高表達耐拉米夫定hbv病毒肝癌細胞株的製作方法

2023-08-07 05:19:46

專利名稱：高表達耐拉米夫定hbv病毒肝癌細胞株的製作方法
技術領域：
本發明屬微生物動物細胞系領域，涉及基於H印G2穩定高表達HBV YVDD變異株細胞系，具體涉及基於HepG2穩定高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株，尤其涉及高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株H印G2. HS204V及其製備方法。本發明的細胞株可用於篩選抗HBV藥物、研究HBV生物學特點及其與細胞間相互作用的HBV細胞模型。
背景技術：
現有技術公開了 HBV細胞模型是篩選抗藥物、研究其生物學特點及其與細胞間相互作用的必要工具，尤其在研究有關肝疾病的發病機制、免疫機制、抗病毒藥物的篩選中具有重要作用；其中，Hep2. 2. 15細胞是HBV細胞模型開發研究的裡程碑，有研究顯示，其用含2個HBV頭對尾二聚體的pDolt-HBV-Ι重組載體轉染H印G2細胞，經G418篩選後獲得一個 產高水平HBsAg和HBeAg的細胞克隆，其胞內外均能檢測到HBV-DNA以及具有感染性的完整病毒顆粒。迄今，Hep2. 2. 15仍是相關領域應用最為廣泛的HBV細胞模型。近年來，臨床治療有關肝疾病多採用以拉米夫定為代表的核苷類似物類抗HBV藥物，取得了較好的療效，為眾多慢性B型肝炎(CHB)患者帶來福音，但同時，也產生了嚴重的耐藥問題；因此，對於HBV耐核苷類藥物的分子生物學機制的研究成為目前臨床治療的重中之重。在HBV耐藥株逐年上升的臨床背景下，!fep2. 2. 15顯然已經不能完全滿足對於耐核苷類藥物HBV病毒株的研究，為進一步研究HBV耐藥的分子生物學機制以及新的抗HBV藥物的篩選，需要建立一種能夠穩定表達HBV耐藥變異株細胞系。目前，已知耐核苷類藥物HBV的基因變異主要集中於反轉錄區(RT區)，臨床實踐中最廣泛的耐藥病毒株為rtM204V即YVDD變異，其可導致HBV對於拉米夫定(LAM)的敏感性明顯下降，低於對照野毒株越45倍左右；但是，通過細胞轉染可發現，LAM誘導的rtM204V變異株複製效率大約比野毒株低100倍左右，表現為pgRNA、子代DNA包裝、病毒顆粒釋放減少以及聚合酶活性降低等方面。rtM204V的補償變異rtL180M可能在一定程度上對YVDD變異株的複製有所補償，但也明顯低於野毒株的複製能力。由於耐核苷類藥物HBV變異株的複製能力大幅下降，由HBV耐藥變異株基因構建穩定表達HBV變異株細胞系的難度也明顯增高。有研究嘗試，在含核心啟動子I. 3-1. 7倍體或外源性CMV啟動子I. I倍體HBV真核表達載體直接誘變為耐藥基因型轉染H印G2細胞，構建HBV變異株細胞系；但總體結果顯示，HBV-DNA合成、HBsAg與HBeAg等病毒蛋白以及病毒顆粒釋放水平明顯低於Ifep2. 2. 15細胞。至今未見有關適合的基於!fepG2穩定高表達HBV YVDD變異株細胞系的報導。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的缺陷和不足，提供一種基於H印G2穩定高表達HBVYVDD變異株細胞系，具體涉及基於HepG2穩定高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株，尤其涉及高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株H印G2. HS204V及其製備方法。本發明的細胞株可用於篩選抗HBV藥物、研究HBV生物學特點及其與細胞間相互作用的HBV細胞模型。本發明的基於!fepG2穩定高表達HBV YVDD變異株細胞系，能持續表達HBsAg及HBeAg，胞內有HBV複製，並可產生HBV顆粒；與目前廣泛使用的Ifep2. 2. 15相比，本發明的細胞系表達HBsAg及HBeAg明顯高於H印2. 2. 15，細胞上清HBV顆粒水平與H印2. 2. 15基本持平。本發明提供了一種高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株，該細胞對LAM不敏感而對ADV敏感；HBV胞內複製水平隨LAM濃度上升無明顯下降，而隨ADV濃度上升逐步下降。本發明將HBV真核表達質粒PREP-HBV-YVDD轉染H印G2細胞後，通過潮黴素篩選，然後檢測細胞中HBV複製、特異性抗原的表達及病毒顆粒的產生，並與Hep2. 2. 