人原始間葉幹細胞群的分離、體外培養、製備及應用的製作方法
2023-07-12 07:11:56 1
專利名稱：人原始間葉幹細胞群的分離、體外培養、製備及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有多向分化潛能，可分化成成骨、軟骨、脂肪、平滑肌、腱、內皮細胞等多種間葉組織的具有自我更新能力的人原始間葉幹細胞群(Human Totipotent Mesenchymal Stem Cells簡寫為HTMSC)。涉及一種人原始間葉幹細胞群的分離及體外培養、製備方法。特別涉及採用人原始間葉幹細胞群以及基因修飾後的人原始間葉幹細胞群的應用，包括骨骼修復、改善肌萎縮、基因缺陷性疾病(血友病A、B、粘多糖貯積病等)、放療、化療後及再障病員的骨髓微循環的重建、促造血、增強免疫、疫苗、抗腫瘤。
人體幹細胞系具有自我更新多向分化的原始細胞，包括(1)從胚胎或胎肝組織分離的胚胎幹組織，可分化成人體各種組織；(2)從成人骨髓分離出的造血幹組織，可形成淋巴、粒系、紅系各種造血細胞及腦細胞；(3)從胎腦分離的神經原幹細胞，可分化為神經原以及神經膠質；(4)從成人骨髓分離的間葉幹細胞(MesenchymalStem Cells)可分化成骨骼、軟骨、肌肉、腱等。近年來，幹細胞特有生物學特徵及潛在生物學應用價值成為生物學領域最熱點課題，SCIENCE(1998年11月)報導了體外分離的原始胚胎幹細胞可維持其未分化狀態4月餘，並可分化成各種人體組織細胞。SCIENCE(1999年3月)再次報導了胚胎幹細胞有其局限性(1)體外極難於模擬微環境使胚胎幹細胞定向分化成所需組織；(2)胚胎幹細胞具有相當大的腫瘤發生潛在性。因此，越來越多科學實驗表明，間葉幹細胞具有比以往認為更多更實際的生物學應用價值。
以往研究表明人間葉幹細胞系具有自我更新多向分化增殖能力的原始骨髓細胞。體內外在較合適的環境可分化成成骨細胞[Haynes Worth,S.E.etal,Bone,1992；13:69-80]、軟骨細胞[Johnstone,B.etal,Ortho.Res.Soc.,1996；21:65]、脂肪細胞[Pittenger,M.F.etal,Mol.Biol.Cell.,1996；7:305]、平滑肌細胞、成纖維細胞、骨髓基質細胞及多種血管內皮細胞。早期間葉幹細胞可體內外長期生長。
目前國際上分離人間葉幹細胞多採用已知的間葉幹細胞表面標誌，Simmon等採用STRO-1單抗識別成纖維集落形成細胞(CFU-F)，命名為基質幹細胞。STRO-1陽性的基質細胞可分化為網織細胞、脂肪細胞及骨骼細胞。該細胞具有CD10、CD13、CDW90、CD106表面標誌，該方法分離的間葉幹細胞局限於僅富集了STRO-1陽性的人間葉幹細胞，STRO-1陽性率僅佔間葉幹細胞5-10％，絕大多數尤其是原始間葉幹細胞可能丟失於分離過程。Caplan等克隆了SB1至SB5系列單克隆抗體可識別間葉祖細胞分化成不同時期的成骨細胞，而且克隆了SH2、SH3及SH4抗體以識別間葉祖細胞，該細胞可分化成骨骼、軟骨、脂肪等。該著重於骨骼發生以及應用研究。
以往人間葉幹細胞研究分離方法的缺陷為分離的間葉幹細胞不能經體外培養分化為間葉組織中的內皮細胞、平滑肌細胞。換言之，分離的細胞可能不含有較原始的幹細胞，具有平滑肌細胞、內皮細胞分化能力的原始人間葉幹細胞。本方法研製的幹細胞，即具有平滑肌細胞與內皮細胞分化潛能的人原始間葉幹細胞，往往已成為骨細胞特異轉錄因子陽性間葉幹細胞，CBFA1陽性，可分化成成骨細胞祖細胞、軟骨細胞祖細胞、脂肪細胞祖細胞、成纖維細胞祖細胞、基質細胞祖細胞。參見
圖1。
體內研究已表明間葉幹細胞不僅可自我更新骨髓微環境，提供人骨髓造血微環境，包括有助於造血幹、祖細胞分化、增殖和表達、分泌粘附因子及造血因子，而且可分化成各種間葉組織。顯示了間葉幹細胞具有多種生物學應用價值。因此，體外建立一種分離及培養人原始間葉幹細胞群製備系統至關重要。
