一種臨床用間充質幹細胞的製備方法
2023-07-12 14:48:06
一種臨床用間充質幹細胞的製備方法
【專利摘要】本發明提供一種臨床用間充質幹細胞的製備方法，本發明製備方法在胳帶採集前對產婦進行篩選，以符合條件的健康足月產婦志願者作為採集目標，之後進行分離擴增進行規模化培養直至第三代，進行冷凍保存，對分離過程及冷凍過程的的中間品進行一系列質量檢測，冷凍後細胞復甦洗滌待用，活率無明顯降低。本發明擬從原料採集開始直至細胞製備完成的全過程進行臨床級、統一、系統監控，以實現間充質幹細胞的臨床標準產品o
【專利說明】-種臨床用間充質幹細胞的製備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬細胞生物學領域，具體涉及一種臨床用間充質幹細胞的製備方法。
【背景技術】
[0002] 幹細胞（Stem Cells, SC)是一類具有自我複製能力（self-renewing)的多潛能細 胞，是原始且未特化的細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞，具有再生各種組 織器官和人體的潛在功能。幹細胞存在所有多細胞組織裡，能經由有絲分裂與分化來分裂 成多種的特化細胞，而且可以利用自我更新來提供更多幹細胞。幹細胞的來源有很多，包括 臍帶、臍帶血與骨髓。
[0003] 嬰兒出生後遺留在胎盤和臍帶中的血是幹細胞的重要來源。臍帶血中的造血幹細 胞可以用來治療多種血液系統疾病和免疫系統疾病，包括血液系統惡性腫瘤（如：急性白 血病、慢性白血病、多發性骨髓瘤、骨髓異常增殖綜合症和淋巴瘤等）、血紅蛋白病（如：海 洋性貧血）、骨髓造血功能衰竭（如：再生障礙性貧血）、先天性代謝性疾病、先天性免疫缺 陷疾患、自身免疫性疾患、某些實體腫瘤（如：小細胞肺癌、神經母細胞瘤、卵巢癌和進行性 肌營養不良等）。自1988年臍血幹細胞就用來治療根達綜合症、亨達綜合症、和拉綜合症 和急性淋巴細胞性白血病等許多兒童疾病。截至2011年，臍帶血不僅已能有效地治療幾十 種難治性疾病和多種不治之症，而且它所能治療的疾病種類還在不斷地增加。自體儲存的 臍帶血一旦需要使用時，不需配型，細胞活性強，無免疫排斥的危險，移植成活率高，治癒率 高，醫療費用低。
[0004] 在人臍帶中有一類具有幹細胞特徵的細胞群體，被稱為人間充質幹細胞（MSCs)。 人間充質幹細胞具有自我更新和多向分化的潛能，在不同誘導條件下可分化為三胚層細 胞，如骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞和神經細胞等。此外，還表達IL6、G-CSF和SCF 等多種造血細胞生長所需要的因子，能夠維持長期培養的造血祖細胞增殖，顯示MSC具有 支持造血和促進造血恢復的作用。同時研究表明MSC具有免疫調節作用，在體外能夠抑制T 淋巴細胞增殖，體內動物實驗發現MSCs移植可以抑制異體免疫反應，減輕移植相關的排斥 反應，並延長異體移植物的存活時間。最近的臨床試驗發現MSCs聯合造血幹細胞移植可以 減輕GVHD並降低移植失敗率。MSC的多向分化能力和免疫調節能力決定了其在細胞治療、 組織工程等領域具有廣闊的應用前景。
[0005] 目前常規培養間充質幹細胞多用動物血清，如雞、豬、牛等，其中胎牛血清因獲取 量大、汙染輕而被廣泛應用。但近年隨著人畜共患病發病率的增加，以異種血清培養的組織 向臨床應用的安全性受到質疑，因此自體血清培養越來越受到重視。
[0006] 中國發明專利ZL200610067537. 5公開了一種臍帶間充質幹細胞的製備方法，其 步驟包括諸如：將人臍帶去除殘留血液，剪碎，用膠原酶消化；再加入胰酶消化；消化液用 篩網過濾，去除未消化組織；將過濾後的消化液用磷酸緩衝液稀釋；離心；以及將細胞接種 於培養基內進行培養等。