15細胞株相 比較，最終建成基於H印G2穩定高表達HBV YVDD變異株細胞系，獲得高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株H印G2.HS204V，已於2011年5月13日保藏，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號=CGMCC No. 4859，分類命名高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株(!fepG2· HS204V)。本發明中，所述的HBV真核表達質粒pREP-HBV-YVDD，來源於福建醫科大學分子病
毒實驗室；所述質粒的載體骨架為pREPIO載體,該載體的優勢在於潮黴素Hygromycin抗性基因有利於細胞篩選工作及EBNA-I基因轉錄蛋白能夠上調含OriP複製原點的真核表達質粒中基因轉錄和表達；所述的HBV複製子為含cp啟動子及完整HBV前基因組的HBV1. 2倍體，並定點誘變為拉米夫定耐藥基因型L180M+M204V後插入切除RSV啟動子的pREPIO，構建成HBV真核表達質粒 pREP-HBV-YVDD。本發明的細胞株具有以下生物學特性能持續表達HBsAg及HBeAg，胞內有HBV複製，並可產生HBV顆粒；其與目前廣泛使用的H印2. 2. 15相比，該細胞系表達HBsAg及HBeAg明顯高於Ifep2· 2. 15，細胞上清HBV顆粒水平與Ifep2· 2. 15基本持平。本發明提供了所述的細胞株的製備方法，包括以下步驟(I)質粒轉染H印G2細胞①細胞培養!fepG2細胞以DMEM培養液培養；所述培養液來源於Gibco公司，培養液中含10%小牛血清，100U/ml青黴素，100 μ g/ml鏈黴素，O. 03%穀氨醯胺；②細胞轉染將處於生長對數期的細胞，以O. 25%胰酶消化，吸去胰酶後，用細胞培養液吹打成單個細胞懸液，計數；按5X IO5細胞/孔的濃度接種至6孔培養板，培養18-24小時後，待細胞約80-90%融合成片時，換新鮮無抗生素的培養液，準備轉染；按照每孔轉染2μ g的量，將50μ I OptiDMEM培養液與5μ I Lipofectamin2000轉染試劑(Invitrogen)混合，同時將2 μ g質粒DNA稀釋於50 μ I OptiDMEM培養液中，混勻後室溫靜置5分鐘；將稀釋的Lipofectamin2000與質粒DNA混和，室溫靜置20分鐘；將混合物均勻滴加入6孔板中，6小時後用PBS清洗2遍後換新鮮培養液，繼續培養；
(2)潮黴素篩選細胞克隆①轉染後細胞培養24小時後擴大培養至IOcm培養皿，並設空白對照(未轉染HepG2 細胞)；②待細胞貼壁後加入潮黴素濃度至300ug/ml ；③每3天換液一次；④約14-21天待空白對照細胞全部死亡後觀察細胞克隆生長情況；⑤挑取細胞克隆至24孔培養板，以潮黴素濃度150ug/ml繼續培養；
⑥待24孔培養板中細胞克隆密度至60-70%後測上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA 水平；⑦獲取4株HBsAg、HBeAg及HBV-DNA陽性克隆，將陽性克隆傳至6孔培養板以潮黴素濃度150ug/ml繼續培養；(3)細胞克隆的有限稀釋步驟(2)中獲得的4株陽性克隆中的I株細胞克隆，HBsAg、HBeAg及HBV-DNA水平較高，經定量後上清HBsAg為200IU/ml左右，HBeAg水平200PeIU/ml左右，HBV-DNA水平維持於105-106COpieS/ml ;細胞傳至10代左右，採用有限稀釋法獲取更純淨以及高水平表達蛋白細胞克隆；將處於生長對數期的細胞，以O. 25%胰酶消化，吸去胰酶後，用細胞培養液吹打成單個細胞懸液，計數後細胞密度稀釋為IOcelΙ/ml，接種96孔培養板，每孔150ul培養基(含潮黴素濃度150ug/ml);顯微鏡下觀察每孔細胞數，標記只接種Icell的培養孔，繼續培養，每周換液一次；2_3周後待細胞密度約60%左右後傳至24孔培養板繼續培養；待24孔中細胞密度至60-70%後測上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，構建成HBV真核表達質粒pREP-HBV-YVDD ；(4)高表達HBV YVDD變異株的生物學特徵及表型耐藥分析①細胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平檢測所述的HBsAg及HBeAg精確定量試劑盒採用Abbott公司Archipct