透明質酸和聚天門冬氨酸原位交聯型凝膠及其製備方法

2023-07-12 10:58:11

專利名稱：透明質酸和聚天門冬氨酸原位交聯型凝膠及其製備方法
技術領域：
本發明屬於水凝膠系列，涉及以透明質酸和聚天門冬氨酸製備的原位交聯型凝 膠。
背景技術：
水凝膠是親水性的交聯高分子網絡與被其包裹的水構成的一種特殊的分散體系。 這種材料具有三維網絡結構，能保持一定的形狀，且含有大量的水份，柔軟而類似生物體組 織，不容易造成組織損傷，目前被廣泛地應用在生物醫學領域中。近年來，原位交聯型凝膠材料引起了人們的特別關注。這種可流動的水凝膠原液 注射到目標位置後，很容易充滿整個具有不規則形狀的缺損部位，並能在目標位置迅速凝 膠化形成不可流動、維持一定形態的水凝膠。而且通過注射的方法可避免手術創傷性，整個 操作簡易方便。天然高分子如透明質酸、殼聚糖、明膠、聚胺基酸、甲基纖維素、海藻酸鈉等都可用 於製備原位交聯型凝膠。透明質酸是一種天然的聚合物，具有一些獨特的性能，這些性能使 得它成為生化和醫藥的良好材料。透明質酸廣泛分布於體內，作為細胞外基質的組成部分 負責組織間的連接，而且HA在軟骨組織的穩定、細胞增殖、形態發生的控制、惡性腫瘤的轉 移、發炎過程和傷口的癒合等方面起著重要作用。透明質酸分子用於人體器官時不會被免 疫系統當做外來物質，而且不會引發炎症反應或者毒性反應。除此之外，它的生物相容性， 物理化學性能也使得HA能夠很好的用於藥物釋放、組織工程以及骨關節炎治療的防粘連 等。聚天冬氨酸(PASP)屬於聚胺基酸中的一類。聚天冬氨酸因其結構主鏈上的肽鍵易受 微生物、真菌等作用而斷裂，最終降解產物是對環境無害的氨、二氧化碳和水。因此，聚天冬 氨酸是生物降解性好的、環境友好型化學品。聚天冬氨酸用途廣泛。在水處理、醫藥、農業、 日化等領域都能找到它的用途。2007 年，G. Pitarresi (Preparation and characterization of new hydrogels basedon hyaluronic acid and α， β -polyaspartylhydrazide, European Polymer Journal, 43 (2007))製備了一種透明質酸-聚天冬醯胼水凝膠，它以透明質酸和聚天冬醯 胼為原料，以1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳醯亞胺為交聯劑，在pH = 4. 0的水相中實現 透明質酸與聚天冬醯胼之間的交聯，生成水凝膠。其缺點在於反應需使用到交聯劑，降低了 凝膠體系的生物相容性；且凝膠化反應時間較長，不能實現原位交聯，限制了凝膠的應用。已報導的原位交聯型水凝膠往往依靠天然大分子的物理性能或其離子鍵、靜電 作用力或疏水作用力實現溶液-膠體之間的轉化。如Molly S. Shoichet (Fast-gelling injectabIeblend of hyaluronan and methylcellulose for intrathecal, localized delivery to theinjured spinal cord, Biomaterials, 27 (2006))報導了一種可實現快速 凝膠化的透明質酸-甲基纖維素水凝膠，它利用甲基纖維素具有溫敏性實現凝膠化。其缺 點在於這種溶液-膠體之間的轉化是可逆的，會導致水凝膠性能不穩定，極大程度上限制 其在生物領域的應用。
