黃酮木酯素在製備對子宮、卵巢和乳腺具有抗增殖活性的藥物中的應用的製作方法

2023-07-12 02:22:31 1

專利名稱：黃酮木酯素在製備對子宮、卵巢和乳腺具有抗增殖活性的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及黃酮木酯素(flavanolignane)單獨或與已知的化療藥組合在製備用於治療和預防子宮、卵巢和乳腺腫瘤的藥物中的應用。
近來，已發現某些類黃酮具有抗腫瘤活性(Verna，癌症研究(CancerResearch)48，5754，1988)和對某些腫瘤具有化學預防活性(Cassady，天然產物雜誌(J.Nat.Prod.)53，23，1990)。特別是槲皮黃酮-一種在植物中幾乎普遍存在的類黃酮，已證明它除與常用的化療藥具有協同活性外，還對人白血病細胞的增殖具有一定的抑制活性(Larocca，英國血液學雜誌(Br.J.of Haematology)75，489，1990)且對其它細胞系具有一定的抑制活性(Scambia，英國癌症雜誌(Br.J.Cancer)62，942，1990-國際癌症雜誌(Int.J.Cancer)46，1112，1990-癌症化療藥理學(Cancer Chemother.Pharmacol.)28，255，1991-婦科腫瘤學(Gynecologic Oncology)45，13，1992)。儘管還不知道這種增殖抑制作用的機理，但它似乎與這種類黃酮和II型雌激素受體的相互作用有關(Markaverich，類固醇生物化學雜誌(J.Steroid Biochem.)30，71，1988)。最初由Clark(生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)253，7630，1978)描述的大鼠子宮中的這些受體與真正的雌激素受體(ER)不同，因為它們的存在濃度較高且對雌二醇的離解親和常數(KD10-20nM)低於雌激素受體的離解親和常數(KD0.2-1nM)。
現已令人驚奇地發現黃酮木酯素對II型雌激素受體具有高親和力且對子宮、卵巢和乳腺中對順鉑和阿黴素具有抗藥性的腫瘤細胞系具有非常顯著的抗增殖活性，其中的西利馬林已廣泛用於治療各種病源引起的肝病(hepatopathias)，它的三種主要組分已知為水飛薊素、水飛薊寧、水飛薊丁和脫氫水飛薊素且具有以下報導的結構
水飛薊寧 水飛薊寧
水飛薊丁為證明黃酮木酯素的抗增殖作用，已經在該化合物的存在下測定了來自各種人體腫瘤的不同穩定細胞系的生長曲線，並評價了它們與卵巢癌樣品中的II型EBS相互作用的能力。]已經在卵巢腫瘤或其它器官腫瘤上進行了對雌激素受體結合的測定，這些腫瘤採用加有小牛血清和200單位/ml青黴素的Dulbecco改性培養基作為培養基以單層進行培養。用於試驗的細胞每周進行胰蛋白酶酶化(trypsinated)並以8×10-4/ml的密度置於平板上，在含5％CO2的潮溼空氣氣氛中於37℃溫育。為控制這些產品的抗增殖活性，將這些細胞以4×104/ml的濃度放入孔(Falcon 3046，Becton Dickinson NY)中。24小時後用新鮮培養基更換原培養基並加入溶於無水乙醇中的黃酮木酯素。在不存在活性成分下僅用載體以相同的試驗條件處理對照組。在72小時的試驗時間裡，以24小時的時間間隔重複上述處理。將對照組的生長與處理樣品的生長進行比較，通過直接計數細胞來評價對細胞增殖的抑制。
對於這些受體的劑量，將24小時後的細胞用標量的標記雌二醇(3H-E240Ci/mmol，Amershan UK)單獨或在100倍用量的己烯雌酚存在下在4℃下溫育2.5小時。