HBsAg Reagentkit和Archipct HBeAg Reagent kit，HBV-DNA檢測採用上海科華生物工程有限公司B肝病毒核酸定量檢測試劑盒，檢測步驟按照試劑盒提供的說明書中記載的步驟，real-time PCR擴增儀採用ABI-7300，檢測結果如圖I所示；②細胞內病毒複製檢測細胞總DNA抽提，6孔板中細胞90%匯合度時加入400ul細胞裂解液，37°C過夜，加入等量的的酚進行DNA抽提、沉澱後DNA溶解於20ul TE ; I. 3%凝膠電泳後20XSSC轉膜，southern-blot雜交；結果顯示HBV雜交信號提示胞內HBV複製；所述的細胞裂解液為lXSDS/Pronase buffer, 2mg/ml pronase、50mM Tris.HClPh7. 5、IOmM EDTAUOOmM NaCl、0. 2%SDS ；③HBV YVDD變異株細胞表型耐藥分析IO5Cell/孔細胞密度接種12孔板，細胞貼壁後加入核苷類抗病毒藥物，拉米夫定設 0、10uM、100uM、1000uM 4 個濃度梯度，阿德福韋設 0、0· luM、0. 3uM、luM、3uM、IOuM 6 個濃度梯度，每個濃度梯度設復孔，隔天換液，第10天檢測細胞上清HBV-DNA水平，細胞抽提胞內總DNA檢測胞內HBV複製情況。
檢測分析所述的高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株H印G2. HS204V,結果表明，細胞上清HBV-DNA水平隨LAM濃度梯度升高無明顯下降，隨ADV濃度梯度升高從IO5下降至檢測水平以下，結果表明，所述細胞株對LAM不敏感而對ADV敏感(如圖2所示)；雜交結果顯示HBV胞內複製水平隨LAM濃度上升無明顯下降，而隨ADV濃度上升逐步下降。本發明建立了一種能夠穩定表達HBV耐藥變異株細胞系，該細胞系表達HBsAg及HBeAg明顯高於H印2. 2. 15，細胞上清HBV顆粒水平與H印2. 2. 15基本持平，可用於研究HBV耐藥的分子生物學機制以及新的抗HBV藥物的篩選。


圖I 顯示了 pREP-HBV (L180M+M204V) HBV 耐藥變異細胞株上清 HBsAg、HBeAg 和HBV-DNA表達水平，HBsAg水平維持於150-250IU/ml之間，為H印2. 2. 15細胞15-25倍左右；HBeAg水平150-250S/C0之間，為H印2. 2. 15細胞10-20倍左右，HBV-DNA維持於IO5-IO6之
間，略高於ifep2. 2. 15細胞，並隨傳代次數增加無明顯下降。圖2顯示了 pREP-HBV (L180M+M204V) HBV耐藥變異細胞株耐藥表型分析，細胞上清HBV-DNA水平隨LAM濃度梯度升高無明顯下降，隨ADV濃度梯度升高從IO5下降至IO3之下，表明對LAM不敏感而對ADV敏感。圖3為pREP-HBV (L180M+M204V)細胞上清HBV-DNA基因測序結果表明L180M+M204V,與轉染質粒相同。圖4為本發明中pREP-HBV (L180M+M204V)細胞株鏡下細胞形態圖，其中，左圖為高倍鏡下(20 X )形態圖，右圖為低倍鏡下(10 X )形態圖。圖5為YVDD變異株(左圖)與H印G2. 2. 15野生株(右圖)LAM表型耐藥分析圖，其中，左圖顯示YVDD變異株隨LAM濃度上升胞內HBV複製無明顯下降，IC50>1000uM，表明對LAM耐藥；右圖顯示H印G2. 2. 15胞內HBV複製隨LAM濃度上升逐漸下降提示對LAM敏感。圖6為VDD變異株ADV表型分析圖，其中，胞內HBV複製隨ADV濃度上升逐漸下降，顯示對 ADV 敏感，IC50=1. 93uM。圖7顯示了 Southernblot表明細胞株隨傳代次數胞內HBV複製無明顯下降。圖8顯示了 southern blot表明YVDD變異株細胞系胞內HBV複製高於H印G2. 2. 15。
具體實施例方式實施例I建立H印G2. HS204V細胞株將HBV真核表達質粒pREP-HBV-YVDD轉染H印G2細胞後，通過潮黴素篩選，然後檢測細胞中HBV複製、特異性抗原的表達及病毒顆粒的產生，並與Hep2. 2. 15細胞株相比較，最終建成基於H印G2穩定高表達HBV YVDD變異株細胞系，獲得高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株H印G2.HS204V，已於2011年5月13日保藏，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號=CGMCC No. 4859，分類命名高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株。所述的細胞株的製備方法包括以下步驟
