編碼c3hc4家族植物蛋白質的核酸分子和改變植物纖維素和木素含量的方法
2023-08-07 16:23:16
專利名稱：編碼c3hc4家族植物蛋白質的核酸分子和改變植物纖維素和木素含量的方法
技術領域：
本發明涉及植物生物技術領域。更具體地，本發明涉及通過調 節編碼C3HC4蛋白的基因的表達改變纖維素含量。
背景技術：
在高等植物的木材形成過程中，大多數在碳水化合物代謝過程 中產生的葡萄糖被傳遞給纖維素用於次生壁沉積。Djerbi等， Ce〃w/ose 11: 301-12 (2004)。纖維素是由結晶形成微原纖維的直鏈 p-(l ,4)-連接的葡聚糖分子組成的纖維狀聚合物。微原纖維提供纖維 素特有的柔性強度。纖維素在高等植物中是由大的多聚體質膜結合 複合物合成的，這些複合物在微原纖維的末端形成玫瑰花形結構。 Somerville,i ev. CeZ/Dev. 5z'o/. 22: 53-78 (2006)。
纖維素作為紙漿、纖維以及作為合成商業上重要的聚合物的起 點是有價值的。可增加纖維素沉積的改變很可能對木素沉積具有抑 制效應。Hu等，A^wre 5z'o^c/j. 17:808-19 (1999)。木本植物中木素 含量的減少是人們所希望的，因為纖維素的工業生產和木素的化學 去除是昂貴的，並且對環境是一個巨大的挑戰。
纖維素的生物合成途徑在分子水平上了解很少。來自纖維素合 酶(C^SJ)家族的基因和編碼用於N-聚糖合成和加工的蛋白質的基因 已經在大量生物體中分離。Nicol等，五MSO /. 17:5562-76 (1998)。一個大量用於研究木材形成，特別是纖維素合成和沉積的實驗
系統是彎曲樹木，以使得在莖的拉緊側形成應拉木(TW)。 Andersson-Gunneras等，P/a打f / 45: 144-65 (2006)。在桉屬(五wca(yp,w力 和楊屬CPopw/w力的種中，應拉木典型地發生在傾斜的莖的上側，並
且使樹重新定向其軸。應拉木的主要特徵是在其腔中具有特別厚的
膠質次生層(G層)的木質部纖維。這種G層幾乎只含有具有高結晶度 的纖維素孩￡原纖維。D6jardin等，P/aW所o/. 6: 55-64 (2004)。由於應 拉木富含纖維素但是缺乏木素和半纖維素，它可以用來檢測和分析 參與控制向木素、纖維素和半纖維素的碳流的基因。
Andersson-Gunneras等(2006)鑑定了在TW中高表達的與細胞壁 形成有關的基因，例如參與碳水化合物代謝和細胞骨架形成的基因， 以及管家基因和兩種在歐洲山楊(L.)北美顫楊(Michx)雜交種中具有 未知功能的基因。C3HC4-型鋅指(環指)蛋白在TW中顯示差異表達， 但是在該研究或其它研究中沒有數據暗示其在纖維素生物合成中的 作用。
鋅指結構域是結合一個或多個鋅原子的相對較小的蛋白質基 序。它們最初被鑑定為光滑爪蟾(Ze"o/ M /aev/力轉錄因子TFIIIA中 的DNA-結合基序，但是現在被認為結合DNA、 RNA、蛋白質和/或 脂類物質。環指是一種特殊類型的鋅指，有40-60個殘基，結合兩個 鋅原子，且可能參與介導蛋白質-蛋白質相互作用。存在兩種不同的 變體C3HC4-型和C3H2C3-型。C3HC4-型環指基序在許多細胞和病 毒蛋白質中被發現，其中一些已證明在體內和體外都具有泛素E3連 接酶活性。Laity等，CWr. Opz>2, &o/. 11:39-46 (2001)。
鑑於傳統林木育種的困難，例如由於較長的世代周期導致的緩 慢發展，和產生具有理想性狀的植物的困難，基因技術的發展可以 明顯縮短產生植物新品種所需的時間，並且允許在特定樹種中更準 確地靶向被認為是林業和製漿工業所希望的性狀。
發明內容
6一方面，本發明提供一種分離的核酸序列，其包含選自下組的
序列(a) SEQIDNO: 1所示的核酸序列或其互補鏈；(b)編碼SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列的核酸序列；(c)在嚴格條件下能夠與(a) 或(b)的核酸序列雜交的核酸序列，其中所述雜交序列編碼C3HC4多 肽；(d)作為(a)或(b)的核酸序列的等位基因變體或選擇性剪接變體 的核酸；和(e)與(a)或(b)的序列有至少50%、 60%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或更高的序列同一性的核酸序列。
另一方面，本發明提供一種分離的C3HC4蛋白，其選自(a) SEQ IDNO:2所示的多肽；(b)具有與SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列 有至少85%或更高序列同一性的胺基酸序列的多肽；和(c)如(a)或(b)
中定義的多肽的變體。
另一方面，本發明提供一種核酸構建體，其包含與一個或多個 合適的啟動子可操作地連接的分離的C3HC4多核苷酸序列，該啟動 子驅動該C3HC4多核苷酸序列的表達。在一個實施方案中，植物細 胞包含該核酸構建體。在進一步的實施方案中，由該植物細胞產生 轉基因植物，並且該植物與同種的非轉基因植物相比，具有改變的 纖維素和/或木素含量。在再進一步的實施方案中，植物是雙子葉植 物、單子葉植物、棵子植物或闊葉樹。進一步的實施方案包括該轉 基因植物的後代，包括雜種植物。