[0007] 中國發明專利申請200910194915. X公開了一種臍帶血間充質幹細胞及其製備方 法，分離並獲取了具有成骨分化潛能的UCB-MSCs細胞亞群的幹細胞。其技術手段主要涉及 將來自臍血的間充質幹細胞的單細胞懸液和螢光標記的CD105單克隆抗體混合後，通過流 式細胞儀分選得到⑶105陽性（⑶105+)的臍帶血間充質幹細胞。該幹細胞接種於醫學上 可接受的生物可降解材料，形成了骨移植物。
[0008] 但目前公開的各類間充質幹細胞製備方法雖均能獲得間充質幹細胞，但都不符合 臨床應用的標準，本發明擬從原料採集開始直至細胞製備完成的全過程進行臨床級、統一、 系統監控，以實現間充質幹細胞的臨床標準產品。
【發明內容】
[0009] 針對現有技術缺陷，本發明提供一種臨床用間充質幹細胞的製備方法，本發明制 備方法在臍帶採集前對產婦進行篩選，以符合條件的健康足月產婦志願者作為採集目標， 之後進行分離擴增進行規模化培養直至第三代，進行冷凍保存，對分離過程及冷凍過程的 的中間品進行一系列質量檢測，冷凍後細胞復甦洗滌待用，活率無明顯降低。
[0010] 本發明提供一種臨床用間充質幹細胞的製備方法，所述製備方法包括如下步驟：
[0011] 步驟一、臍帶篩選與保存：篩選、採集健康足月產婦志願者臍帶，置於臍帶保存液 中4°C冷藏，並於24小時內進行分離處理；
[0012] 步驟二、臍帶分離：將臍帶轉移到培養皿中，生理鹽水清洗；去除兩端結紮部位， 剝除臍靜脈和兩條臍動脈；展平，撕下華通氏膠，去除羊膜；將撕下的華通氏膠置於離心管 中剪碎至1?4mm3小塊；
[0013] 步驟三、間充質細胞原代培養：將剪碎的華通氏膠轉至裝有完全培養基的透氣蓋 培養瓶中，在37°c、5% CO2、飽和溼度環境中培養；細胞密度達約lg/T75瓶，第5天首次換 液，此後每3天換液一次，至第14天左右；細胞融合度達80%以上時，用胰蛋白酶消化傳 代，用原培養上清終止；
[0014] 步驟四、傳代培養：傳代時，傳代細胞接種密度約為6000個/cm2 ;3天後，細胞密 度達80%以上，再次傳代；傳至第三代，細胞數約為3?5 X 109,收集細胞並計數和活率，按 2 X IOVml/管進行冷凍保存；將細胞上清進行無菌檢測、支原體檢測，取I X IO7細胞做細胞 表面標誌檢測；
[0015] 步驟五、間充質幹細胞表面標誌、分化檢測：按照ISCT間充質幹細胞標準檢測陽 性指標以及陰性指標；對第三代細胞進行分化實驗檢測幹細胞分化能力，分別向成脂、成 骨、成軟骨三個方向分化，進行油紅0染色、茜素紅染色和阿爾新藍染色鑑定；間充質幹細 胞表面標誌、分化檢測後，冷凍保存；
[0016] 所述陽性指標如⑶90、⑶105、⑶73等；所述陰性指標如⑶79-a、⑶14、⑶34、⑶45、 HLA-DR ；
[0017] 步驟六、臨床用間幹細胞使用：取冷凍細胞，復甦後用生理鹽水洗滌兩遍，統計細 胞數和細胞活率，根據計數結果按臨床需要將細胞和複方電解質溶液混勻待用；並留樣進 行內毒素和細菌檢測。
[0018] 優選地，步驟一中，所述臍帶保存液為無血清培養基，不含抗生素；可維持臍帶細 胞活性長達24?48小時，避免了臨床應用時的抗生素過敏問題。
[0019] 優選地，步驟一中，所述篩選的檢測項目包括攜帶病毒、遺傳家族史等；所述病毒 如B肝、C肝、愛滋、梅毒等；
[0020] 優選地，步驟三中，所述胰蛋白酶的濃度為0. 05%，由0. 25%成品胰酶稀釋5倍； 用於細胞消化過程，低濃度消化保持細胞活性和幹細胞乾性；所述百分比為質量體積比。
[0021] 優選地，步驟三中，所述完全培養基由基礎培養基和血清替代物以及穀氨醯胺配 比而成，血清替代物比例10% ;穀氨醯胺比例0.02mmol/ml ;用於細胞分離、擴增培養以及 冷凍保護過程，避免不明動物源蛋白進入人體引起的潛在風險；所述百分比為質量體積比。
