用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光pcr檢測的引物、探針及其方法

2023-07-12 04:36:46 1

專利名稱：用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光pcr檢測的引物、探針及其方法
技術領域：
本發明屬於植物檢疫技術領域，涉及用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的 引物、探針，另外本發明還涉及其檢測方法。
背景技術：
杏褪綠卷葉植原體屬於國家質量監督檢驗檢疫總局新發布的《進境植物檢疫性有 害生物名錄》中列出的果樹檢疫性植原體之一，是對我國果樹產業有高風險性的病害。長 期以來，杏褪綠卷葉植原體的檢測通常採用免疫電鏡法方法，該檢測方法繁雜、檢測靈敏度 低，這些問題一直困擾著檢疫人員，因此研發一套快速、準確，操作簡便的方法，才能滿足檢 疫工作的需求。

發明內容
本發明的目的是克服上述不足問題，提供一種用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光 PCR檢測的引物、探針，對杏褪綠卷葉植原體有較強的特異性，能較好的區分植原體和細菌， 並且對不同組間的植原體鑑別能力較強，特異性較好。另外本發明還提供用於杏褪綠卷葉 植原體實時螢光PCR檢測方法，檢測方法快速、準確，檢測靈敏度高、精度高。本發明為實現上述目的所採用的技術方案是用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光 PCR檢測的引物、探針含有一條特異性Cycling探針和一對引物
(1)探針(父!^丫Probe) :5，-(FAM) ATTCTGACTGTA-3，
(2)引物(XTLJYPrimer-F) :5，-ACTCTGACCGAGCAACGCC -3， (XTLJY Primer-R) :5，- GATAACGCTTGCCCCCTATG -3，
其中方框內為RNA鹼基。所述用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針，合成方法是首先在 基因庫(Genebank)中搜集全部植原體及有代表性細菌的16srDNA核酸序列，採用DNASTAR 軟體進行序列比對，找出杏褪綠卷葉植原體與其他植原體的基因差異位點，設計出實時熒 光 PCR 循環(Cycling)探針(XTLJY Probe)及引物(XTLJY Primer-F, XTLJY Primer-R), 並於生物公司合成。所述用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針，驗證方法是 XTLJY Probe特異性驗證將杏褪綠卷葉植原體、2種以上檢疫性植原體及2種以上不
同屬的細菌DNA作為模板進行XTLJY Probe特異性驗證，PCR反應體系
PCR反應條件預變性95°C lOsec;變性95°C 5sec，退火55°C lOsec，延伸72°C 15sec,45cycles ；
XTLJY Probe特異性驗證通過後，即表明該引物及探針可應用於杏褪綠卷 葉植原體的檢測。所述特異性驗證中提取杏褪綠卷葉植原體樣本DNA，先進行擴繁採用植原體 通用引物對 R16mF2 5 』 -CATGCAAGTCGAACGGA-3，，R16mRl 5，-CTTAACCCCAATCATCGA-3， 進行第一輪擴增，可得到大小為1700bp左右片段；然後用第二對引物對R16F2: 5，-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3，，R16R2: 5，-TGACGGGCGGTGTGTAC AAACCCCG-3，進行巢氏 PCR 擴增，將得到大小為1200bp左右片段；
其中兩輪PCR擴增體系及條件如下 10 X Buffer2. 5 u 1
2.5mMdNTP2u 1
引物-F (lOumol/L) 2 ill 引物-R (lOumol/L) 2 ill 2U Taq DNA 聚合酶0. 2 ii 1
模板 DNA2 ill
加入雙蒸水至終體積為25iU ；
PCR反應條件為:94°C預變性6min ；94°C變性45sec，52°C退火45sec，72°C延伸lmin， 35個循環後於72°C保溫10 min，4°C冰箱中保存；
