抗菌肽在製藥中的應用的製作方法
2023-07-12 13:16:21
抗菌肽在製藥中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種抗菌肽在製藥中的新用途，具體涉及抗菌肽在製備抗蜜蜂病毒病的藥物中的應用，所述抗菌肽的胺基酸序列為Arg-Arg-Trp-Trp-Cys-Arg；在囊狀幼蟲病病毒感染髮病的蜂群中，該抗菌肽表現出了良好的治療效果和保健作用；所述多肽不需要任何修飾、結構簡單、活性高，可用於病毒病預防與治療。
【專利說明】抗菌肽在製藥中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，涉及一種抗菌肽在製藥中的新用途，具體涉及抗菌肽在製備抗蜜蜂病毒病藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]蜜蜂囊狀幼蟲病(sacbrood disease)簡稱囊幼病，又叫尖頭病、囊雛病，是由囊狀幼蟲病病毒(sacbrood bee virus, SBV)感染引起的蜜蜂幼蟲腸道傳染病,造成幼蟲的大量死亡，影響蜂群繁殖。中華蜜蜂，又稱中華蜂、中蜂、土蜂，是東方蜜蜂的一個亞種，是中國獨有的蜜蜂當家品種，2003年，北京市在房山區建立中華蜜蜂自然保護區，2006年，中華蜜蜂被列入農業部國家級畜禽遺傳資源保護品種。囊狀幼蟲病也是中蜂的主要病害之一，在養蜂生產上時有發生。發病輕時，出現近百隻幼蟲死亡，工蜂採集活動正常；發病嚴重時，蜂群只見幼蟲增多卻不見成蜂增加，造成大批幼蟲死亡，工蜂表現不安，採集力明顯下降，威脅幼蟲發育和蜂群群勢，甚至導致蜂群飛逃，給蜂農造成嚴重的損失。[0003]中蜂囊狀幼蟲病最早於1972年發生於廣東省，隨後迅速蔓延到全國。在1972年至1976年的疾病流行期間，中國境內飼養中蜂損失超過百萬群。後來疾病的損耗降低，但蜂群的發病率仍在50%-70%。該病主要採取綜合防治措施防控，如:換王斷子、嚴格消毒、加強管理，使用抗病毒藥物配以抗生素預防繼發感染。目前用於治療中蜂囊狀幼蟲病的藥物主要有抗病毒類的西藥如病毒靈、病毒唑和金剛烷胺等，然而使用西藥有可能引起病毒的加快變異，而且有汙染商品蜂蜜的風險，因此已被國家農業部禁止在蜜蜂病害防治中使用。另外，也有使用一些中藥配方來治療中蜂囊狀幼蟲病，雖然具有一定的治療效果，但是中藥的治療的效果仍未穩定，治療效果不高。目前，該病由於缺乏安全高效的抗病毒藥物，生產中存在濫用藥物現象，這使我國當前蜂產品藥物殘留較高，蜂產品出口受限。因而，研發高效、安全、無殘留的蜂藥是當今養蜂業的迫切需求。
[0004]抗菌肽是一種小分子的多肽類物質，具有廣泛的生物學活性，具有廣譜殺菌、抗病毒、消炎、抑制腫瘤細胞生長及調節機體免疫反應等作用，對原核生物有作用，對真核生物無害。抗菌肽是生物防禦系統中產生的一類對抗外源性病原體的肽類物質，是生物先天的、非特異性防禦系統的重要組成部分。抗菌肽可與革蘭陰性菌外膜的脂多糖或革蘭陽性菌表面的肽聚糖結合，使其被破壞而形成穿膜通道，胞內離子大量流出，細胞因高滲破裂而死亡，不易產生耐藥性。另外，它還具有免疫調節、促進損傷修復、中和內毒素及對抗膿毒性休克的作用。因此，抗菌肽具有極廣泛的應用價值。
[0005]抗菌肽最初是在昆蟲中發現。昆蟲抗菌物質一直是昆蟲免疫研究的熱點。昆蟲由於體內沒有形成獲得性免疫必須的淋巴細胞抗體和胸腺，天然免疫就成了相對重要的防線，抗菌肽就是一種先天免疫。蜜蜂抗菌肽是蜜蜂在受到病原物感染後，其脂肪體迅速合成的一些具有抗菌活性的肽類，然後釋放到血淋巴中發揮抑制細菌、真菌、病毒的作用。蜜蜂抗菌肽屬於先天免疫，在體液內有4個基因家族，不同抗菌肽基因家族存在協同作用，不同抗菌肽作用機理雖有不同，卻各司其職，共同抵禦著各種病原物的侵染。因此，抗菌肽在蜜蜂飼養病害防控中具有巨大的應用潛力。從技術經濟效益角度考慮，低於50個胺基酸的多肽適合採用化學合成法生產。尋找更小分子、更高活性、更多活性抗菌肽對於降低生產成本至關重要。抗菌肽RRWWCR是在已知天然抗菌肽序列牛乳鐵蛋白(Lactoferricin) B4-9RRWQWR的基礎上人工改造的多妝(參見《The antimicrobialactivity of hexapeptides derived from synthetic combinatorial libraries)), J ApplBacteriol, 1995年第78卷第I期，第39頁至46頁)，該抗菌肽除了具有廣譜抗菌作用之外，還有抗炎症、免疫調節作用，但該抗菌肽是否具有抗蜜蜂病 毒病的作用還未進行研究。