溫育時間結束後，迅速用新鮮底物洗滌細胞，再用1M NaOH溫育30分鐘。用閃爍儀測量放射性並由含或不含己烯雌酚的製劑之間的不同來計算結合特異性。根據文獻(Raneletti，1988)的常規方法，結果表達為每個細胞的結合位點數。
將對照組的生長與處理組的生長進行比較，通過直接計數細胞來評價對細胞增殖的抑制。
對不同細胞系的結果示於

圖1和表I及表V中。具體來說，圖1示出了水飛薊素對A2780 WT的抗增殖活性，A2780 WT是一種對ER呈陰性，對II型呈陽性的卵巢癌細胞系。
兩組試驗備重複三次，結果取其平均值。標準偏差低於10％。
該抗增殖活性是劑量依賴性的。表I所示的是濃度為0.01μM-20μM的水飛薊素在細胞增殖中的有關數據；水飛薊素對不同的細胞系表現出劑量依賴性抗增殖作用，包括那些對化療藥具有抗藥性的細胞系(MCF-7ADRr，A2780 CIS)，其IC50為4.8-24μM。
表 I水飛薊素對不同的穩定細胞系的抗增殖作用細胞系測試數*細胞種類暴露時間 IC50(μM)A2780 WT 8卵巢癌細胞72h 12A2780 CIS5卵巢癌細胞72h 14CIS抗性OVCA-433 3卵巢癌細胞72h 4.8MCF-7 ADRr 5乳腺癌細胞72h 24ADR抗性*各試驗一式三份為了進一步研究水飛薊素的抗增殖活性，研究其對A2780 WT細胞周期的作用。如表II所示，細胞螢光分析表明水飛薊素降低S相細胞的百分數，並使G0/G1相細胞的百分數稍微增加。
表II水飛薊素對A2780 WT在細胞周期不同相中的分布的作用處理*對照組水飛薊素(10μM)G0/G1 58.7**70.5S3120.9G2/M 10.3 8.6*A2780WT細胞用或不用10μM水飛薊素培養2天。** 結果表達為細胞周期各相中的細胞百分數。
基於這些結果，試驗水飛薊素對某些化療藥，特別是順鉑(CIS)和阿黴素(ADR)的作用的增強。如表III所示，與單獨使用相應劑量的藥物相比，當水飛薊素與CIS組合使用時，觀察到對生長的協同抑制作用。
將水飛薊素與ADR組合使用得到類似結果(表IV)。
為證明水飛薊素與阿黴素或順鉑組合的這種作用是協同作用還是加合作用，用Berenbau(高級癌症研究(Adv.Cancer Res.)，25，269，1981)的isobolic方法分析數據。在親本(A2780 WT，表III)和抗性(MCF 7，ADR r，表IV)細胞系中所得組合指數均低於1，從而證明兩種藥物的組合具有協同抗增殖活性。表IIICIS-水飛薊素組合對A2780WT細胞系的協同抗增殖作用CIS水飛薊素 ％CIS水飛薊素 組合指數(μg/ml) (μM) 對照 (μg/ml) (μM)0.1 0.1 670.232.90.460.250.1 580.316.40.810.5 0.1 370.54＞50 ＜0.921 0.1 18＞1 ＞50 ＜1.000.1 1540.348.20.410.251350.56＞50＜0.460.5 1250.82＞50＜0.621 112＞1 ＞50＜1.02表IV ADR與水飛薊素組合對MCF-7 ADRr細胞系的協同抗增殖作用ADR水飛薊素 ％ADR 水飛薊素組合指數(μg/ml) (μM) 對照 (μM/ml) (μM)0.1 0.180 0.6 0.1 1.160.5 0.176 0.9 0.36 0.771 0.169 2.5 2.2 0.442.5 0.162 5.4 70.515 0.147 ＞10 35 ＜0.5010 0.139 ＞10 ＞50 ＜1.00不僅對穩定化的細胞系，而且對人腫瘤細胞原始培養物觀察水飛薊素及其類似物的抗增殖活性。各種被測試的黃酮木酯素具有類似的性能。在表V中，列出了水飛薊素、水飛薊寧、西利馬林和脫氫水飛薊素的有關數據。在這些試驗中水飛薊素和異水飛薊素的非對映異構體形式也同樣具有活性。表V不同黃酮木酯素對A2780WT細胞生長的作用化合物 試驗數暴露時間IC50(μM)水飛薊素 8 72h 12脫氫水飛薊素 3 72h 2.88水飛薊寧 3 72h 12西利馬林 3 72h 15