本發明的目的之一為國際上首次從骨髓中分離出具有內皮細胞及平滑肌細胞分化能力的人原始間葉幹細胞群；本發明的另一目的是以優化的培養體系體外長期培養人原始間葉幹細胞群，最大限度維持間葉幹細胞原始狀態，而且在特定培養基可誘導定向分化為多種間葉細胞；本發明的再一目的是人原始間葉幹細胞群的多種應用以及基因修飾後的人原始間葉幹細胞群的應用，(如治療基因缺陷性疾病、化療、放療後及再障病員骨髓微環境重建、骨骼修復、改善肌萎縮，以及促造血、增強免疫、疫苗、抗腫瘤等多向用途)。因為原始間葉幹細胞具有更多細胞分化潛能。
本發明的目的是通過下述方法實現的一、人原始間葉幹細胞群的分離1、單個核細胞的分離採集人體骨髓細胞或臍帶血細胞，經密度梯度離心1600轉/分骨髓細胞20分鐘，獲得單個核骨髓細胞，經含1％牛血清白蛋白磷酸緩衝液清洗細胞2遍後，懸浮細胞於磷酸緩衝液。
2、人原始間葉幹細胞群的初篩採用包被抗鼠免疫球蛋白M抗體的磁珠與鼠抗人CD45抗原及抗CD39的單克隆抗體結合後，再與骨髓單個核細胞室溫作用半小時，將與飽和濃度特異性抗體反應的骨髓細胞放置於磁場槽中，經磷酸緩衝液衝洗並收集與磁珠分離的骨髓細胞。
含人原始間葉幹細胞群的骨髓細胞進一步與抗人CD45、CD39及CD14標記有螢光素抗體反應，經過流式細胞儀分析，分離去除CD45、CD14及CD39陽性的骨髓細胞。該過程去除了骨髓成熟的淋巴細胞、巨核、單核及紅細胞母細胞等。收集含人原始間葉幹細胞群的成熟細胞表型陰性的細胞，該細胞群可分為大與小體積細胞，小體積細胞約佔2％，而大體積細胞為人原始間葉幹細胞群，約佔骨髓細胞0.03-0.06％。
特點該分離人原始間葉幹細胞製備方法所獲得人原始間葉幹細胞群，不同於以往人間葉幹細胞分離方法。以往使用特異識別人間葉幹細胞的單克隆抗體如SH2、SH3、STRO-1等，僅限於分離SH2、SH3、STRO-1陽性的人間葉幹細胞。該間葉幹細胞可分化成成骨細胞、脂肪細胞、基質細胞、軟骨細胞等，但尚無平滑肌細胞及內皮細胞分化潛能報導。本分離方法不同於以往分離方法，不局限於收集SH2、SH3或STRO-1陽性的幹細胞。本發明分離富集不僅具有以往間葉幹細胞分化潛能，而且可分化成為平滑肌細胞、血管內皮細胞的原始間葉幹細胞。參見圖2人原始間葉幹細胞群的分離、培養增殖及多向分化。其中1為採集人骨髓細胞，2．為密度梯度離心獲得單個核細胞層，3．為磁場槽，4．為免疫吸附在磁場分離出含有人間葉細胞骨髓細胞，5．為小體積具有間葉細胞表型細胞，6．為大體積人原始間葉幹細胞群，表型為CD13、CD44、CDW90、1B10、激活白細胞粘附分子陽性；CD50、CD39、DR、CD45、CD68陰性，7．為流式細胞儀用於分析、分離免疫螢光標記的間葉細胞。
二、人原始間葉幹細胞群的體外培養及多向分化、增殖1．人原始間葉幹細胞群的體外培養將獲得的人原始間葉幹細胞群放置於經Fibronectin(FN)包被的培養板培養。比較研究了三種不同的培養條件，包括①無血清②含低小牛血清③含12％小牛血清、12％馬血清的培養體系。結果表明①無血清僅含有血小板衍化生長因子、內皮生長因子，地塞米松、硒、轉鐵蛋白、胰島素、亞油酸、牛白蛋白、抗壞血酸、抗菌素DMEM及MCDB培養基和②含12％小牛血清、馬血清，氫化考的松及β硫基乙醇的培養條件，不利於人原始間葉幹細胞群體無分化的細胞生長。在含有低小牛血清、地塞米松、BB血小板衍化生長因子及內皮生長因子，硒、轉鐵蛋白、胰島素、亞油酸、白蛋白、抗壞血酸、10毫升/升抗黴菌素、/1萬單位青黴素、/1萬微克鏈黴素、25微克二性要素B、F-12營養混合物的DMEM培養基培養，人原始間葉幹細胞群體外長期生長且維持未分化狀態呈人原始間葉幹細胞表型。細胞呈紡錘體形，每4天換培養液去除懸浮細胞，以含1毫摩爾EDTA的0、25％胰酶消化細胞進行細胞傳代。人原始間葉幹細胞群細胞免疫表型為CD13、CD44、CD49b、CDW90、1B10、激活白細胞粘附分子陽性，CD50、CD39、DR陰性。
以往研究表明，SH2、SH3或STRO-1陽性間葉幹細胞約佔1/1-10萬個單個核骨髓細胞，本發明採用有限稀釋方法確定了人原始間葉幹細胞群約1/1-5百萬單個核骨髓細胞。以往培養條件採用10％血清的培養條件培養間葉幹細胞。本發明採用較低血清濃度接近人生理條件的培養條件，以維持最佳細胞未分化原始狀態的體外生長。