將上述片段進行克隆，轉化入質粒(T-載體)，進行擴繁、測序，所得杏褪綠卷葉植原體 質粒備用。所述特異性驗證中不同菌屬的DNA分別是取自下述5個菌屬中的典型菌種細菌 黃單胞(Xanthomonas)、細菌歐氏桿菌屬(Erwinia)、細菌土壤桿菌屬(Agrobacterium)、細 菌假單胞(Pseudomonas)、細菌棒形桿菌(Clavibacter)。所述特異性驗證中不同菌屬的DNA分別是取自下述5個典型菌種辣椒斑點病 菌(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria formerly)、古月蘿蔔軟腐病菌(Erwinia carotovora pv. campestris)、根癌土壤桿菌(Agrobacterium tume faciens)、細菌性葉斑 (Pseudomonas syringae)、番前饋痛病菌(Clavibater michiganensis)。所述特異性驗證中多種檢疫性植原體的DNA分別是取自下述植物組中的一種或 多種典型植原體植原體蘋果叢簇組(phytoplasma apple proliferation group)、植原 體榆樹黃化組(Phytoplasma ash yellows group)、X-病組(X-disease group)、僵頂病組 (Stolbur group)、愉黃化組(Elm Yellews group)。所述特異性驗證中多種檢疫性植原體的DNA分別是取自下述植原體蘋果叢簇植 原體(apple proliferation phytoplasma)、梨衰退植原體(Pear decline phytoplasma)、 杏褪綠卷葉植原體(Ash yellows phytoplasma)、櫻桃致死植原體(Cherry lethal yellows phytoplasma)、桃X植原體(Peach X phytoplasma)、澳大利亞葡萄黃化植原體 (Australian Grapevine Yellows phytoplasma)、維吉尼亞葡萄黃化植原體(Virginia grapevine yellows phytoplasma)、葡萄金黃化植原體(Grapevine flavescence doree phytoplasma)。
5
所述XTLJY Probe靈敏度測試將杏褪綠卷葉植原體質粒進行濃度測定，並稀釋 不同的濃度梯度，進行XTLJY Probe靈敏度測試，反應體系及條件同特異性驗證反應體系， 檢測靈敏度達0.本發明用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測方法將待測樣品進行總DNA提 取(採用TIANGEN植物總DNA提取試劑盒)，分別設陽性對照、健康植株總DNA對照及清水對 照，採用XTLJY Probe探針及XTLJY Primer引物對，進行日常檢測；
實時螢光PCR反應體系如下
PCR反應條件預變性95°C lOsec;變性95°C 5sec，退火55°C lOsec，延伸72°C 15sec,45cycles。本發明充分考慮到檢疫工作的特殊性，並針對杏褪綠卷葉植原體的特點，研製了 一套實時螢光PCR Cycling探針及引物，具有特異性的檢測出杏褪綠卷葉植原體的功能。本 發明還提供相配套檢測方法，由於採用了上述實時螢光PCR引物、探針及檢測方法，能快速 準確的檢測出樣品中含有的杏褪綠卷葉植原體，並排除其他植原體及細菌，其檢測靈敏度 達0. Zpg」，檢測快速、簡便而且準確，可滿足實驗室日常檢測工作的需求，大幅提高杏 褪綠卷葉植原體的檢疫技術水平，提高該病害的檢出率，有效地防止其傳入我國。四

圖1是XTLJY Probe特異性驗證實時螢光PCR反應曲線。圖2是XTLJY Probe靈敏度測試實時螢光PCR反應曲線。五具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步介紹，但本發明並不局限於具體實施例。實施例1
合成用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針 首先在Genebank中搜集全部植原體及有代表性細菌的16srDNA核酸序列，採用 DNASTAR軟體進行序列比對，找出杏褪綠卷葉植原體與其他植原體的基因差異位點，設計出 實時螢光 PCR Cycling 探針(XTLJY Probe)及引物(XTLJY Primer-F、XTLJY Primer-R), 並於生物公司合成，合成一條特異性Cycling探針和一對引物
(1)探針(XTLJYProbe) :5，-(FAM) ATTCTGACTGTA-3，
(2)引物(XTLJYPrimer-F) :5，-ACTCTGACCGAGCAACGCC -3， (XTLJY Primer-R) :5，- GATAACGCTTGCCCCCTATG -3，
注方框內為RNA鹼基。
均勻性、穩定性測試 1、特異性測試
採用8種植原體及不同屬的5種細菌(見附表1)進行XTLJY Probe的特異性驗證(其中植原體及細菌可以根據實際情況選擇合適的種類及數量)，其實時螢光PCR反應體系 為
PCR 反應條件預變性 95°C lOsec;變性 95°C 5sec，退火 55°C lOsec，45cycles ；延伸 72 °C 15sec。為保證驗證用DNA的數量，其中提取杏褪綠卷葉植原體樣本DNA先進 行擴繁採用植原體通用引物對(R16mF2: 5，-CATGCAAGTCGAACGGA-3』，R16mRl: 5』 -CTTAACCCCAATCATCGA-3』)進行第一輪擴增，可得到大小為1700bp左右片段，然後用 第 二對引物(R16F2: 5，-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3， ， R16R2: 5，-TGACGGGCGGTGTGTAC AAACCCCG-3』)進行巢氏PCR擴增，將得到大小為1200bp左右片段。PCR擴增體系及條件如 下