(I)質粒轉染H印G2細胞①細胞培養!fepG2細胞以DMEM培養液培養；所述培養液來源於Gibco公司，培養液中含10%小牛血清，100U/ml青黴素，
100μ g/ml鏈黴素，O. 03%穀氨醯胺；②細胞轉染將處於生長對數期的細胞，以O. 25%胰酶消化，吸去胰酶後，用細胞培養液吹打成單個細胞懸液，計數；按5X IO5細胞/孔的濃度接種至6孔培養板，培養18-24小時後，待細胞約80-90%融合成片時，換新鮮無抗生素的培養液，準備轉染；按照每孔轉染2μ g的量，將50μ I OptiDMEM培養液與5μ I Lipofectamin2000轉染試劑(Invitrogen)混合，同時將2 μ g質粒DNA稀釋於50 μ I OptiDMEM培養液中，混勻後室溫靜置5分鐘；將稀釋的Lipofectamin2000與質粒DNA混和，室溫靜置20分鐘；將混合物均勻滴加入6孔板中，6小時後用PBS清洗2遍後換新鮮培養液，繼續培養；
(2)潮黴素篩選細胞克隆①轉染後細胞培養24小時後擴大培養至IOcm培養皿，並設空白對照(未轉染HepG2 細胞)；②待細胞貼壁後加入潮黴素濃度至300ug/ml ；③每3天換液一次；④約14-21天待空白對照細胞全部死亡後觀察細胞克隆生長情況；⑤挑取細胞克隆至24孔培養板，以潮黴素濃度150ug/ml繼續培養；⑥待24孔培養板中細胞克隆密度至60-70%後測上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA 水平；⑦獲取4株HBsAg、HBeAg及HBV-DNA陽性克隆，將陽性克隆傳至6孔培養板以潮黴素濃度150ug/ml繼續培養；(3)細胞克隆的有限稀釋步驟(2)中獲得的4株陽性克隆中的I株細胞克隆，HBsAg、HBeAg及HBV-DNA水平較高，經定量後上清HBsAg為200IU/ml左右，HBeAg水平200PeIU/ml左右，HBV-DNA水平維持於105-106COpieS/ml ;細胞傳至10代左右，採用有限稀釋法獲取更純淨以及高水平表達蛋白細胞克隆；將處於生長對數期的細胞，以O. 25%胰酶消化，吸去胰酶後，用細胞培養液吹打成單個細胞懸液，計數後細胞密度稀釋為IOcelΙ/ml，接種96孔培養板，每孔150ul培養基(含潮黴素濃度150ug/ml);顯微鏡下觀察每孔細胞數，標記只接種Icell的培養孔，繼續培養，每周換液一次；2_3周後待細胞密度約60%左右後傳至24孔培養板繼續培養；待24孔中細胞密度至60-70%後測上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，將HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA 水平定義為 pREP-HBV-YVDD ；(4)高表達HBV YVDD變異株的生物學特徵及表型耐藥分析①細胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平檢測所述的HBsAg及HBeAg精確定量試劑盒採用Abbott公司Archipct HBsAg Reagentkit和Archipct HBeAg Reagent kit，HBV-DNA檢測採用上海科華生物工程有限公司B肝病毒核酸定量檢測試劑盒，檢測步驟按照試劑盒提供的說明書中記載的步驟，real-time PCR擴增儀採用ABI-7300 ；
②細胞內病毒複製檢測細胞總DNA抽提，6孔板中細胞90%匯合度時加入400ul細胞裂解液，37°C過夜，加入等量的的酚進行DNA抽提、沉澱後DNA溶解於20ul TE ; I. 3%凝膠電泳後20XSSC轉膜，southern-blot雜交；結果顯示HBV雜交信號提示胞內HBV複製；所述的細胞裂解液為lXSDS/Pronase buffer, 2mg/ml pronase、50mM Tris.HClPh7. 5、IOmM EDTAUOOmM NaCl、0. 2%SDS ；③HBV YVDD變異株細胞表型耐藥分析IO5Cell/孔細胞密度接種12孔板，細胞貼壁後加入核苷類抗病毒藥物，拉米夫定設 0、10uM、100uM、1000uM 4 個濃度梯度，阿德福韋設 0、0· luM、0. 3uM、luM、3uM、IOuM 6 個濃度梯度，每個濃度梯度設復孔，隔天換液，第10天檢測細胞上清HBV-DNA水平，細胞抽提胞內總DNA檢測胞內HBV複製情況。