2、人原始間葉幹細胞群的多向分化。
經4代培養後，人原始間葉幹細胞群可多向分化成骨骼細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、基質細胞、肌細胞及內皮細胞等，其中平滑肌細胞與內皮細胞分化潛能為以往間葉幹細胞未見報導的。
①分化成骨細胞經含地塞米松、抗壞血酸、β磷酸甘油及β轉化生長因子超家族蛋白(如骨形成蛋白2、3)，生長因子如纖維生長因子，前列腺素等的培養體系培養7天後，細胞內礆性磷酸酶達峰值。14天後，Von Kossa染色及螢光鈣骨礦化測定人間葉幹細胞分化成成骨細胞。成骨細胞分泌及形成骨樣細胞間葉物質。
②分化軟骨細胞經含β轉化生長因子或抑制素A、軟骨刺激活性因子骨形成蛋白4等培養2-3天，組織學鑑定甲苯胺藍染色陽性為軟骨細胞。免疫組化分析，軟骨細胞標誌CSPG-M陽性。
③分化內皮細胞經含人血管內皮生長因子培養2周後，細胞表型為CD36、CD34及Von Willerband因子陽性為內皮細胞。
④分化肌細胞經含5-azacytidine誘導1天後，2周後細胞免疫組化測定，肌原蛋白陽性為肌細胞。在早期分化過程中，多種轉錄因子如MyoD、Myf5、Myf6及Myogenin分別表達陽性。
⑤基質細胞在特異性細胞因子如白介素1α或白介素2等誘導培養基培養人原始間葉幹細胞群，30％細胞密度傳代培養，經3天誘導分化，收集過濾上清，測定已分化為基質細胞的新分泌的細胞因子，包括白介素3、6、G-CSF、GM-CSF、白血病抑制因子、幹細胞生長因子、β2轉代生長因子。經誘導的基質細胞分泌相當高水平的上述細胞因子，而未分化細胞僅白介素6表達水平較高。
⑥脂肪細胞分化在含地塞米松、1甲基3異丁黃嘌呤、胰島素及茚甲新，小牛血清培養基誘導培養間葉幹細胞群2-3天，然後經含胰島素及原小牛血清及營養成分培養基1天後，第2天後開始形成脂質空洞。
特點體外誘導分化人原始間葉幹細胞群系迅速、均一幹細胞分化發展過程，該細胞工程具有廣泛應用價值。a、純化的人原始間葉幹細胞群不含有不利於多向分化的細胞生物因子；b、體外可以控制細胞分化期，尤其為骨骼不同發育時期；c、體外可模擬所需分化細胞亞型，如肌肉形成快或慢肌細胞；d、體外分化均一、迅速，人原始間葉幹細胞群同時暴露於較適劑量誘導生物活性因子以定向分化，而體內往往為部分微環境逐漸誘導分化，歷時長，具有多態分化性。
人原始間葉幹細胞群較以往間葉幹細胞具有更多的分化潛能，包括平滑肌細胞及內皮細胞，加之均一迅速體外分化優勢，為其實現廣泛應用奠定了堅實基礎。
3、人原始間葉幹細胞群的體外生長人原始間葉幹細胞群增殖迅速，第1周可增殖1千倍，第4周可增殖3萬倍，第8周可增殖約1千萬倍。人原始間葉幹細胞群體外觀察2月餘仍保持未分化狀態呈指數增殖。參見圖2。其中8．為細胞培養皿用於FN包被培養人原始間葉幹細胞群，每4天換液，以去除懸浮細胞，9．為人原始間葉幹細胞群顯微鏡下呈紡錘體形，具有間葉幹細胞表型，10．為人原始間葉幹細胞群第一周可擴增1千倍，第八周可達1千萬倍，11．為誘導分化為成骨細胞，12．為誘導分化為軟骨細胞，13．為誘導分化為內皮細胞，14．為誘導分化為肌細胞，15．為誘導分化為其他組織細胞。
三、基因修飾人原始間葉幹細胞群的應用設計採用逆轉錄病毒載體如MSCV-IRES-EGFP特點為1，具有較強啟動子啟始外源基因，尤其在造血幹細胞高效表達。2，克服了第一代逆轉錄病毒載體所致功能基因Silencing缺點。3，該載體保留了分泌高滴度病毒上清的優勢。
採用內核糖體啟始序列(IRES)起始表達功能基因及篩選基因，可使單啟動子同時翻譯IRES引導的上、下遊基因，以獲得相同水平雙蛋白表達，克服了以往載體內源啟動子自相抑制蛋白表達作用。
採用最佳篩選基因綠螢光蛋白(GFP)，經64、65位點突變的增強綠螢光蛋白(EGFP)，特點為無需反應底物，螢光強度增至100倍，可獲得含修飾基因表達的螢光陽性細胞，24小時可經流式細胞儀快捷分離、應用研究。
