穩定表達螢光蛋白的人肝癌高轉移細胞株及其建立方法
2023-08-07 05:50:56 1
專利名稱：：穩定表達螢光蛋白的人肝癌高轉移細胞株及其建立方法
技術領域：
：本發明屬微生物動物細胞系領域，涉及螢光標記的人肝癌高轉移細胞株，具體涉及能穩定表達紅色螢光蛋白(RFP)或綠色螢光蛋白(GFP)、具肺與淋巴結高轉移能力的人肝癌細胞株，及其建立方法。
背景技術：
：原發性肝細胞癌是我國乃至全球的高發惡性腫瘤之一。據統計，在我國—每年約有20萬人死於肝癌，佔全球肝癌死亡人數的50%左右。原發性肝細胞癌已日益成為嚴重影響人們健康的一種重大惡性疾病。近年來，各國政府、相關醫療與科研機構以及藥物研發和生產企業加大了對原發性肝細胞癌的臨床與基礎研究工作。目前在臨床上有多種肝癌治療方法，如手術切除、肝動脈化療栓塞(TACE)、外放射治療、瘤內酒精注射(PAI)、微波固化治療(PMCT)、射頻消融(RFA)、雷射熱療(LTT)及肝移植等，但療效均有限。肝癌五年的復發與轉移率高達60%，總體生存率仍低於5%。總之，現有治療手段未能顯著延長肝癌患者的生存期、改善病人的生存質量。究其原因有以下三點第一、肝癌發—病隱匿，癌細胞容易早期播散。第二、傳統療法均不能徹底消滅肝癌細胞且具有較大的毒副作用，限制了它們在臨床上的反覆應用。第三、目前國內外尚缺乏能在體內外長期穩定表達的、實驗重複性能高的、螢光蛋白標記的、淋巴結與肺高轉移的肝癌細胞系，以滿足肝癌復發與轉移生物學行為的早期示蹤研究、分子機理研究以及抗肝癌新藥療快速效篩選的螢光標記研究模型。為此，復旦大學肝癌研究所建立了人肝細胞癌裸小鼠模型(腫瘤1986,6:10-13)、高轉移人肝細胞癌裸小鼠模型UntJCancer1996，66:239-243)、高轉移人肝細胞癌細胞系HCCLM3和HCCLM6(JCancerResClinOncol.2004;T30:187-196;JCancerResClinOncol.2004;130:460-468;中華醫學雜誌.2004;84:675-679;CancerGenetCytogenet.2005;158:180-183;和ClinCancerRes.2006;12:7140-7148)。目前國內外腫瘤細胞螢光蛋白標記技術多釆用螢光蛋白編碼基因的脂質體轉染方法。釆用該技術普遍存在著以下幾大缺陷1)在體外細胞培養體系中，螢光蛋白編碼基因不易轉染佔細胞總數70。/。左右的G0-Gl期腫瘤細胞，故目的基因轉染效率低下；2)螢光蛋白編碼基因轉染的腫瘤細胞常需要一個連續、複雜的抗生素如新黴素(G418)等的體外篩選過程，極易造成細胞汙染；3)螢光蛋白編碼基因在腫瘤細胞染色體上的整合效率很低，在體外連續細胞傳代過程中螢光蛋白編碼基因很容易丟失，因此不易獲得長期穩定表達的螢光示蹤腫瘤細胞。研發新一代_穩定表達紅色或綠色螢光的人肝癌高轉移細胞系已引起本領域研究人員的關注。
發明內容本發明的目的是提供穩定表達螢光蛋白的人肝癌高轉移細胞株及其建立方法，更具體的是建立染色體整合型、穩定表達紅色或綠色螢光蛋白編碼基因的、肺與淋巴結高轉移的人肝癌細胞系。本發明所述的人肝癌細胞系是HCCLM3-R或HCCLM3-G或HCCLM6-R或HCCLM6-G。本發明所述的螢光蛋白是具有序列1的紅色螢光蛋白UFP)或具有序列—2的綠色螢光蛋白(GFP)。本發明為克服現有技術上的難點，釆用螢光蛋白編碼基因轉染策略，用能感染包括G0-G1、S及G2期腫瘤細胞的、廣譜的、染色體整合型的Lentivinis病毒載體系統，替代傳統的脂質體轉染方法，採用已克隆的肺與淋巴結高轉移的人肝癌細胞系HCCLM3和HCCLM6(復旦大學肝癌研究所)為母細胞，通過三種慢病毒包裝質粒PLVTHM、pCMV-dR8.74和pMD2G(Tronolab公司，圖l-3)在大腸桿菌中的質粒DNA擴增、回收和純化。