鑑於此，我們利用改性後具有雙醛結構的透明質酸和具有雙胺基團的聚天門冬氨 酸之間的縮合反應製備出性能穩定的原位交聯型水凝膠。

發明內容
本發明要解決的技術問題是製備一種工藝簡單、無需使用交聯劑、凝膠化時間短 且可控制、性能穩定且生物相容性好的原位交聯型水凝膠及其製備方法。本發明產品透明質酸和聚天門冬氨酸原位交聯型凝膠由具有雙醛結構的透明質 酸和具有雙胺基團的聚天門冬氨酸之間的縮合反應製得，可由下述方法得到透明質酸衍 生物和聚天門冬氨酸衍生物分別按照質量百分比1 10%溶解在緩衝液中，再將透明質酸 衍生物與聚天門冬氨酸衍生物溶液按4 (1 16)的比例混合反應，所述緩衝液的PH值 範圍為5. 0 8. 0，離子濃度為0. 01 0. 5mol/L，反應溫度為10 50°C，凝膠化時間為10 秒 30分鐘。本發明透明質酸和聚天門冬氨酸原位交聯型凝膠的製備方法如下透明質酸衍生物和聚天門冬氨酸衍生物分別按照質量百分比1 10%溶解在緩 衝液中，再將透明質酸衍生物和聚天門冬氨酸衍生物按4 (1 16)的比例混合反應，所 述緩衝液的PH值範圍為5. 0 8. 0，離子濃度為0. 01 0. 5mol/L,反應溫度為10 50°C， 凝膠化時間為10秒 30分鐘。透明質酸衍生物的製備方法如下將透明質酸溶解在水中，在溫度為0 50°C的 條件下，加入氧化劑氧化透明質酸1 24h，再用乙二醇終止反應，再將混合物用水透析3 天，凍幹得到具有雙醛基團的透明質酸衍生物；所述的透明質酸按質量百分比0.1 5%溶解在pH值範圍為2 7的水中。過 低或過高的透明質酸溶液濃度，都會影響到氧化劑在溶液中的分散，溶液濃度過低會導致 得到的產物分子量過低，溶液濃度過高從而導致得到的產物醛含量過低；溶劑的PH值要控 制在2 7之間，過低的pH值會導致透明質酸的降解，過高的pH值會降低氧化劑的氧化效^ ο透明質酸衍生物的製備所用水優選去離子水。所述的氧化劑為高錳酸鉀、高碘酸鈉、雙氧水，氧化劑與透明質酸的質量比例為 5 (1 25)。氧化劑的用量的多少直接到影響產物的醛含量和分子量，氧化劑的用量過 少，得到的產物醛含量過低，在第三步的交聯反應中，會降低交聯速度，得到的凝膠交聯度 低且易降解；氧化劑的用量過多，得到的反應副產物增加，目標產物的分子量則會降低。所述的氧化反應溫度範圍優化為10 50°C，氧化反應時間為1 24h。透明質酸 是一種多糖結構，耐受溫度範圍較窄，若反應溫度超過50°C，透明質酸易被降解；氧化反應 時間與氧化劑的選擇有關。聚天門冬氨酸衍生物製備方法將聚琥珀醯亞胺溶解在N，N- 二甲基甲醯胺中，在 溫度為-10 80°C的條件下，用雙胺類物質中的胺基進攻聚琥珀醯亞胺中的醯亞胺鍵使其 開環，接枝改性聚琥珀醯亞胺，反應時間為1 12h，生成的產物以沉澱的方式從溶劑中析 出，再將沉澱物溶解於去離子水，經超濾凍幹得到具有雙胺基團的聚天門冬氨酸衍生物；所述的雙胺類物質為C2 8的二胺、水合胼或賴氨酸，雙胺類物質與聚琥珀醯亞 胺的質量比例優化為5 (1 25)。過高的雙胺類物質與聚琥珀醯亞胺的質量比例將導致