修飾基因可為多向分化誘導基因(骨形成蛋白基因、β轉化生長因子等)、基因缺陷疾病缺失基因(凝血因子Ⅷ、Ⅸ血友病基因、粘多糖病基因IDS等)，促造血、增強免疫的細胞因子、抗腫瘤基因。如圖3所示，將修飾基因克隆，酶切後連接於上遊BglⅡ或XhoⅠ、下遊EcoRⅠ酶切位點。參見圖3逆轉錄病毒載體設計，共轉染及富集高滴度病毒上清轉導人原始間葉幹細胞群。其中X．代表任一基因將轉導人原始間葉幹細胞群，B．為BglⅡ或XhoⅠ酶切位點，E．為EcoRⅠ酶切位點，1．為MSCV逆轉錄病毒啟動子，2．為IRES內核糖體啟始療列，3．為EGFP增強綠螢光蛋白，4．為CMV啟動子。
四．製備含修飾基因的高滴度病毒上清及基因轉染人原始間葉幹細胞群1．採用PCL-Ampho質粒快速轉染系統，與逆轉錄病毒載體共轉染293Kj細胞。將PCL及病毒載體20微克質粒DNA加入725微升(0、25M)氯化鈣與(PH7、0)725微升2倍HBS緩衝液混勻，再與2百萬個293Kj細胞共培養(37℃)6小時。取出轉染液加入15％甘油緩衝液5毫升，休克細胞1分鐘，加入5毫升培養液培養細胞，第二及第三天收集含修飾基因的病毒上清液。
2．採用VSV-G質粒富集病毒系統，與病毒載體及PCL質粒共轉染後，收集的病毒上清經Beckman L3-50超離心50000g(4℃)90分鐘，然後以0.1％Hanks液4℃溶解病毒沉澱12小時。經該系統病毒可濃縮200-2000倍，病毒上清滴度可達2×109(集落形成單位/毫升)。
3．基因轉染採用膠原包被轉孔膜培養板、流式病毒轉染方法。將膠原包被的0.4μm孔轉孔器放置於細胞培養板，病毒上清持續穿流轉膜，以富集病毒上清，與被轉染細胞共培養24小時2次，中間相隔12小時，細胞培養及基因轉染全過程在低血清培養基進行。該病毒轉染可獲得人間葉幹細胞基因轉染陽性率高達20-50％。參見圖3。其中5．為VSV-G用以富集病毒上清，6．為CMV LN增強子啟動子，7．為gag基因，8．為pol基因，9．為Ampho基因，10．為293kj細胞，11．為L3-50超離心機，12．為富集的病毒，13．為轉孔細胞培養板，14．為人原始間葉幹細胞群與病毒共培養、轉染細胞，15．為基因修飾的人原始間葉幹細胞群回輸病員，以滿足多種臨床用途。
五．人原始間葉幹細胞群的應用1．基因修飾後的人原始間葉幹細胞群應用於骨骼癒合骨骼生長發育中經過三個主要過程細胞趨化、有絲分裂及分化成骨細胞。創傷後等可誘發後天性骨骼再建，骨形成蛋白可誘導成骨祖細胞，已定向成骨祖細胞無需外源信號可形成前成骨細胞、成骨細胞及骨細胞。
基因修飾後的人原始間葉幹細胞群應用於骨骼癒合病理性骨不聯合、骨延期癒合、粉碎性骨折或全關節的修復等病員，尤其有效應用於因自體骨移植或可提供骨不足造成骨缺失的癒合。
富集人原始間葉幹細胞，選擇誘導成骨細胞生成培養基培養，並將具有誘導成骨細胞的基因(骨形成蛋白2或4或胰島素生成因子等)克隆於IRES的上遊MSCV-IRES-EGFF載體成為MSCV-X-IRES-EGFP載體，共轉染293Kj細胞，收集病毒上清轉導人原始間葉幹細胞群，流式細胞儀分析收集基因修飾的間葉細胞(最終將分化成成骨細胞)。以5×106細胞/每毫升與填充物以3比1容積混勻，注入骨缺失部位。填充物為均一，瀦留間葉細胞群、允許血管內生長的物質(如羥磷灰石及磷酸三鈣等)。
2．肌營養原蛋白基因修飾改善肌營養退行性變肌營養不良系進行性近端肌萎縮，可波及心臟等。特徵為血肌酸激酶增加，肌纖維蛋白降解，分子水平為平滑肌缺乏肌營養原蛋白，如波及胃腸可導致胃酸排空延遲、急性胃擴張、假性腸阻塞。
以往動物實驗表明肌原蛋白基因表達50倍可糾正肌營養不良功能。將含有肌原蛋白基因克隆於IRES上遊，將突變tyr22DHFR基因替代EGFP基因，構建成MSCV-肌原蛋白-IRES-tyr22DHFR基因修飾載體，該載體特點為tyr22DHFR基因為甲氫葉酸(MTX)耐藥基因(Zhao,RCH.,etal,Blood,1997；12:4687)，可加壓誘導引起該肌原蛋白-IRES-tyr22DHFR基因考貝數增加，以獲得基因高表達糾正肌營養不良。