【發明內容】
[0006]有鑑於此，本發明目的之一在於提供一種六肽抗菌肽，人工合成方法簡單，成本低廉；本發明的目的之二在於提供一種利用該六肽抗菌肽製備的藥物，該藥物利於肽的保存，且使用方便；本發明的目的之三在於提供所述六肽抗菌肽在製備抗蜜蜂病毒病藥物中的應用，利用所述六肽抗菌肽製備的藥物治療效果顯著。
[0007]為實現上述目的，本發明的技術方案為:
[0008]一種抗菌肽，所述抗菌肽為SEQ ID No:1中的胺基酸序列所示。
[0009]本發明中，利用所述的抗菌肽製備的藥物，所述藥物為抗菌肽的可溶性粉劑。
[0010]優選的，所述藥物還包括溶解所述可溶性粉劑的糖漿液，所述糖漿液與所述可溶性粉劑分開包裝，所述糖漿液為白砂糖的水溶液，白砂糖與水的質量比為1-1.5:1。
[0011]優選的，所述的藥物，所述糖漿液中白砂糖與水的質量比為1.2:1。
[0012]優選的，所述的藥物，所述糖漿液中還含有防腐劑。
[0013]所述的藥物的使用方法，將所述的抗菌肽可溶性粉劑溶於所述的糖漿液中，製備成含有抗菌肽的糖漿液即可。
[0014]本發明所述的抗菌肽在製備抗蜜蜂病毒病的藥物中的應用，所製備的藥物劑型可以為任意的，優選的，所述藥物為抗菌肽的可溶性粉劑。粉劑利於多肽保存。
[0015]進一步，所述藥物還包括溶解所述可溶性粉劑的糖漿液，所述糖漿液與所述可溶性粉劑分開包裝，所述糖漿液為白砂糖的水溶液，白砂糖與水的質量比為1-1.5:1。在使用時，將可溶性粉劑溶於糖漿液即可，抗菌肽的用量優選為l_5mg抗菌肽/1000ml糖漿液進行配置。
[0016]進一步，所述糖漿液中白砂糖與水的質量比為1.2:1。
[0017]進一步，所述糖漿液中還含有防腐劑。
[0018]本發明所述的抗菌肽在製備抗蜜蜂病毒病的藥物中的應用。
[0019]特別地，所述的抗菌肽在製備抗蜜蜂囊狀幼蟲病病毒的藥物中的應用。
[0020]特別地，所述抗菌肽在製備抗中蜂囊狀幼蟲病的藥物中的應用。中華蜜蜂是中國獨有的蜜蜂當家品種，囊狀幼蟲病是中蜂的主要病害之一，在養蜂生產上常有發生，因此，製備治療中蜂囊狀幼蟲病的藥物對飼養中蜂具有重要的作用。
[0021]本發明的有益效果:1)本發明採用人工方法合成了一種六肽抗菌肽，其人工合成方法簡單，成本低；2)本發明提供了所述的抗菌肽的用途，具體涉及抗菌肽在製備抗蜜蜂囊狀幼蟲病病毒的藥物中的應用，利用本發明所述的抗菌肽製備治療中蜂囊狀幼蟲病的藥物，該抗菌肽表現出了良好的治療效果和保健作用；3)所述抗菌肽不需要任何修飾、結構簡單、活性高、人工合成方法簡單、成本低廉；因此可望應用於蜜蜂病害的預防與治療。
【具體實施方式】
[0022]下面結合實施例對本發明作進一步說明。所舉實施例是為了更好地對本發明的內容進行說明，但並不是本發明的內容僅限於所舉實施例。所以熟悉本領域的技術人員根據上述
【發明內容】
對實施方案進行非本質的改進和調整，仍屬於本發明的保護範圍。
[0023]本發明所舉實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件進行，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。本發明所舉實施例中所用試劑及藥品均通過商業途徑獲得。
[0024]實施例1抗菌肽
[0025]本發明的抗菌肽為SEQ ID No:1中的胺基酸序列，SEQ ID No:1的序列為:Arg-Arg-Trp-Trp-Cys-Arg0
[0026](a)序列特徵:
[0027]?長度:6
[0028]?類型:胺基酸序列
[0029]籲鏈型:單鏈
[0030]?拓撲結構:線性
[0031](b)分子類型:多肽
[0032](C)假設:否
[0033](d)反義:否
[0034](e)最初來源:人工合成
[0035]本實施例抗菌肽按照固相法合成，最終得到的抗菌肽經高效液相色譜(HPLC )分析，其純度為98%。固相法合成的方法可以參見Schnlzer M, Alewood P, Jones A,Alewood D，Kent SBH.1n situneutralization in Boc-chemistry solid phase peptidesynthesis.1nt J Pept Res Ther.2007 ；13:31_44。
[0036]實施例2