10 X Buffer2. 5 u 1
2.5mMdNTP2u 1
引物-F (lOumol/L) 2 ill 引物-R (lOumol/L) 2 ill 2U Taq DNA 聚合酶0. 2 ii 1
模板 DNA2 ill
加入雙蒸水至終體積為25 yl。PCR 反應條件為94°C 預變性 6min ；94°C變性 45sec，52 °C 退火 45sec，72 °C 延伸 lmin，35個循環後於72°C保溫10 min，4°C冰箱中保存。上述片段進行克隆，轉化入質粒，進 行擴繁、測序；將上述杏褪綠卷葉質粒、7種檢疫性植原體及5種不同屬的細菌DNA作為模 板進行XTLJY Probe特異性驗證。測試結果見表2和圖1 該探針能準確檢測出杏褪綠卷葉植原體，其他測試植原 體、細菌及清水對照均為陰性。由此可見，XTLJY Probe針對杏褪綠卷葉植原體有較強的特 異性，能較好的區分植原體和細菌，並且對不同組間的植原體鑑別能力較強，特異性較好。 XTLJY Probe特異性驗證通過後，即表明該引物及探針可應用於杏褪綠卷葉植原體的檢測。2、靈敏度測試
本試驗將杏褪綠卷葉植原體DNA同樣按10倍比例系列稀釋了 10個濃度梯度，分別 為 XTL-1 :200ngr\ XTL-2 20 ngF\ XTL-3 :2ngF\ XTL-4 200 pg ？？ 1人 XTL-5 :20pgr\ XTL-6 :2pgF\ XTL-7 0. 2pgF\ XTL-8 0. 02 pg ？？ r1、 XTL-9 0. 002pgr\ XTL-10 :0. OOC^pg〗4。結果如圖 2 所示，當 DNA 濃度稀釋 至0. (^pg〗—1時，Ct值已大於35，而Ct值在35之後可視為無效反應。因此，應用本 方法檢測杏褪綠卷葉植原體DNA模板最小濃度為0. 2pgr1,即該探針檢測靈敏度為 o. 2Pgr10相對於目前檢測方法具有較高檢測的靈敏度。實施例2
7用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測方法
按實施例1所述方法合成用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針，(1) 探針(XTLJY Probe) :5，-(FAM) ATTCTGACTGTA -3，
(2)引物(XTLJY Primer-F) :5，-ACTCTGACCGAGCAACGCC -3，
(XTLJY Primer-R) :5，- GATAACGCTTGCCCCCTATG -3， 注方框內為RNA鹼基。XTLJY Probe特異性驗證通過後，進行檢測用。將待測樣品進行總DNA提取(採用TIANGEN植物總DNA提取試劑盒)，分別設陽性 對照、健康植株總DNA對照及清水對照，採用XTLJY Probe及引物，進行日常檢測，實時螢光 PCR反應體系
PCR 反應條件預變性 95°C lOsec;變性 95°C 5sec，退火 55°C lOsec，45cycles ；延伸 72 °C 15sec。 表1供試植原體及細菌名單
表2 XTLJY Probe特異性驗證結果 序列表
王，有福 姜，麗 李，鑫 劉，卉秋
用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針及其方法
2010102184980
<140)2010102184980
2010-07-06
3
PatentIn version 3. 5
1
12
DNA
Ash yellows phytoplasma
misc_feature (9). . (9) RNA 1
attctgactg tal權利要求
用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針，其特徵是含有一條特異性Cycling探針和一對引物(1)探針(XTLJY Probe)5』 (FAM) ATTCTGACTGTA 3』(2)引物(XTLJY Primer F)5』 ACTCTGACCGAGCAACGCC 3』 (XTLJY Primer R)5』 GATAACGCTTGCCCCCTATG 3』其中方框內為RNA鹼基。
2.根據權利要求1所述的用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針，其 特徵是其合成方法是首先在基因庫(Genebank)中搜集全部植原體及有代表性細菌的 IBsrDNA核酸序列，採用DNASTAR軟體進行序列比對，找出杏褪綠卷葉植原體與其他植原體 的基因差異位點，設計出實時螢光PCR循環(Cycling)探針(XTLJY Probe)及引物(XTLJY Primer-F、XTLJY Primer-R),並於生物公司合成。
3.根據權利要求1所述的用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針，其特 徵是其XTLJY Probe特異性驗證將杏褪綠卷葉植原體、2種以上檢疫性植原體及2種以 上不同屬的細菌DNA作為模板進行XTLJY Probe特異性驗證，PCR反應體系 PCR反應條件預變性95 °C IOsec ；變性95 °C 5sec，退火55°C lOsec，延伸72°C 15sec,45cycles ；XTLJY Probe特異性驗證通過後，即表明該引物及探針可應用於杏褪綠卷 葉植原體的檢測。