人原始間葉幹細胞群在較佳的誘導肌細胞生成培養基培養，將含MSCV-肌原蛋白-IRES-tyr22DHFR基因病毒上清轉導間葉細胞，即病毒考貝與人間葉細胞20比1，在含有8微克魚精蛋白低血清培養基共培養24小時二次，中間相隔12小時。經甲氫葉酸(0.25微摩爾)含胎牛血清培養基篩選2周，將表達該載體的人間葉細胞注射肌營養不良患處，含肌原蛋白修飾的肌細胞將與病理性肌纖維融合，最終糾正肌營養不良。
3．基因治療基因缺陷性疾病①血友病A、B系凝血因子Ⅷ、Ⅸ缺乏所致的出血性疾病。重型血友病凝血因子低於正常水平1％。目前血漿或重組因子替代治療為主要治療手段。該常規治療的不足為藥物昂貴及凝血因子體內半衰期短。
②粘多糖貯積病為致命溶酶體貯積失調，由於缺乏IDS所致嚴重骨、神經症狀。唯一治療系對症治療及骨髓移植，但療效不顯。
③囊性纖維變性系囊性纖維化轉膜調控蛋白缺陷所致。
④多種基因缺陷性疾病均需要建立長期穩定體細胞基因表達分泌系統。人原始間葉幹細胞群具備體外大量擴增，且具有體內外長期分化、增殖特性，聯合逆轉錄病毒可穩定整合體細胞基因組染色體DNA，克服逆轉錄病毒不易轉導非增殖性靶細胞弱點。
該發明採用MSCV逆轉錄病毒具有較強的啟始基因功效，可10倍高效表達於造血幹細胞，並克服基因silencing不足。奠定了該系統實施基因治療的有效性和可行性。
該基因治療特點為較低水平表達可糾正基因缺陷，即使整合基因高水平表達也無明顯副作用。
採用MSCV病員缺陷的正常基因-IRES-EGFP轉導人原始間葉幹細胞群，篩選陽性基因攜帶細胞，凍存細胞，定量回輸病員，評估基因表達水平，觀察治療效果。
4．骨髓微環境重建及促造血基因應用①病員經大量放療、化療後，起支持骨髓造血幹細胞的大量骨髓基質細胞受損傷，不能分泌必需造血因子和表達重要粘附因子以維持正常骨髓微環境。
骨髓微環境的重建是扶持造血幹細胞骨髓重新生長、分化至關重要的因素，也是骨髓移植後病員度過早期危險期的關鍵。
大量放療、化療前，採集病員骨髓，體外培養人原始間葉幹細胞群，凍存，待骨髓移植後回輸病員，為病員恢復提供最佳的骨髓微環境。
②再障病員造血微環境受不同程度的破壞，治療可採集人原始間葉幹細胞群。克隆構建表達人白介素3因子的病毒載體，轉導MSCV-白介素3-IRES-EGFP基因於人原始間葉幹細胞群，回輸再障病員，白介素3在骨髓內表達具有治療再生障礙性貧血的作用。
③貧血，尤其慢性病(如炎症性疾病、風溼性關節炎、嚴重感染、腫瘤等)導致的貧血。將含促紅細胞生成素的逆轉錄病毒轉導人原始間葉幹細胞群，回輸慢性疾病引起貧血的病員。
5．增強免疫、腫瘤疫苗等用途腫瘤疫苗的基因治療涉及細胞及分子水平的免疫系統的調控，組織細胞增殖、分化、存亡的調節。多數腫瘤經轉導細胞因子如GM-CSF、白介素2、4、6、幹擾素等因子可誘導體內特異性腫瘤抗原，以增強體內識別與特異性殺傷如黑色素細胞瘤特異性腫瘤抗原Magel,Martl,gpioo，酪氨酸酶的誘導表達。
該基因治療可用於免疫機能低下或免疫識別障礙所導致的腫瘤。γ-幹擾素已廣泛地應用於毛狀細胞白血病、慢性粒細胞白血病(慢粒)、Kaposi肉瘤、惡性黑色素瘤等。
採用人原始間葉幹細胞群，具有正常造血、免疫潛能早期骨髓細胞，經細胞因子修飾後，具有增強免疫、腫瘤疫苗及抗腫瘤作用。
①慢性粒細胞性白血病，為造血幹細胞惡性腫瘤，大量中、晚幼粒細胞在外周血惡性增殖。α-幹擾素為有效治療慢粒化療之一，將含有α-幹擾素基因的MSCV-α-幹擾素IRES-EGFP病毒基因轉導人原始間葉幹細胞群，回輸病員，可持續骨髓內α-幹擾素治療慢粒病員。
②採用同樣方案可以γ-幹擾素治療慢性粒細胞白血病、毛狀細胞白血病等。
③轉導白介素2、γ-幹擾素可治療全身轉移性腫瘤。
六、人原始間葉幹細胞群分離、體外培養、製備及應用的例作1、獲得病員骨髓原始間葉幹細胞群①分離單個核骨髓細胞採集病員的骨髓細胞，經密度梯度離心1600轉/分骨髓細胞20分鐘，獲得單個核骨髓細胞，經含1％牛血清白蛋白磷酸緩衝液清洗細胞2遍後，懸浮細胞於磷酸緩衝液。