[0037]取白砂糖1200g，溶於1100ml去離子水中，攪拌，加熱煮沸5_10min，保持液體體積為1000ml，製成糖漿液，待冷卻後，向所述的糖漿液中加入Img實施例1所製備的抗菌肽，待完全溶解後得到含抗菌肽的糖漿液，其中抗菌肽濃度為lmg/1000ml糖漿液。
[0038]實施例3
[0039]取白砂糖1200g，溶於IlOOml去離子水中，攪拌，加熱煮沸5_10min，保持液體體積為1000ml，製成糖漿液，待冷卻後，向所述的糖漿液中加入5mg實施例1所製備的抗菌肽，待完全溶解後得到含抗菌肽的糖漿液，其中抗菌肽濃度為5mg/1000ml糖漿液。
[0040]實施例4
[0041]取白砂糖1200g，溶於1100ml去離子水中，攪拌，加熱煮沸5_10min，保持液體體積為1000ml，製成糖漿液，待冷卻後，向所述的糖漿液中加入25mg實施例1所製備的抗菌肽，待完全溶解後得到含抗菌肽的糖漿液，其中抗菌肽濃度為25mg/1000ml糖漿液。
[0042]實施例5抗菌肽的應用[0043]I病毒鑑定
[0044]1.1樣本採集
[0045]採集中蜂場有典型囊狀有蟲病臨床症狀特徵的病死幼蟲，樣本於_20°C保存，採用RT-PCR方法和序列測定與分析方法鑑定病原。
[0046]1.2RNA 提取
[0047]RNA提取採用Trizol法，取樣本於研缽中，加入液氮充分研磨後取0.1g於離心管中，加入800iiL Trizol混勻，室溫靜置15min後，加入250 y L氯仿充分振蕩，4°C下靜置IOmin後12000r/min離心15min。取上清加入等體積異丙醇,混勻,4°C下12000r/min離心IOmin0沉澱以70%乙醇洗一次，吸乾上清，沉澱溶解於100 y L經焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的去離子水，以備反轉錄。
[0048]1.3RT-PCR
[0049]根據中蜂囊狀幼蟲病病毒(CSBV)廣東株基因組序列(GenBank登錄號:AF469603)設計CSB1F/CSB2R、CSB3F/CSB4R和CSB14F/CSB15R三對引物(見表1)。反轉錄反應體系:25ii L 體系中含有 5Xbuffer5ii L，2.5mM dNTPs2 y L，10 y M 特異性下遊引物 I y L，RNA 溶液 15.5 u L, 40U/u L AMV 逆轉錄酶(AMV Reverse Transcriptase )0.5 U L, IOU/U L RNase抑制劑(RNase Inhibitor) I u L。混合均勻，42°C水浴孵育Ih合成cDNA，98°C滅活3min，置-20°C保存。PCR 反應體系:10 XPCR Buffer(含 15mM Mg2+)2.5 u L, 2.5mM dNTPs0.5 u L,5U/ u L rTaq 酶(rTaq) 0.10 U L, 10 U M 上、下遊引物各 0.5 U L, cDNA0.5 U L，用去離子水補足25 ii L。PCR循環參數見表2，共進行30個循環。取PCR產物5 y L用1%瓊脂糖凝膠電泳。
[0050]表1CSBV RT-PCR 引物
【權利要求】
1.一種抗菌肽，其特徵在於，所述抗菌肽為SEQ ID No:1中的胺基酸序列所示。
2.利用權利要求1所述的抗菌肽製備的藥物，其特徵在於，所述藥物為抗菌肽的可溶性粉劑。
3.根據權利要求2所述的藥物，其特徵在於，所述藥物還包括溶解所述可溶性粉劑的糖漿液，所述糖漿液與所述可溶性粉劑分開包裝，所述糖漿液為白砂糖的水溶液，白砂糖與水的質量比為1-1.5:1。
4.根據權利要求3所述的藥物，其特徵在於，所述糖漿液中白砂糖與水的質量比為1.2:1。
5.根據權利要求3或4所述的藥物，其特徵在於，所述糖漿液中還含有防腐劑。
6.權利要求3或4所述的藥物的使用方法，其特徵在於，將所述的抗菌肽可溶性粉劑溶於所述的糖漿液中，製備成含有抗菌肽的糖漿液即可。
7.權利要求1所述的抗菌肽在製備抗蜜蜂病毒病的藥物中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於，所述的抗菌肽在製備抗蜜蜂囊狀幼蟲病病毒的藥物中的應用。
9.根據權利要求7或8所述的應用，其特徵在於，所述抗菌肽在製備抗中蜂囊狀幼蟲病的藥物中的 應用。
【文檔編號】C07K7/06GK103524602SQ201310528734
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】楊柳, 沈克飛, 曹蘭, 鄭華, 張邑帆, 付利芝 申請人:重慶市畜牧科學院