純化獲得的三種質粒DNA按一定比例用CaCl2方法共轉染293細胞，產生可真核表達RFP或GFP螢光蛋白基因的假慢病毒顆粒，經病毒純化、活性測定後，感染上述HCCLM3和HCCLM6肝癌細胞株(母細胞)，按常規方法分別進行螢光表達肝癌細胞的擴增建系".蕕得高強度、染色體整合型、穩定表達紅色或綠色螢光的、肺與淋巴結高轉移的人肝癌細胞。分別命名為HCCLM3-R(紅色螢光)，HCCLM3-G(綠色螢光)，HCCLM6-R(紅色螢光)和HCCLM6-G(綠色螢光)(圖4,圖5)。本發明所釆用的紅色或綠色螢光蛋白編碼基因、轉染方法及螢光表達肝癌細胞具有以下特徵1、所釆用的紅色螢光及綠色螢光蛋白編碼基因是經過基因改造，可有效延緩螢光淬滅的時間，增加螢光的表達強度。2、所採用的假慢病毒感染新策略，對各期即G0-G1、S及G2期的肝癌細胞均—有感染，是廣譜的、外源基因染色體整合型的、穩定表達的病毒感染系統。紅色或綠色螢光陽性表達HCCLM3和HCCLM6肝癌細胞系不需要經過體外繁複、連續的篩選程序，避免了細胞克隆中的可能汙染，縮短了獲得陽性細胞的克隆時間。同時極大地提高了紅色螢光或綠色螢光蛋白編碼基因的細胞轉染效率和穩定表達率，提高了實驗的重複率。3、本發明獲得的紅色螢光蛋白表達肝癌細胞HCCLM3-R,HCCLM6-R細胞以及綠色螢光蛋白表達肝癌細胞HCCLM3-G，HCCLM6-G均可在常規條件下進行細胞傳代。其中HCCLM3-R和HCCLM6-R肝癌細胞可在激發波長為化0nm、發射波長為585nm的條件下，用螢光顯微鏡進行觀察；HCCLM3-G和HCCLM6-G肝癌細胞可在激發波長為488nm、發射波長為509nm的條件下，用螢光顯微鏡進行觀察。4、本發明所獲得的紅色或綠色螢光蛋白表達的高轉移人肝癌細胞系，其特徵是穩定發射紅色或綠色螢光,細胞呈多邊形上皮樣，貼壁生長，接觸性生長抑制喪失，亞三倍體核型，染色體數目50-58條，均分泌AFP蛋白。其餘主要生物學行為與其相應的母細胞基本一致。本發明用慢病毒感染的方法獲得了高染色體整合度、高螢光強度、遺傳性狀穩定的、肺與淋巴結高轉移人肝癌細胞系HCCLM3-R，CCLM3-G，HCCLM6-R和HCCLM6-G。所述的肝癌細胞具有持續表達高強度紅色螢光及綠色螢光的能力，其螢光強度不隨肝癌細胞的連續傳代(觀察至36代)而-丟失。螢光基因的整合和表達不影響肝癌細胞的主要生物學行為，為理想的、螢光示蹤的肝癌細胞模型。本發明獲得的螢光表達肝癌細胞系，在體外常規的二維及三維細胞培養體系中生長良好，可用於肝癌生長、轉移及死亡的分子機理研究；或作為抗腫瘤新藥療效判別的效應細胞。此外，還可作為裸鼠皮下接種的肝癌細胞，用於裸鼠皮下和肝臟原位螢光示蹤肝癌模型的建立，為儘早發現裸鼠體內肝癌細胞復發與轉移等生物學行為的變化提供參考，以及為在體抗腫瘤新藥或其他幹預治療的效果評估提供便利。本發明在肝癌基礎研究及藥物臨床前期研究中具有廣闊的應用前景和潛^E的社會與經濟價值。圖l、慢病毒包裝質粒pLVTH的結構示意圖。圖2、慢病毒包裝質粒pCMV-dR8.74的結構示意圖。圖3、慢病毒包裝質粒pMD2.G的結構示意圖。圖4不同傳代時間的HCCLM3-R和HCCLM6-R肝癌細胞的紅色螢光表達情況。圖5—不同傳代時間的HCCLM3-G和HCCLM6-G肝癌細胞的綠色螢光表達情況。具體實施方式實施例11、慢病毒包裝質粒(Lentivirualvector):釆用Lentivirus慢病毒載體系統(Tronolab公司)。該病毒包裝系統由pLVTHM(圖1),pCMV-dR8.74(圖2)和pMD2G(圖3)三質粒組成，其中pLVTH含有RFP或GFP基因，由EF1(ElongationFactor)啟動子驅動(圖1)。pCMV-dR8.74含有HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的結構蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因，編碼調節gag和pol基因表達的調節因子(圖2)。