②富集病員原始間葉幹細胞群採用包被抗鼠免疫球蛋白M抗體的磁珠與鼠抗人CD45抗原及抗CD39的單克隆抗體結合後，再與骨髓單個核細胞室溫作用半小時，將與飽和濃度特異性抗體反應的骨髓細胞放置於磁場槽中，經磷酸緩衝液衝洗並收集與磁珠分離的骨髓細胞。將含病員原始間葉幹細胞群的骨髓細胞進一步與抗人CD45、CD39及CD14標記有螢光素抗體反應，經過流式細胞儀分析，分離去除CD45、CD14及CD39陽性的骨髓細胞。該過程去除了骨髓成熟的淋巴細胞、巨核、單核及紅細胞母細胞等。收集病員原始間葉幹細胞群。
2、體外病員原始間葉幹細胞群的培養將獲得病員原始間葉幹細胞群放置於經FN包被的培養板培養。在含有低小牛血清、地塞米松、BB血小板衍化生長因子及內皮生長因子，硒、轉鐵蛋白、胰島素、亞油酸、白蛋白、抗壞血酸、10毫升/升抗黴菌素、/1萬單位青黴素、/1萬微克鏈黴素、25微克二性要素B、F-12營養混合物的DMEM培養基培養，病員原始間葉幹細胞群體外長期生長且維持未分化狀態。
3、克隆構建MSCV-IFN-α-IRES-EGFP逆轉錄病毒載體將病員α幹擾素基因下遊端酶切後，以Klenow酶反應4℃,20分鐘補平，DNA經純化後，以XhoⅠ酶切α幹擾素基因上遊，獲得677bp(XhoⅠ--平端)α幹擾素基因。同樣，MSCV載體以EcoRⅠ酶切後Klenow酶補平，再經XhoⅠ酶切產生相匹配的連接位點。將α幹擾素基因克隆至XhoⅠ--平端的MSCV逆轉錄病毒載體，DNA序列分析證實獲得MSCV-IFN-α-IRES-EGFP載體參見圖4。
4、獲得高滴度含α幹擾素的病毒上清體外大量擴增MSCV-IFN-α-IRES-EGFP,MSCV及PCL質粒DNA，將20微克上述DNA混勻於725微升0.25摩爾的氯化鈣，再與725微升HBS緩衝液(8.2克氯化鈉，5.9克HEPES,0.21克磷酸氫二鈉，加水至500毫升)振勻形成勻細的DNA沉澱物。
以2×106細胞/每10毫升DMEM培養基培養293Kj細胞於明膠包被的10釐米直徑培養皿，次日待細胞密度為40％，將上述DNA沉澱物加入293Kj細胞共培養37℃,6小時，去掉細胞培養上清，加入5毫升含15％甘油磷酸緩衝液室溫作用細胞1分鐘，以磷酸緩衝液洗293Kj細胞後，加入5毫升DMEM培養基放置於37℃5％的二氧化碳孵育箱培養細胞，第1、2天後收集病毒上清。
5、α幹擾素轉導慢粒細胞系K562抑制其細胞生長將被轉導的K562細胞放置於轉孔培養板上腔，然後加入含高滴度α幹擾素病毒上清或陰性對照MSCV病毒上清，與K562細胞共同培養24小時2次，中間相隔12小時以細胞培養基培養。第2天後，採用流式細胞儀分離、同時表達綠螢光蛋白和α幹擾素的K562細胞及僅綠螢光蛋白表達的MSCV對照組K562細胞，觀察α幹擾素對K562細胞的生長影響。
①PCR檢測α幹擾素轉導的K562細胞α幹擾素基因設計α幹擾素上遊引物，5』-CAG TTC CAG AAG GCT CAA GC-3』及下遊引物5』-ACC TCC TGC ATC ATA CAG GC-3』和內源性對照基因β-Actin上、下遊引物，抽取及純化α幹擾素或MSCV轉導的K562細胞DNA，體外在95℃,1分鐘；58℃,1分鐘；72℃,1分鐘；30循環後72℃延伸7分鐘，以擴增α幹擾素基因。α幹擾素轉導K562細胞可擴增173bp長度α幹擾素基因，而MSCV對照組為陰性。證實α幹擾素基因已攜帶於K562細胞DNA中。
②α幹擾素抑制K562細胞生長觀察α幹擾素轉導K562細胞生長，對照組採用MSCV轉導K562細胞，將慢粒細胞系K562細胞以1×105/每孔放置12孔細胞培養板，繼續觀察細胞增殖。測定1至4天細胞增殖數，每次取50微升細胞懸液與胎盤藍染色活性細胞計數。結果表明對照組與α幹擾素轉導的K562細胞第1天細胞增殖相當為12×104/每毫升，自第2天α幹擾素轉導K562細胞生長開始受到抑制，第4天細胞顯著受抑制，對照組細胞數為90×104/每毫升，而α幹擾素轉導K562細胞僅30×104/每毫升。