實施例2測試H印G2. HS204V細胞株如圖I所示，pREP-HBV-YVDD HBV耐藥變異細胞株上清HBsAg、HBeAg和HBV-DNA表達水平，HBsAg水平維持於150-300IU/ml之間，為!fep2· 2. 15細胞15-30倍左右；HBeAg水平150-250PeIU/ml之間，為H印2. 2. 15細胞10-20倍左右，HBV-DNA維持於IO5-IO6之間，略高於Hep2. 2. 15細胞，並隨傳代次數增加無明顯下降。如圖2所示，pREP-HBV-YVDD HBV耐藥變異細胞株耐藥表型分析的結果表明，細胞上清HBV-DNA水平隨LAM濃度梯度升高無明顯下降，隨ADV濃度梯度升高從IO5下降至IO3之下，表明對LAM不敏感而對ADV敏感。如圖3所示，pREP-HBV (L180M+M204V)細胞上清HBV-DNA基因測序結果表明L180M+M204V,與轉染質粒相同。結果顯示，所述的高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株H印G2. HS204V,細胞上清HBV-DNA水平隨LAM濃度梯度升高無明顯下降，隨ADV濃度梯度升高從IO5下降至檢測水平以下，表明對LAM不敏感而對ADV敏感；雜交結果顯示HBV胞內複製水平隨LAM濃度上升無明顯下降，而隨ADV濃度上升逐步下降。
權利要求
1.一種高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株，其特徵在於，所述細胞株為高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株H印G2. HS204V,保藏編號CGMCC No. 4859，分類命名高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株；具有生物學特性能持續表達HBsAg及HBeAg，胞內有HBV複製，並產生HBV顆粒；表達HBsAg及HBeAg高於H印2. 2. 15，細胞上清HBV顆粒水平與H印2. 2. 15基本持平。
2.按權利要求I所述的細胞株，其特徵在於，該細胞對LAM不敏感而對ADV敏感；HBV胞內複製水平隨LAM濃度上升無明顯下降，隨ADV濃度上升逐步下降。
3.權利要求I所述的細胞株的製備方法，其特徵在於，將HBV真核表達質粒pREP-HBV-YVDD轉染H印G2細胞後，通過潮黴素篩選，然後檢測細胞中HBV複製、特異性抗原的表達及病毒顆粒的產生，並與H印2. 2. 15細胞株相比較，最終建成基於H印G2穩定高表達HBV YVDD變異株細胞系，獲得高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株H印G2. HS204V。
4.按權利要求3方法，其特徵在於，所述的HBV真核表達質粒pREP-HBV-YVDD的載體骨架為pREPIO載體。
5.按權利要求3方法，其特徵在於，所述的HBV真核表達質粒pREP-HBV-YVDDHBV通過含cp啟動子及完整HBV前基因組的HBV1. 2倍體的複製子並定點誘變為拉米夫定耐藥基因型L180M+M204V後插入切除RSV啟動子的pREPIO，構建成HBV真核表達質粒pREP-HBV-YVDDo
6.權利要求I的高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株在篩選抗HBV藥物中的用途。
全文摘要
本發明屬微生物動物細胞系領域，涉及基於HepG2穩定高表達HBV YVDD變異株細胞系，具體涉及基於HepG2穩定高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株，尤其涉及高表達耐拉米夫定HBV病毒肝癌細胞株HepG2.HS204V及其製備方法。該細胞株能持續表達HBsAg及HBeAg且高於Hep2.2.15，胞內有HBV複製，並產生HBV顆粒，細胞上清HBV顆粒水平與Hep2.2.15基本持平，該細胞對LAM不敏感而對ADV敏感；HBV胞內複製水平隨LAM濃度上升無明顯下降，隨ADV濃度上升逐步下降。本發明的細胞株可用於篩選抗HBV藥物、研究HBV生物學特點及其與細胞間相互作用的HBV細胞模型。
文檔編號C12N15/85GK102807971SQ20121017502
公開日2012年12月5日 申請日期2012年5月31日 優先權日2011年6月9日
發明者張繼明, 張軼俊 申請人:復旦大學附屬華山醫院