pMD2G含有單純皰疹病毒來源的VSVg基因，提供病毒包—裝所需要的衣殼蛋白(圖3)。2、質粒DNA的擴增質粒pLVTHM、pCMV-dR8.74和pMD2G按常規方法轉化大腸桿菌，用相應抗生素條選陽性克隆,用DM提取試劑盒(Qiagen公司)進行質粒DNA抽提，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Promega公司)進行質粒純化。3、慢病毒的包裝與純化將lOjagpLVTHM,5|iigpCMV-dR8.74和3.5ygpMD2G的質粒DNA溶於1800(il無菌水中，加入200^U2.5mol/LCaC12溶液，混勻後再逐滴加入2000pi2xBBS緩衝液，在室溫放置20~30min。將上述DNA-磷酸鉤混合液轉染融合度為50%-70%的新鮮培養29—3細胞，置於37。C、5%C02細胞培養箱中，12小時後換新鮮細胞培養液，繼續培養72小時，經低速離心、過濾和超速離心，收集上清液中的病毒顆粒。4、病毒滴度的測定用5x105/100pl/孔的293細胞鋪在96孔板中。用DMEM培養液IO倍連續稀釋病毒顆粒。12小時後吸盡96孔板中的細胞培養液，加人45nl病毒顆粒稀釋液，37。C溫育36小時後，更換含10%FBS的新鮮培養液，3天後在倒置螢光顯微鏡下檢測GFP或RFP的表達量。以5個克隆細胞均為陽性的病毒最高稀釋度為該批病毒的最終滴度。5、HCCLM3和HCCLM6細胞的病毒感染用1x106/2ml/孔的HCCLM3和HCCLM6細胞鋪在6孔板中，12小時後吸盡細胞培養上清液，加入2ml5xl05-lxl06Tl)/ml病毒感染液，48小時後換用新鮮細胞培養液，72小時觀察螢光表達細胞的陽性率。當HCCLM3和HCCLM6細胞的病毒感染率小於95%時，用400-600ng/ml的G418殺滅低表達或不表達螢光的細胞。6、螢光表達細胞的擴增及表達穩定性的鑑定螢光表達HCCLM3和HCCLM6細胞，經體外180天的連續傳代培養，結果顯示，肝癌細胞的螢光表達強度及表達率沒有發生明顯的改變。獲得穩定表達紅色和綠色螢光的HCCLM3和HCCLM6細胞。分別命名為HCCLM3-R(紅色螢光)，HCCLM3-G(綠色螢光),HCCLM6-R(紅色螢光和HCCLM6-G(綠色螢光，)(圖4「圖5)。7、螢光表達細胞的生物學功能驗證HCCLM3-R,HCCLM3-G,HCCLM6-R和HCCLM6-G肝癌細胞的一般生物學特性為，多邊形上皮樣腫瘤細胞，貼壁生長，接觸性生長抑制喪失，亞三倍體核型，染色體數目50-58條，可在裸鼠皮下及肝臟原位成瘤。HCCLM3-R和HCCLM3-G細胞的倍增時間、細胞周期、侵襲與轉移能力與其母細胞HCCLM3相似；HCCLM6-R和HCCLM6-G細胞的倍增時間、侵襲與轉移能力與其母細胞HCCLM6相結果表明，本發明較現有技術明顯地提高了紅色螢光及綠色螢光蛋白編—碼基因的轉染效率及對肝癌細胞染色體的整合效率；同時對紅色及綠色蛋白編碼基因通過有目的性的基因改造，有效地延緩了螢光淬滅的時間，增加螢光的強度；此外，免除了紅色及綠色螢光表達的肝癌HCCLM3和HCCLM6細胞系的體外連續篩選程序。本發明所獲得的紅色螢光及綠色螢光標記的、肺與淋巴結高轉移的人肝癌HCCLM3和HCCLM6細胞，經體外180天、36代的連續培養發現，紅色及綠色螢光表達HCCLM3和HCCLM6肝癌細胞具有螢光強度強、螢光不易被淬滅，螢光表達穩定，且不改變原有細胞生物學功能等特性，是較為理想的人高轉移肝癌螢光示蹤細胞。可在體外二維及三維細胞培養體系中作為螢光,示記的實驗細胞，用於肝癌生長、轉移及死亡的分子機理研究；也可作為效療判別細胞用於抗肝癌新藥的療效觀察；也可作為裸鼠皮下接種的螢光標記肝癌細胞，用於螢光可視人高轉移肝癌裸鼠皮下模型和肝臟原位模型的建立，用於肝癌早期復發與轉移生物學行為的監視，以及在體藥物或其他幹預治療效果的評估。