6、α幹擾素轉導骨髓CD34陽性細胞無抑制集落形成作用採用同樣方法將α幹擾素基因轉導CD34陽性細胞，經流式細胞儀分離α幹擾素陽性骨髓CD34細胞。觀察α幹擾素基因對骨髓CD34陽性細胞集落形成的影響。對照組為MSCV轉導的CD34陽性細胞，測定造血細胞CFU-GM集落生長採用CD34陽性的5000細胞放置於含10毫微克/毫克白介素6、白介素3、G-CSF以及3單位/每毫升促紅細胞生成素的半固體瓊脂培養體系。經37℃含5％二氧化碳孵育箱培養2周後，在倒置顯微鏡下觀察GM集落形成單位及BFU-E(紅系集落形成單位)並計數。結果表明對照組與α幹擾素組集落相當，約為250單位。提示α幹擾素基因無明顯骨髓CD34陽性細胞集落形成抑制作用。
7、α幹擾素轉導人原始間葉幹細胞群將α幹擾素病毒上清用以轉導人原始間葉幹細胞群，獲得38％高效轉導人原始間葉幹細胞。經流式細胞儀富集α幹擾素陽性病員原始間葉幹細胞群，凍存，分批回輸病員，應用於慢粒病員的治療。
本發明的優點是1．分離人原始間葉幹細胞群簡捷、可行、重複好。
2．人原始間葉幹細胞群可體外大量擴增，第八周多達1千萬倍，且仍保持原間葉幹細胞分化、增殖潛能及表型。
3．人原始間葉幹細胞群可多向分化成成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、骨髓基質細胞，以及本發明首次報導可分化的多種血管內皮細胞及平滑肌細胞等。
4、人原始間葉幹細胞群，克服了胚胎幹細胞的來源困難，體外無法誘導分化成特異組織等不足，又可提供多種造血幹細胞所無法提供的間葉組織細胞。
5．人原始間葉幹細胞群結合逆轉錄病毒為有效、可行的基因治療系統。可長期穩定表達經病毒整合人體細胞染色體DNA的修飾基因，達到基因治療目的。人原始間葉幹細胞群大量增殖允許逆轉錄病毒穩定整合人基因組染色體DNA；轉染後，該細胞仍保持間葉幹細胞原有分化、增殖潛能，體內外可長期穩定表達修飾的基因。
克服腺病毒、腺病毒相關病毒(AAV)極少地轉導基因人基因組DNA的不足，以及該病毒產物所致的體內不良免疫反應。克服Lenti病毒不善安全等不足。
6、MSCV逆轉錄病毒載體具高效表達修飾基因於幹細胞，無silencing；採用IRES無內源啟動子所致基因表達幹擾；選用增強綠螢光蛋白快捷分離含修飾基因的陽性細胞。
7、採用快速轉染富集病毒系統，可三天內獲得病毒上清高達2×109。
8．採用包被轉孔培養器流式病毒轉染，可獲得基因轉染人間葉幹細胞率高達20-50％。
9．人原始間葉幹細胞群可誘導多向分化，應用於骨骼修復、平滑肌基因治療、造血微環境重建、基因缺陷性疾病基因治療、抗腫瘤疫苗、增強造血、免疫等多種用途。
權利要求
1.一種人原始間葉幹細胞群(HTMSC)的分離、體外培養、製備及應用方法，其特徵在於以免疫的方法採用磁場去除成熟骨髓細胞，結合流式細胞儀分離體積大的人原始間葉幹細胞群，經體外含有較低血清濃度的優化培養體系培養，誘導多向分化，迅速擴增。人原始間葉幹細胞群及基因修飾後的人原始間葉幹細胞群廣泛應用於人體臨床。
2.根據權利要求1所述的人原始間葉於細胞群，其特徵在於可分化成成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、腱、骨髓基質細胞、特別是平滑肌細胞、多種血管內皮細胞等多種間葉組織的具有自我更新能力的人原始間葉幹細胞群。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於提取人體骨髓細胞或臍帶血細胞離心，採用包被抗鼠免疫球蛋白M抗體的磁珠與鼠抗人CD45抗原、抗CD39抗體的單克隆抗體結合，在磁場槽中收集與磁珠分離的骨髓細胞，經流式細胞儀分析，去除骨髓成熟細胞，收集大體積的人原始間葉幹細胞群。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於對人原始間葉幹細胞群採用含有低濃度小牛血清及地塞米松、BB血小板衍化生長因子及內皮生長因子、硒、轉鐵蛋白、胰島素、亞油酸、白蛋白、抗壞血酸、抗黴菌素、青黴素、鏈黴素、二性要素B、F-12營養混合物的較低血清濃度的優化培養體系培養，可體外大量擴增呈指數增殖，仍保持人間葉幹細胞未分化原始狀態。