4聚琥珀醯亞胺的交聯，此時，雙胺類物質不僅僅是接枝物，而是起到了交聯劑的作用。接枝 反應得到的產物是具有雙胺基團的聚天門冬氨酸衍生物。透明質酸衍生物和聚天門冬氨酸衍生物分別按照質量百分比1 10%溶解在緩 衝液中。隨著質量百分比的增加，凝膠的凝膠化時間隨之縮短，生成的凝膠空間網絡結構更 加緊湊，抗降解性能也隨之提高；但當質量百分比過高時，溶液粘稠度顯著增大，從而導致 兩種大分子上的官能團不能完全交聯，生成的凝膠交聯度降低，空間網絡結構變疏鬆，抗降 解性能下降。所述緩衝液為檸檬酸_氫氧化鈉_鹽酸緩衝液、檸檬酸_檸檬酸鈉緩衝液、磷酸氫 二鈉_磷酸二氫鈉緩衝液、磷酸氫二鈉_磷酸二氫鉀緩衝液、磷酸二氫鉀_氫氧化鈉緩衝 液、巴比妥鈉_鹽酸緩衝液、Tris-鹽酸緩衝液、硼酸-硼砂緩衝液、碳酸鈉_碳酸氫鈉緩衝 液、模擬人工體液、人工淚液。不同的緩衝液可以提供不同的PH值緩衝範圍。所述緩衝液的pH值範圍控制為5. 0 8. 0，緩衝液中無機鹽的種類為氯化鈉、氯化 鉀、氯化鎂、氯化鈣、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳 酸氫鈉、碳酸氫鉀，其離子濃度控制為0. 01 0. 5mol/L。緩衝液的pH值以及離子濃度是凝 膠化時間長短的決定性因素，也影響了凝膠的理化性能。所述的透明質酸衍生物及聚天門冬氨酸衍生物緩衝溶液按4 (1 16)的比例 混合反應，任何一種高聚物衍生物過量都會延長凝膠化時間，造成凝膠網絡結構的不完整， 降低凝膠的抗降解性能。所述的反應溫度優化為10 50°C，過高過低的反應溫度都會對凝膠性能造成影 響。水是此反應的唯一副產物，被包裹在水凝膠中。本發明的透明質酸和聚天門冬氨酸原位交聯型凝膠製備過程反應方程式如下 本發明製備工藝簡單，反應過程溫和。首先通過用氧化劑氧化透明質酸得到具有
雙醛基團的透明質酸衍生物，再利用雙胺類物質中的胺基進攻聚琥珀醯亞胺中的醯亞胺 鍵，使其開環生成具有雙胺基團的聚天門冬氨酸衍生物，最後，將兩種高聚物衍生物分別溶 解在同一種緩衝液中，將兩者混合使其凝膠化。氧化反應過程中，可通過透明質酸的濃度、 溶劑的PH值、氧化劑的選擇及用量、反應溫度及反應時間來控制產物的醛含量和分子量； 接枝反應過程中，可通過二胺類物質的選擇及用量、反應溫度及時間來控制產物的接枝率; 凝膠化反應過程中，可通過緩衝液種類及其PH值、溶劑中離子的種類和強度調節控制凝膠 化時間和凝膠的性能。透明質酸衍生物上的醛基與聚天門冬氨酸衍生物上的胺基之間發生縮合反應，實 現溶液_膠體之間的轉變，交聯製備出透明質酸-聚天門冬氨酸原位交聯型水凝膠。整個凝 膠化過程無需使用交聯劑、凝膠化時間短且可通過緩衝液種類及其PH值、溶劑中離子的種 類和強度的調節實現控制，水是此縮合反應的唯一副產物，被包裹在水凝膠中，製備得到的 水凝膠性能穩定、生物相容性好、生物可降解，適用於組織工程，栓塞材料或藥物緩釋領域。
具體實施例方式下面通過具體的實施方案敘述本發明中透明質酸和聚天門冬氨酸 原位交聯型凝膠及其製備方法。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術 人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的範圍，本發明的 實質和範圍僅由權利要求書所限定。對於本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和範 圍的前提下，對這些實施方案中的培養劑組分、含量、培養條件、分離提取條件進行的各種 改變或改動也屬於本發明的保護範圍。