表1是慢病毒與其他常用病毒感染系統的特性比較。表2是HCCLM3-R，HCCLM3-G與野生型HCCLM3的生物學特性比較。表3是HCCLM6-R,HCCLM6-G與野生型HCCLM6的生物學特性比較。tableseeoriginaldocumentpage9表2HCCLM3HCCLM3-RHCCLM3-G表達螢光類型無紅色綠色激發波長(nm)無560488發射波長(nm)無585509病毒感染後72小時的0>99.0>99.0細胞螢光表達率(％)體外傳代180天後的0>99.0>99.0細胞螢光表達率(％)螢光表達強度(MOI)0>95>100AFP+++細胞倍增時間(h)35.035.032.0中期染色體數50-5650-5650-56表3:--—HCCLM6HCCLM6-RHCCLM6-G表達螢光類型無紅色綠色激發波長(nm)無560488發射波長(nm)無585509病毒感染後72小時的0>99.0>99.0細胞螢光表達率(％)體外傳代180天後的0>99.0>99.0細胞螢光表達率(％)螢光表達強度(MOI)0>卯>100AFP+++細胞倍增時間(h)33.034.030.0中期染色體數52-5852-5852-58SEQUENCELISTING<110〉復旦大學附屬中山醫院穩定表達螢光蛋白的人肝癌高轉移細胞株及其建立方法<130〉11<160〉2Patentlnversion3.1——1<211〉675<212〉DNA<213〉昆蟲1atggcctcctcatggagggcaccgtgaacgctac鵬ggccacaacaccgctgggacatcctgtcccccccgacatccccgactacaagagaacttcgaggacggcggcgcttcatctacaaggt，gtgaagaagaccatgggctgggg^gggcgagacccacaaggcaagtccatcccgagaacgt60gccacgagtt120tgaagctgaa180agttccagta240agctgtcctt300tggcgaccgt360tcatcggcgt420sggcctccac480ccctgaagct540catcaccgagcgagatcgagggtgaccaagcggctccaagccccgagggcgacccaggacgaacttcccccgagcgcctggaaggacggcUcatgcgctggcgagggcgggcggcccccgtgtacgtgattcaagtgggtcctccctgctccgacggcctacccccgcgggccactacctcaaggtgcgagggccgccctgcccttcgcagcaccccgcagcgcgtgataggacggctgccgtgatgcaacggcgtgcttggtggagtttacatggccaagaagcccgtgcagctgcccggctactactacgtggacgccaagctggac600atcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggagcagtacgagcgcaccgagggccgc660caccacctgttcctg6752720隠昆蟲2atggtgagcacgagctggacggcgacgtaatgcca—cctacggcaagctgeictggcccaccctcgtgaccaccacatgaagcagcacgactcaccatcttcttcaaggacgcgacaccctggtgaETCicgcacctggggcacaagctggagtgcagaagaacagggcgagga60acggccacaa120ccctgaagtt180ccctgaccta240tcttcaagtc300acggcaacta360tcgagctgaa420acaactacaa480gctgttcaccgttcagcgtgcatctgcacccggcgtgcagcgccatgccccaagacccgcgggcatcgaccagccacaacggggtggtgctccggcgaggaccggcaagctgcttcagccgaaggcUcggccgaggtgattcaaggagggtctatatcaccatcctggtgcgagggcgatgcccgtgccgctaccccgatccaggagcgagttcgagggacggcaacattggccgacaaggcatcaagggcagctcgccgaccactacccgacaaccactacctgagcatcacatggtcctgctggagtgtaca—agtaatgaacttcaa540agcagaacac600cccagtccgc660tcgtgaccgc720gatccgccacccccatcggccctgagcaaacgccgggatcaacatcgagggacggccccggaccccaacgactctcggcaacggcagcgttgctgctgccagaagcgcgatggacgagct權利要求1、穩定表達螢光蛋白的人肝癌高轉移細胞株，其特徵是以HCCLM3或HCCLM6為母細胞，假慢病毒轉染螢光蛋白編碼基因，穩定發射紅色或綠色螢光，命名為紅色螢光蛋白表達肝癌細胞HCCLM3-R或HCCLM6-R以及綠色螢光蛋白表達肝癌細胞HCCLM3-G或HCCLM6-G，細胞呈多邊形上皮樣，貼壁生長，接觸性生長抑制喪失，亞三倍體核型，染色體數目50-58條，分泌AFP蛋白。2、按權利要求1所述的穩定表達螢光蛋白的人肝癌高轉移細胞株，其特徵是所述的螢光蛋白是具有序列1的紅色螢光蛋白RFP或具有序列2的綠色螢光蛋白GFP。3、按權利要求1所述的穩定表達螢光蛋白的人肝癌高轉移細胞株，真—特徵是所述的HCCLM3-R和HCCLM6-R肝癌細胞的螢光顯微鏡觀察條件是激發波長為560nm、發射波長為585nm;HCCLM3-G和HCCLM6-G肝癌細胞的螢光顯微鏡觀察條件是激發波長為488nm、發射波長為509nm。4、權利要求1的穩定表達螢光蛋白的人肝癌高轉移細胞株的建立方法，其特徵是釆用螢光蛋白編碼基因轉染，用假慢病毒感染替代傳統的脂質體轉染方法，通過下述步驟1)採用肺與淋巴結高轉移的人肝癌細胞系HCCLM3和HCCLM6為母細胞，通過三種慢病毒包裝質粒pLVTHM、pCMV-dR8.74和pMD2G在大腸—tf菌中的質粒DNA擴增、回收和純化；2)純化獲得的三種質粒DNA按比例用CaCh方法共轉染293細胞，產生可真核表達RFP或GFP螢光蛋白基因的假慢病毒顆粒，經病毒純化、活性測定後，感染上述HCCLM3和HCCLM6肝癌細胞株；3)分別進行螢光表達肝癌細胞的擴增建系，獲得高強度、染色體整合型、穩定表達紅色或綠色螢光的、肺與淋巴結高轉移的人肝癌細胞HCCLM3-R或HCCLM3-G或HCCLM6-R或HCCLM6-G。全文摘要本發明屬微生物動物細胞系領域，涉及可發射高強度紅色或綠色螢光，具肺與淋巴結高轉移能力的人肝癌細胞系及其建立方法。本發明以肺與淋巴結高轉移的人肝癌細胞系HCCLM3、HCCLM6為母細胞，通過慢病毒包裝質粒對293細胞的質粒DNA共轉染，獲得真核表達紅色或綠色螢光蛋白基因的假慢病毒顆粒，感染上述母細胞肝癌細胞株，得到染色體整合型、可穩定表達紅色或綠色螢光的肺及淋巴結高轉移肝癌細胞系。本發明的肺與淋巴結人高轉移肝癌細胞系在體內外可作為腫瘤細胞的示蹤研究、肝癌復發與轉移的分子機理研究，以及抗腫瘤新藥臨床前期的藥物療效研究等，有廣闊的應用前景。文檔編號C12N15/65GK101381706SQ20071004567公開日2009年3月11日申請日期2007年9月6日優先權日2007年9月6日發明者吳偉忠,夏景林,孫惠川,泱徐,楊畢偉,英梁,湯釗猷,魯王申請人:復旦大學附屬中山醫院