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於人原始間葉幹細胞群在特定培養基中可迅速、均一誘導定向分化為多種間葉細胞①經含地塞米松、抗壞血酸、β磷酸甘油及β轉化生長因子超家族蛋白、生長因子等成分的培養體系培養分化為成骨細胞②經含β轉化生長因子或抑制素A、軟骨刺激活性因子骨形成蛋白4等成分的培養體系培養分化為軟骨細胞。③經含特異性細胞因子等誘導培養基培養分化為基質細胞④經含地塞米松、1甲基3異丁黃嘌呤、胰島素及茚甲新培養基誘導培養分化為脂肪細胞。⑤經含人血管內皮生長因子培養基培養分化為內皮細胞。⑥經含5-azacytidine培養基誘導分化為肌細胞。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵是以採用逆轉錄病毒載體，整合基因於人原始間葉幹細胞群高效表達，採用內核糖體啟始序列起始表達耐藥篩選基因以及採用最佳篩選基因螢光蛋白完成原始間葉幹細胞基因修飾。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵是以採用PCL-Ampho質粒快速轉染系統與逆轉錄病毒載體共轉染293Kj細胞、採用VSV-G質粒富集病毒系統，與病毒載體及PCL質粒共轉染以及採用包被轉孔培養器流式病毒轉染方法，以富集病毒上清與被轉染細胞共培養，製備含修飾基因的高滴度病毒上清及基因轉染人間葉幹細胞。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵是人原始間葉幹細胞群及基因修飾後的人原始間葉幹細胞群，廣泛應用於人體臨床①基因修飾骨骼癒合。將具有誘導成骨細胞的基因克隆於IRES的上遊MSCV-IRES-EGFP載體成為MSCV-X-IRES-EGFP載體，共轉染293Kj細胞，經流式細胞儀分析、收集基因修飾的人間葉細胞並與填充物按比例容積混勻，注入骨缺失部分。②肌營養原蛋白基因修飾改善肌營養退行性變。將含MSCV-肌原蛋白-IRES-tyr22DHFR基因病毒上清轉導人原始間葉幹細胞群在魚精蛋白低血清培養基共培養，經甲氫葉酸含胎牛血清培養基篩選後，將表達該載體人間葉細胞注射肌營養不良患處，糾正肌營養不良。③基因治療基因缺陷性疾病。採用MSCV病員缺陷的人正常基因-IRES-EGFP轉導人原始間葉幹細胞群，篩選陽性基因攜帶細胞，凍存，定量回輸血友病A、B系凝血因子Ⅷ、Ⅸ缺乏所致出血性疾病、粘多糖貯積病、囊性纖維變性等多種基因缺陷性疾病病員。較低水平表達可糾正基因缺陷、整合基因高水平表達無明顯副作用。④骨骼微環境重建及促造血基因。(1)採集病員骨髓，體外培養人原始間葉幹細胞群，凍存，待病員放療、化療、骨髓移植後回輸病員，為放療、化療病員恢復提供最佳骨髓微環境。(2)克隆構建表達人白介素3因子的病毒載體，轉導MSCV-白介素3-IRES-EGFP基因於人原始間葉幹細胞群，回輸再障病員，治療再生障礙性貧血。(3)將含促紅細胞生成素的逆轉錄病毒轉導人原始間葉幹細胞群，回輸病員，治療慢性疾病引起的貧血。⑤增強免疫、腫瘤疫苗。將含有α-幹擾素基因的MSCV-α-幹擾素-IRES-EGFP病毒基因轉導人原始間葉幹細胞群，回輸病員，治療慢性粒細胞性白血病。採用上述同樣方式，可以γ-幹擾素治療慢性粒細胞白血病、毛狀細胞白血病等。轉導白介素2、γ-幹擾素治療全身轉移性腫瘤。
全文摘要
本發明公開一種人原始間葉幹細胞群(HTMSC)的分離、體外培養、製備及應用方法。採用抗人CD45抗原、抗CD39抗體免疫方法,經磁場分離出人原始間葉幹細胞群。在體外含有較低血清濃度的優化培養體系培養,誘導多向分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、腱、骨髓基質細胞、特別是平滑肌細胞、血管內皮細胞等多種間葉組織具有自我更新能力的人原始間葉幹細胞群。可迅速擴增。人原始間葉幹細胞群及基因修飾後的人原始間葉幹細胞群廣泛應用於人體臨床。
文檔編號C12N5/0789GK1287166SQ99117589
公開日2001年3月14日 申請日期1999年9月8日 優先權日1999年9月8日
發明者何清華 申請人:何清華