5』-核苷酸酶診斷試劑盒及5』-核苷酸酶活性濃度測定方法
2023-08-07 11:56:06 1
專利名稱：5』-核苷酸酶診斷試劑盒及5』-核苷酸酶活性濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種5，-核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定5，-核苷酸酶活性濃度的方法，屬於醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
醫學研究表明，5'-核苷酸酶(5NT)增高主要見於阻塞性黃膽，也可見於肝癌和肝炎。在膽汁淤積並發膽管炎、原發性和繼發性膽汁性肝硬化和慢性肝炎時，5NT升高率高於鹼性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時5NT升高的敏感性高於鹼性磷酸酶。因為5'-核苷酸酶活性無生理性升高，對於診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較鹼性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測定5'-核苷酸酶的活性對於疾病的診斷具有重要意義。
5'-核苷酸酶的活性測定方法很多，主要有同位素底物法、化學強酸測磷法(1925年)。據申請人了解，目前國際上普遍採用同位素底物測試法，方法為5'-核苷酸酶作用於H3-dUMP，終止反應後，通過離子交換層析柱分析結果，求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5'-核苷酸酶作用於單磷酸腺苷後產生無機磷，再用化學強酸法分析無機磷含量得以計算出5'-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法複雜還有同位素汙染，而且需要同位素測定儀，因此難以切實推廣應用。無機磷測定法是1925年發明的方法，準確度不好，強酸汙染環境等等，也不適合推廣應用。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續
監測還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定5，-核苷酸酶活性濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的5'-核苷酸酶診斷試劑盒，採用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行5'-核苷酸酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。本發明5，-核苷酸酶活性濃度測定方法原理如下
核苷單磷酸+水5核苷酸酶核苷+磷酸根
磷酸根+葡萄糖葡萄糖-6-磷酸酶葡萄糖-6-磷酸+水
葡萄糖-6-磷酸+輔酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶
葡糖酸內酯磷酸+還原型輔酶核苷單磷酸可以是腺苷單磷酸、肌苷單磷酸、尿苷單磷酸等這種方法應用5，-核苷酸酶(5'-Nucleotidase; EC3丄3.5)酶(偶)聯葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase; EC 3.1.3.9)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase; EC 1.1.1.49)酶促反應連續監測法。5，-核苷酸酶酶解核苷單磷酸反應產生磷酸根，再通過(偶)聯合葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算5'-核苷酸酶酶的活性濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明5'-核苷酸酶診斷試劑較為理想緩衝液 100mmol/L
穩定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
葡萄糖-6-磷酸酶 6000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 12000 U/L
核苷單磷酸 5 mmol/L
葡萄糖 16mmol/L
本發明的5'-核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩衝液、穩定劑、輔酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、核苷單磷酸、葡萄糖。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑1
緩衝液、穩定劑、輔酶、核苷單磷酸、葡萄糖。試劑2
緩衝液、穩定劑、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。輔酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、核苷單磷酸、葡萄糖在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑1
緩衝液、穩定劑、輔酶、核苷單磷酸、葡萄糖。試劑2
緩衝液、穩定劑、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。 試劑3
緩衝液、穩定劑、葡萄糖-6-磷酸酶。 輔酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、核苷單磷酸、葡 萄糖在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是幹 粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定5，-核苷酸酶活性濃度的 方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的5'-核苷酸酶診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 10Ommol/L
穩定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
葡萄糖-6-磷酸酶 6000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 10000 U/L
核苷單磷酸 5 mmol/L
葡萄糖 16mmol/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑; 使用前，加入純淨水，復溶後使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始
吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測5，-核苷 酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25,反應方向為正反應(上升反應)， 延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值4180。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5，-核苷 酸酶的活性濃度大小。 實施例二
本實施例的5'-核苷酸酶診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液
穩定劑
輔酶
核苷單磷酸
100 mmol/L 50 mmol/TL 3 mmol/L 5 mmol/L 16 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 穩定劑
葡萄糖-6-磷酸酶 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶
100mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L 10000U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測5，-核苷酸酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上 升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K 值2170。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5，-核苷 酸酶的活性濃度大小。 實施例三
本實施例的5，-核苷酸酶診斷試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 10Ommol/L 穩定劑 50 mmol/L
3 mmol/L 5 mmol/L 16 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑
葡萄糖-6-磷酸酶
核苷單磷酸
500 mmol/L 10000U/L
500 mmol/L 6000 U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用測定5，-核苷酸酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度
37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測 試副波長405nm，被測5'-核苷酸酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的 體積比例為4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約 l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5，-核苷 酸酶的活性濃度大小。
申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他測定方法 均能達到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類同，不 另一一例舉。
總之，實驗證明採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化 分析儀器得出所需的測定結果~~"空白試劑吸光度變化(AA/min)《 0.002;吸光度時間反應曲線應呈直線上升；試劑可測有效(RX).99) 線形範圍可達300U/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過士 8 %;試劑測試的精密度(重複性)的變異係數(CV)《1.0%;試劑 的靈敏度可達0.0002-0.0004 AA/min/U/L——本發明靈敏度高、精確度 好，線形範圍寬廣，足以便於推廣應用。
權利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯法技術的5』-核苷酸酶活性濃度測定方法，其方法原理如下核苷單磷酸+水 5核苷酸酶 核苷+磷酸根磷酸根+葡萄糖 葡萄糖-6-磷酸酶 葡萄糖-6-磷酸+水葡萄糖-6-磷酸+輔酶 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 葡糖酸內酯磷酸+還原型輔酶核苷單磷酸可以是腺苷單磷酸、肌苷單磷酸、尿苷單磷酸等將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出5』-核苷酸酶的活性濃度大小測定結果。
2. —種5'-核苷酸酶診斷試劑盒，主要成分包括緩衝液 穩定劑葡萄糖-6-磷酸酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶核苷單磷酸試劑成分的濃度不一定只限於上述範圍；在此範圍內效果較好， 在此範圍外，試劑仍會反應作用。其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使 用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述5'-核苷酸酶診斷試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、輔酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、 核苷單磷酸、葡萄糖組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述5'-核苷酸酶診斷試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫 酶、核苷單磷酸、葡萄糖組成雙劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定 齊U、輔酶、核苷單磷酸、葡萄糖組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、 葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成。輔酶、葡萄糖-6-磷 酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、核苷單磷酸、葡萄糖在試劑1或試劑 2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述5'-核苷酸酶診斷試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫 酶、核苷單磷酸、葡萄糖組成多劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定 劑、輔酶、核苷單磷酸、葡萄糖組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成；試劑3，由緩衝液、穩定劑、葡萄糖-6-磷酸酶組成。輔酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、核 苷單磷酸、葡萄糖在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述5'-核苷酸酶診斷試劑盒，其特徵在於還包 括穩定劑1—4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的5』-核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定5』-核苷酸酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、輔酶、核苷單磷酸、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出5』-核苷酸酶的活性濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464261SQ20071019141
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優先權日2007年12月19日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司