4.根據權利要求3所述的用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針， 其特徵是其特異性驗證中提取杏褪綠卷葉植原體樣本DNA，先進行擴繁採用植原體通 用弓 I 物對 R16mF2: 5，-CATGCAAGTCGAACGGA-3，，R16mRl 5，-CTTAACCCCAATCATCGA-3， 進行第一輪擴增，可得到大小為1700bp左右片段；然後用第二對引物對R16F2: 5，-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3，，R16R2: 5，-TGACGGGCGGTGTGTAC AAACCCCG-3，進行巢氏 PCR 擴增，將得到大小為1200bp左右片段； 其中兩輪PCR擴增體系及條件如下 IOXBuffer2. 5 μ 1；2.5mMdNTP2 μ 1引物-F (10umol/L) 2μ 1 引物-R (10umol/L) 2μ 1 2U Taq DNA 聚合酶0. 2 μ 1模板DNA2 μ 1加入雙蒸水至終體積為25μ 1 ；PCR反應條件為:94°C預變性6min ；94°C變性45sec，52°C退火45sec，72°C延伸lmin， 35個循環後於72°C保溫10 min，4°C冰箱中保存；將上述片段進行克隆，轉化入質粒(T-載體)，進行擴繁、測序，所得杏褪綠卷葉植原體 質粒備用。
5.根據權利要求3所述的用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針，其特 徵是其特異性驗證中不同菌屬的DNA分別是取自下述5個菌屬中的典型菌種細菌黃單 胞、細菌歐氏桿菌屬、細菌土壤桿菌屬、細菌假單胞、細菌棒形桿菌。
6.根據權利要求3所述的用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針，其特 徵是其特異性驗證中不同菌屬的DNA分別是取自下述5個典型菌種辣椒斑點病菌、胡蘿 卜軟腐病菌、根癌土壤桿菌、細菌性葉斑、番茄潰瘍病菌。
7.根據權利要求3所述的用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針，其特 徵是其特異性驗證中檢疫性植原體的DNA分別是取自下述植物組中的一種或多種典型植 原體植原體蘋果叢簇組、植原體榆樹黃化組、χ-病組、僵頂病組、榆黃化組。
8.根據權利要求3所述的用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針，其特 徵是特異性驗證中檢疫性植原體的DNA分別是取自下述植原體蘋果叢簇植原體、梨衰退 植原體、杏褪綠卷葉植原體、櫻桃致死植原體、桃X植原體、澳大利亞葡萄黃化植原體、維吉 尼亞葡萄黃化植原體、葡萄金黃化植原體。
9.根據權利要求1所述的用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針，其特 徵是XTLJY Probe靈敏度測試將杏褪綠卷葉植原體質粒進行濃度測定，並稀釋不同的濃 度梯度，進行XTLJY Probe靈敏度測試，反應體系及條件同特異性驗證反應體系，檢測靈敏 度達 0.
10.用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測方法，其特徵是將待測樣品進行總DNA 提取，分別設陽性對照、健康植株總DNA對照及清水對照，採用XTLJY Probe探針及XTLJY Primer引物對，進行日常檢測；實時螢光PCR反應體系如下 PCR反應條件預變性95 °C IOsec ；變性95 °C 5sec，退火55°C lOsec，延伸72°C 15sec,45cycles。
全文摘要
本發明屬於植物檢疫技術領域，涉及用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針，另外本發明還涉及其檢測方法。用於杏褪綠卷葉植原體實時螢光PCR檢測的引物、探針，其特徵是含有一條特異性Cycling探針和一對引物(1)探針(XTLJYProbe)5』-(FAM)ATTCTGACTGTA-3』；(2)引物(XTLJYPrimer-F)5』-ACTCTGACCGAGCAACGCC-3』；(XTLJYPrimer-R)5』-GATAACGCTTGCCCCCTATG-3』；其中方框內為RNA鹼基。本發明通過大量的植原體及細菌ITS序列比對，設計了一套實時螢光PCRCycling探針及引物，其靈敏度達0.2pgl-1，可以快速準確的從樣品中檢測出杏褪綠卷葉植原體，該方法操作簡單，易於掌握，可廣泛應用於實驗室日常檢測工作。
文檔編號C12Q1/04GK101899509SQ201010218498
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月6日 優先權日2010年7月6日
發明者劉卉秋, 姜麗, 李鑫, 王有福 申請人:王有福;姜麗;李鑫;劉卉秋