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以下給出本發明的實施例，進一步對本發明進行詳細說明，但本發明並不限於此。實施例1稱取0. Ig透明質酸(分子量為l，200KDa)溶於50ml pH為3. 0的去離子水中，待 透明質酸溶解完畢後加入0. 5g雙氧水，在20°C攪拌反應12h，反應完畢後加入20ml乙二醇 終止反應，再將混合物透析3天去除乙二醇等小分子物質，冷凍乾燥得到具有雙醛基團的 透明質酸衍生物，產物醛基含量為33. 28%，分子量為390KDa。稱取Ig聚琥珀醯亞胺溶解於IOOml N, N-二甲基甲醯胺中，加入Ig己二胺，在 40°C水浴攪拌反應12h，期間會有沉澱產生。反應結束後過濾收集沉澱物，將沉澱物再次溶 解於IOOml去離子水中，經過超濾去除未反應的小分子，凍幹收集得具有雙胺基團的聚天 門冬氨酸衍生物。稱取0. 02g透明質酸衍生物和0. 02g聚天門冬氨酸衍生物分別溶解於Iml磷酸氫 二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液(PH = 6.4，濃度為0. 2mol/L)中，待其完全溶解後，將Iml透明質 酸衍生物溶液和0. 5mL聚天門冬氨酸衍生物溶液用漩渦震蕩混合均勻，再放置於20°C水浴 中恆溫，靜止製得水凝膠。凝膠化時間為8min 51.78s。實施例2稱取0. 2g透明質酸(分子量為l，200KDa)溶於50ml pH為5. 0的去離子水中，待 透明質酸溶解完畢後加入0. 3g雙氧水，在30°C攪拌反應8h，反應完畢後加入20ml乙二醇 終止反應，再將混合物透析3天去除乙二醇等小分子物質，冷凍乾燥得到具有雙醛基團的 透明質酸衍生物，產物醛基含量為39. 56%，分子量為460KDa。稱取Ig聚琥珀醯亞胺溶解於50ml N，N-二甲基甲醯胺中，加入Ig戊二胺，在40°C 水浴攪拌反應12h，期間會有沉澱產生。反應結束後過濾收集沉澱物，將沉澱物再次溶解於 IOOml去離子水中，經過超濾去除未反應的小分子，凍幹收集得具有雙胺基團的聚天門冬氨 酸衍生物。稱取0. 03g透明質酸衍生物和0. 03g聚天門冬氨酸衍生物分別溶解於Iml磷酸氫 二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液(PH = 6.0，濃度為0. 2mol/L)中，待其完全溶解後，將0. 5ml透明 質酸衍生物溶液和ImL聚天門冬氨酸衍生物溶液用漩渦震蕩混合均勻，再放置於30°C水浴 中恆溫，靜止製得水凝膠。凝膠化時間為5min 34.83s。實施例3稱取0. Ig透明質酸(分子量為l，200KDa)溶於50ml pH為3. 0的水溶液中，待透 明質酸溶解完畢後加入0. 2g高碘酸鈉，在40°C攪拌反應2h，反應完畢後加入20ml乙二醇 終止反應，再將混合物透析3天去除乙二醇等小分子物質，冷凍乾燥得到具有雙醛基團的 透明質酸衍生物，產物醛基含量為22. 47%，分子量為630KDa。稱取Ig聚琥珀醯亞胺溶解於IOOml N, N-二甲基甲醯胺中，加入Ig賴氨酸，在 40°C水浴攪拌反應12h，期間會有沉澱產生。反應結束後過濾收集沉澱物，將沉澱物再次溶 解於IOOml去離子水中，經過超濾去除未反應的小分子，凍幹收集得具有雙胺基團的聚天 門冬氨酸衍生物。稱取0. Olg透明質酸衍生物和0. Olg聚天門冬氨酸衍生物分別溶解於Iml檸檬 酸-氫氧化鈉-鹽酸緩衝液化11 = 6.0，濃度為0. 2mol/L)中，待其完全溶解後，將Iml透明 質酸衍生物溶液和ImL聚天門冬氨酸衍生物溶液用漩渦震蕩混合均勻，再放置於30°C水浴中恆溫，靜止製得水凝膠。