此外，通過按照文獻的常用條件測量植入裸露的無胸腺小鼠中的腫瘤大小，證明上述黃酮木酯素可體內抑制細胞增殖。以1-100mg/Kg的劑量處理這些動物，發現被測試的腫瘤以高個體百分數明顯消退，直到消失。已證明該產品對人卵巢、乳腺和子宮腫瘤的活性高於已知藥物如它莫西芬。
水飛薊寧、脫氫水飛薊素和水飛薊素的兩種非對映異構體形式顯示出特別顯著的活性。在體外試驗中，黃酮木酯素直接使用，而在體內試驗中，使用其與磷脂的配合物，如EP-A-0209038中所述。
根據本發明，黃酮木酯素可經口或通過輸注給藥對於經口給藥，作為載體特別有用的是天然或合成磷脂，因為它們與所述化合物形成上述的脂溶性穩定配合物；以及含有中鏈脂肪酸甘油三酯的液體半合成甘油酯或能增進單一化合物、其天然混合物或含有它們的提取物的生物利用率的類似物。
對人來說，黃酮木酯素劑量為50-1500mg/天，主要通過口服給藥。
本發明還涉及用於抗腫瘤治療的組合物，含有組合形式的西利馬林黃酮木酯素和抗腫瘤藥，它們同時、依次或單獨使用。
下列實施例進一步說明本發明。
實施例1含有水飛薊素與大豆卵磷脂的配合物的硬明膠膠囊組成水飛薊素-大豆卵磷脂配合物300mg羧甲基纖維素鈉 16mg滑石 6mg硬脂酸鎂 3mg實施例2含有脫氫水飛薊素的軟明膠膠囊組成脫氫水飛薊素250mg液體半合成甘油酯300mg部分氫化的植物油49mg大豆卵磷脂1mg實施例3含有西利馬林與天然大豆磷脂的配合物的硬明膠膠囊組成西利馬林-大豆磷脂配合物360mg羧甲基纖維素鈉 21mg滑石 6mg硬脂酸鎂 3mg實施例4含有水飛薊寧與大豆卵磷脂的配合物的硬明膠膠囊組成水飛薊寧-大豆卵磷脂配合物200mg羧甲基纖維素鈉 10mg滑石 3mg硬脂酸鎂 2mg
權利要求
1.黃酮木酯素在製備對II型雌激素受體具有拮抗活性和抗增殖活性的藥物中的用途，該黃酮木酯素選自西利馬林、水飛薊素、水飛薊寧、水飛薊丁、脫氫水飛薊素、其混合物或含有它們的提取物。
2.黃酮木酯素與磷脂的配合物在製備對II型雌激素受體具有拮抗活性和抗增殖活性的藥物中的用途，該黃酮木酯素選自西利馬林、水飛薊素、水飛薊寧、水飛薊丁、脫氫水飛薊素、其混合物或含有它們的提取物。
3.對II型雌激素受體具有拮抗活性和抗增殖活性的藥物組合物，含有選自西利馬林、水飛薊素、水飛薊寧、水飛薊丁、脫氫水飛薊素、其混合物或含有它們的提取物的黃酮木酯素作為活性成分，任意性地以與磷脂的配合物形式和任意性地與抗腫瘤藥組合，同時、依次或單獨使用。
4.根據權利要求3的組合物，適於口服給藥。
5.根據權利要求4的組合物，含有液體半合成中鏈脂肪酸甘油酯作為載體。
全文摘要
本發明涉及黃酮木酯素如西利馬林、水飛薊素、水飛薊寧、水飛薊丁、其混合物、提取物和含有它們的製劑在治療(和預防)子宮、卵巢和乳腺腫瘤中的應用。這些黃酮木酯素已被用於治療各種病源引起的肝病,而且它們令人驚奇地對Ⅱ型雌激素受體具有顯著的親和力,對子宮、卵巢和乳腺的腫瘤細胞系具有抗增殖活性。
文檔編號A61K36/00GK1185112SQ95197861
公開日1998年6月17日 申請日期1995年10月10日 優先權日1995年5月23日
發明者E·波姆巴德利, P·莫拉佐尼 申請人:因迪納有限公司