途徑。
19.一種用於治療或預防需要其的主體出血，如產後出血的方法，包括給予所述主體有效劑量的根據權利要求12所述的製劑，優選其中所述給予包括經靜脈、皮下或肌肉途徑、 黏膜途徑或它們的組合而給予，更優選其中所述黏膜途徑是肺、鼻、舌下或口腔途徑。
20.一種用於治療或預防需要其的主體尿崩症或血管擴張性休克的方法，包括給予所述主體有效劑量的根據權利要求13所述的製劑，優選其中所述給予包括經靜脈、皮下或肌肉途徑、黏膜途徑或它們的組合而給予，更優選其中所述黏膜途徑是肺、鼻、舌下或口腔途徑。
21.緩衝劑和濃度為至少2mM的至少一種二價金屬離子非毒性源的組合在穩定催產素、加壓素或它們的類似物的水性製劑中的應用。
22.根據權利要求21所述的應用，其中，所述至少一種二價金屬離子非毒性源是金屬鹽、優選金屬氯化物鹽，更優選其中所述金屬氯化物鹽選自CaCl2、MgCl2, CuCl2和ZnCl2構成的組。
23.根據權利要求21或22所述的應用，其中，所述緩衝劑是檸檬酸鹽緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑或天門冬氨酸鹽緩衝劑。
全文摘要
本發明涉及預防和治療藥物領域，特別涉及肽製劑。本發明提供了包括催產素、加壓素或它們的類似物和濃度為至少2mM的至少一種二價金屬離子非毒性源的pH緩衝的水性製劑，以及該製劑在製造用於治療和/或預防性治療的藥物中的應用。本發明還提供了用於治療或預防需要其的主體出血的方法，包括給予所述主體有效劑量的本發明的催產素製劑。本發明還提供了用於治療或預防需要其的主體尿崩症或血管擴張性休克的方法，包括給予所述主體有效劑量的本發明的加壓素製劑。
文檔編號A61K38/11GK102209553SQ200980144395
公開日2011年10月5日 申請日期2009年9月9日 優先權日2008年9月9日
發明者亨德裡克·威廉·弗裡亞林克, 克裡斯蒂娜·阿瓦恩蒂, 沃特·萊昂納德斯·約瑟夫·欣裡奇斯, 讓-皮埃爾·阿莫裡 申請人:格羅寧根大學