凝膠化時間為12min 44.21s。實施例4稱取0. Ig透明質酸(分子量為l，200KDa)溶於50ml pH為4. 0的水溶液中，待透 明質酸溶解完畢後加入0. 5g高碘酸鈉，在10°C攪拌反應8h，反應完畢後加入20ml乙二醇 終止反應，再將混合物透析3天去除乙二醇等小分子物質，冷凍乾燥得到具有雙醛基團的 透明質酸衍生物，產物醛基含量為42. 16%，分子量為270KDa。稱取Ig聚琥珀醯亞胺溶解於IOOml N, N-二甲基甲醯胺中，加入Ig己二胺，在 40°C水浴攪拌反應12h，期間會有沉澱產生。反應結束後過濾收集沉澱物，將沉澱物再次溶 解於IOOml去離子水中，經過超濾去除未反應的小分子，凍幹收集得具有雙胺基團的聚天 門冬氨酸衍生物。稱取0. 05g透明質酸衍生物和0. 05g聚天門冬氨酸衍生物分別溶解於Iml Tris-鹽酸緩衝液(pH = 7.4，濃度為0. lmol/L)中，待其完全溶解後，將0. 3ml透明質酸衍 生物溶液和0. 9mL聚天門冬氨酸衍生物溶液用漩渦震蕩混合均勻；再放置於30°C水浴中恆 溫，靜止製得水凝膠。凝膠化時間為3min 56.11s。實施例5稱取0. Ig透明質酸(分子量為l，200KDa)溶於50ml pH為5. 0的水溶液中，待透 明質酸溶解完畢後加入0. 3g高錳酸鉀，在30°C攪拌反應4h，反應完畢後加入20ml乙二醇 終止反應，再將混合物透析3天去除乙二醇等小分子物質，冷凍乾燥得到具有雙醛基團的 透明質酸衍生物，產物醛基含量為56. 76%，分子量為680KDa。稱取Ig聚琥珀醯亞胺溶解於IOOml N, N-二甲基甲醯胺中，加入Ig水合胼，在 40°C水浴攪拌反應12h，期間會有沉澱產生。反應結束後過濾收集沉澱物，將沉澱物再次溶 解於IOOml去離子水中，經過超濾去除未反應的小分子，凍幹收集得具有雙胺基團的聚天 門冬氨酸衍生物。稱取0. 08g透明質酸衍生物和0. 08g聚天門冬氨酸衍生物分別溶解於Iml人工淚 液(pH = 7. 4，濃度為0. 05mol/L)中，待其完全溶解後，將Iml透明質酸衍生物溶液和0. 5mL 聚天門冬氨酸衍生物溶液用漩渦震蕩混合均勻，再放置於30°C水浴中恆溫，靜止製得水凝 膠。凝膠化時間為45. 13s。實施例6稱取0. Ig透明質酸(分子量為l，200KDa)溶於50ml pH為5. 0的水溶液中，待透 明質酸溶解完畢後加入0. 3g高錳酸鉀，在30°C攪拌反應4h，反應完畢後加入20ml乙二醇 終止反應，再將混合物透析3天去除乙二醇等小分子物質，冷凍乾燥得到具有雙醛基團的 透明質酸衍生物，產物醛基含量為56. 76%，分子量為680KDa。稱取Ig聚琥珀醯亞胺溶解於IOOml N, N-二甲基甲醯胺中，加入Ig戊二胺，在 40°C水浴攪拌反應12h，期間會有沉澱產生。反應結束後過濾收集沉澱物，將沉澱物再次溶 解於IOOml去離子水中，經過超濾去除未反應的小分子，凍幹收集得具有雙胺基團的聚天 門冬氨酸衍生物。稱取0. IOg透明質酸衍生物和0. IOg聚天門冬氨酸衍生物分別溶解於Iml模擬人 工體液(pH = 7. 4，濃度為0. 2mol/L)中，待其完全溶解後，將Iml透明質酸衍生物溶液和 ImL聚天門冬氨酸衍生物溶液用漩渦震蕩混合均勻，再放置於30°C水浴中恆溫，靜止製得
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權利要求