[0022] 優選地，步驟四中，所述無菌檢測包括用血培養儀進行細菌和真菌檢測；所述支原 體檢測包括用PCR法進行支原體檢測。
[0023] 優選地，步驟四中，所述冷凍保存所用細胞冷凍保護液由完全培養基和二甲基亞 碸（DMSO)配製而成，其中二甲基亞碸（DMSO)終濃度10%;用於保護冷凍細胞的活性；所述 百分比為質量體積比。
[0024] 與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：
[0025] 1、全過程全面質量監控，從臍帶採集前的篩選開始直至細胞製備成成品中間品及 終產品的質量全部受控；
[0026] 2、無血清培養基，不使用抗生素，避免異源蛋白及抗生素可能引起的疾病或過敏 風險；
[0027] 3、規模化培養，保證細胞均一性和有效性；
[0028] 4、低濃度胰酶消化，保持細胞的活性及幹細胞的乾性；
[0029] 5、幹細胞表面標誌檢測的陽性指標表達率99%以上，陰性指標2%以下。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助於本領域的技術 人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術 人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬於本發明 的保護範圍。
[0031] 實施例1
[0032] 本實施例提供一種臨床用間充質幹細胞的製備方法，具體包括如下步驟：
[0033] 步驟一、臍帶篩選與保存：篩選、採集健康足月產婦志願者臍帶，置於臍帶保存液 中4°C冷藏，並於24小時內進行分離處理；所述臍帶保存液為無血清培養基，不含抗生素； 所述篩選的檢測項目包括攜帶病毒、遺傳家族史等；所述病毒如B肝、C肝、愛滋、梅毒等；
[0034] 同時採集一管母血留作復檢，復檢項目為B肝、C肝、愛滋、梅毒等病毒免疫學檢 測及基因檢測。
[0035] 步驟二、臍帶分離：將臍帶轉移到培養皿中，生理鹽水清洗；去除兩端結紮部位， 剝除臍靜脈和兩條臍動脈；展平，撕下華通氏膠，去除羊膜；將撕下的華通氏膠置於離心管 中剪碎至1?4mm 3小塊；臍帶分離過程中的清洗液上清進行無菌檢測，用血培養儀進行細 菌和真菌檢測，用PCR法進行支原體檢測。
[0036] 步驟三、間充質細胞原代培養：將剪碎的華通氏膠轉至裝有完全培養基的透氣蓋 培養瓶中，在37°C、5% CO2、飽和溼度環境中培養；細胞密度達約lg/T75瓶，第5天首次換 液，此後每3天換液一次，至第14天左右；細胞融合度達80 %以上時，用胰蛋白酶消化傳 代，用原培養上清終止；所述胰蛋白酶的濃度為0. 05%，由0. 25%成品胰酶稀釋5倍；用於 細胞消化過程，低濃度消化保持細胞活性和幹細胞乾性；所述完全培養基由基礎培養基和 血清替代物以及穀氨醯胺配比而成，血清替代物比例10% ;穀氨醯胺比例〇.〇2mmol/ml。
[0037] 步驟四、傳代培養：傳代細胞接種密度約為6000個/cm2 ;3天後，細胞密度達80% 以上，再次傳代；傳至第三代，細胞數約為3?5X 109,收集細胞並計數和活率，按2X IO7/ ml/管進行冷凍保存；將細胞上清進行無菌檢測、支原體檢測；所述無菌檢測包括用血培養 儀進行細菌和真菌檢測；所述支原體檢測包括用PCR法進行支原體檢測。
[0038] 步驟五、間充質幹細胞表面標誌、分化檢測：取IX IO7的細胞進行幹細胞表面標誌 檢測，按照ISCT間充質幹細胞標準檢測⑶90、⑶105、⑶73三個陽性指標以及⑶79-aXD14、 CD34、CD45、HLA-DR五個陰性指標；對第三代細胞進行分化實驗檢測幹細胞分化能力，分別 向成脂、成骨、成軟骨三個方向分化，進行油紅〇染色、茜素紅染色和阿爾新藍染色鑑定；間 充質幹細胞表面標誌、分化檢測後，冷凍保存。
[0039]
【權利要求】
1. 一種臨床用間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括如下步驟： 步驟一、臍帶篩選與保存：篩選、採集健康足月產婦志願者臍帶，置於臍帶保存液中 4°C冷藏，並於24小時內進行分離處理； 步驟二、臍帶分離：將臍帶轉移到培養皿中，生理鹽水清洗；去除兩端結紮部位，剝除 臍靜脈和兩條臍動脈；展平，撕下華通氏膠，去除羊膜；將撕下的華通氏膠置於離心管中剪 碎至1?4mm3小塊； 步驟三、間充質細胞原代培養：將剪碎的華通氏膠轉至裝有完全培養基的透氣蓋培養 瓶中，在37°C、5% CO2、飽和溼度環境中培養；細胞密度達約lg/T75瓶，第5天首次換液，此 後每3天換液一次，至第14天左右；細胞融合度達80%以上時，用胰蛋白酶消化傳代，用原 培養上清終止； 步驟四、傳代培養：傳代時，傳代細胞接種密度約為6000個/cm2 ;3天後，細胞密度 達80%以上，再次傳代；傳至第三代，細胞數約為3?5X 109,收集細胞並計數和活率，按 2 X IOVml/管進行冷凍保存；將細胞上清進行無菌檢測、支原體檢測，取I X IO7細胞做細胞 表面標誌檢測； 步驟五、間充質幹細胞表面標誌、分化檢測：按照ISCT間充質幹細胞標準檢測陽性指 標以及陰性指標；對第三代細胞進行分化實驗檢測幹細胞分化能力，分別向成脂、成骨、成 軟骨三個方向分化，進行油紅〇染色、茜素紅染色和阿爾新藍染色鑑定；間充質幹細胞表面 標誌、分化檢測後，冷凍保存； 步驟六、臨床用間幹細胞使用：取冷凍細胞，復甦後用生理鹽水洗滌兩遍，統計細胞數 和細胞活率，根據計數結果按臨床需要將細胞和複方電解質溶液混勻待用；並留樣進行內 毒素和細菌檢測。
2. 根據權利要求1所述的臨床用間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，步驟一中，所 述臍帶保存液為無血清培養基，不含抗生素。
3. 根據權利要求1所述的臨床用間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，步驟一中，所 述篩選的檢測項目包括攜帶病毒或遺傳家族史。
4. 根據權利要求1所述的臨床用間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，步驟三中，所 述胰蛋白酶的濃度為〇. 05%，由0. 25%成品胰酶稀釋5倍。
5. 根據權利要求1所述的臨床用間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，步驟三中， 所述完全培養基由基礎培養基和血清替代物以及穀氨醯胺配比而成，血清替代物比例為 10% ;穀氨醯胺比例0. 02mmol/ml。
6. 根據權利要求1所述的臨床用間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，步驟四中，所 述無菌檢測包括用血培養儀進行細菌和真菌檢測；所述支原體檢測包括用PCR法進行支原 體檢測。
7. 根據權利要求1所述的臨床用間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，步驟四中，所 述冷凍保存所用細胞冷凍保護液由完全培養基和二甲基亞碸配製而成，其中二甲基亞碸終 濃度10%。
【文檔編號】C12N5/0775GK104212764SQ201410487187
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月22日 優先權日:2014年9月22日
【發明者】董成友, 朱兵銳, 江曄, 謝天 申請人:上海華顏幹細胞科技有限公司