一種透明質酸和聚天門冬氨酸原位交聯型凝膠，其特徵在於由具有雙醛結構的透明質酸和具有雙胺基團的聚天門冬氨酸之間的縮合反應製得，可由下述方法得到透明質酸衍生物和聚天門冬氨酸衍生物分別按照質量百分比1～10％溶解在緩衝液中，在10～50℃下將透明質酸衍生物和聚天門冬氨酸衍生物溶液按比例4∶(1～16)混合反應，所述緩衝液的pH值範圍為5.0～8.0，離子濃度為0.01～0.5mol/L，反應溫度為10～50℃，凝膠化時間為10秒～30分鐘。
2.如權利要求1所述一種透明質酸和聚天門冬氨酸原位交聯型凝膠的製備方法，包括 如下步驟透明質酸衍生物和聚天門冬氨酸衍生物分別按照質量百分比1 10%溶解在緩 衝液中，在10 50°C下將透明質酸衍生物和聚天門冬氨酸衍生物按4 (1 16)混合反 應，所述緩衝液的pH值為5. 0 8. 0，離子濃度為0. 01 0. 5mol/L，溫度為10 50°C。
3.如權利要求2所述一種透明質酸和聚天門冬氨酸原位交聯型凝膠的製備方法，其特 徵在於所述透明質酸衍生物的製備方法如下將透明質酸溶解在水中，在溫度為0 50°C 的條件下，加入氧化劑氧化透明質酸1 24h，再用乙二醇終止反應，再將混合物用水透析3 天，凍幹得到透明質酸衍生物。
4.如權利要求2所述一種透明質酸和聚天門冬氨酸原位交聯型凝膠的製備方法， 其特徵在於所述氧化劑為高錳酸鉀、高碘酸鈉、雙氧水，氧化劑與透明質酸的質量比例為 5 (1 25)，所述氧化反應溫度範圍為10 50°C，氧化反應時間為1 24h。
5.如權利要求2所述一種透明質酸和聚天門冬氨酸原位交聯型凝膠的製備方法，其特 徵在於所述緩衝液為檸檬酸_氫氧化鈉_鹽酸緩衝液、檸檬酸_檸檬酸鈉緩衝液、磷酸氫二 鈉_磷酸二氫鈉緩衝液、磷酸氫二鈉_磷酸二氫鉀緩衝液、磷酸二氫鉀_氫氧化鈉緩衝液、 巴比妥鈉_鹽酸緩衝液、Tris-鹽酸緩衝液、硼酸-硼砂緩衝液、碳酸鈉_碳酸氫鈉緩衝液、 模擬人工體液或人工淚液；緩衝液中無機鹽的種類為氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、磷酸 二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀。
6.如權利要求2所述一種透明質酸和聚天門冬氨酸原位交聯型凝膠的製備方法，其特 徵在於所述凝膠化時間為10秒 30分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種透明質酸和聚天門冬氨酸原位交聯型凝膠及其製備方法。具體步驟為以透明質酸和聚琥珀醯亞胺為原料，用氧化劑氧化透明質酸製備得到具有雙醛基團的透明質酸衍生物，用雙胺類物質接枝改性聚琥珀醯亞胺得到具有雙胺基團的聚天門冬氨酸衍生物，將兩種高聚物衍生物分別溶解在緩衝液中，將兩者混合，通過縮合反應使其凝膠化，本發明的優點為製備工藝簡單，反應過程溫和、凝膠化時間短且可控制，凝膠製備過程中無需使用交聯劑、製備得到的水凝膠性能穩定、生物相容性好、生物可降解，可以通過注射的手段用於組織工程、栓塞材料和藥物緩釋領域。
文檔編號C08L5/08GK101921481SQ20101023783
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月27日 優先權日2010年7月27日
發明者張睿, 譚天偉 申請人:北京化工大學