在另 一方面，本發明提供一種改變植物中的纖維素和/或木素含 量的方法，包括(a)向分離的植物細胞中引入核酸構建體，該核酸 構建體包含與一個或多個合適的啟動子可操作地連接的分離的 C3HC4多核普酸序列，該啟動子驅動該C3HC4多核苷酸序列的表 達；和(b)在促進植物生長的條件下培養所述植物細胞，其中所述植 物超表達C3HC4蛋白，並且與同種的非轉基因植物相比，具有提高 的纖維素含量和/或降低的木素含量。
圖1顯示一組桉樹組織中C3HC4 cDNA的表達概況。由從美洲黑楊CPo; w/^ ^/加We力木質部分離的mRNA克隆直向同源基因。
圖2示意性地顯示了本發明的植物表達質粒載體
pALELLYX-C3HC4，其包含驅動本發明的C3HC4核苦酸序列表達
的形成層/木質部優先的啟動子。
圖3顯示幾種用pALELLYX-C3HC4轉化的轉基因抹系和相應的
對照非轉基因植物的纖維素含量。星號表示統計學顯著較高的平均
纖維素含量值。
圖4顯示用pALELLYX-C3HC4轉化的Tl轉基因植物(6B林系) 的兩種基因型的纖維素含量。星號表示統計學顯著較高的平均纖維 素含量值(P0.05， t-才全-驗)。
的Tl轉基因植物(6B林系)的兩種基因型的木素含量。星號表示統計 學顯著較低的平均木素含量值(P0.05, t-檢驗)。
的T1、爭基因植物(24B抹系)的三種、基因型的纖維素含量。星號表示 統計學顯著較高的平均纖維素含量值(P0.05， t-檢驗)。
的Tl轉基因植物(25B林系)的三種、基因型的纖維素含量。星號表示 統計學顯著較高的平均纖維素含量值(PO.05,t-檢驗)。
發明詳述
本發明涉及遺傳操作的植物，其特徵在於提高的C3HC4蛋白表 達。在這點上，本發明集中於遺傳搡作的植物，該植物超表達包含 C3HC4基因的核酸分子，由此調節所述遺傳操作的植物的纖維素含 量。提高基因的轉錄速率可以導致蛋白質產物增多，從而提高該基 因所參與的代謝過程的速率。
在這點上，本發明人已經確定，超表達C3HC4基因的遺傳操作 的植物顯示提高的纖維素含量。因此，本發明人確定C3HC4蛋白直 接或間接地控制與纖維素合成有關的基因和/或蛋白質。因此，本發明的申請包括但不限於通過提高木本樹木中的纖維 素含量改進造紙過程中的纖維素纖維生產，以及通過提高棉花纖維 中的纖維素含量為紡織品生產改進纖維素纖維的提取。另外，增加 的纖維素沉積可能對木素沉積具有抑制效應。由木本樹木工業生產 纖維素需要在製漿工藝中化學去除木素，這要使用大量的濃縮化學 試劑。為了生產高質量的紙張，需要通過額外的漂白步驟進一步除 去殘餘的木素，該漂白步驟涉及使用非常有害的物質。這整個過程
花費多，並且對環境是一個巨大的挑戰。由於這個原因，預計減少 木本植物(典型地為樹)中的木素含量可減少這些非常昂貴的提取過
程的化學試劑和能量的需要，也應當能夠減少排出物的量，排出物 是一種主要的潛在環境汙染物，不僅難以處理，而且處理的費用很
高。Campbell等，P/""/屍/ ;w'o/. 110: 3-13 (1996)。因此，纖維素生物 合成的基因工程可以提供提高轉基因植物的纖維素質量和產量、同 時減少木素含量的策略。
本說明書中的技術術語符合生物化學、分子生物學和農學中通 常的用法。這種用法和這些技術術語在以下文獻中有詳細說明 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1988), 定期更新；Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (5th ed.)， vol. 1-2， John Wiley & Sons, Inc. (2002); Genome Analysis: A Laboratory Manual, vol. 1-2, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997)。如此處所述的合適的 植物生物學技術進一 步在諸如以下的方法學文獻中詳細說明 Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995)。例如，Innis等， PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)以及 Dieffenbach 和 Dveksler, PCR PRIMER: ALaboratory Manual (2p ed.)， Cold Spring Harbor Laboratory Press (2003)中描述了各種使用PCR的方法。PCR引物對可以通過已知的 技術，例如使用用於該目的的計算才幾程序，如Primer, 0.5版，1991 (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)，由已麼口 的序歹W尋到。侈'H口， Beaucage和Caruthers， r"ra.22: 1859-62 (1981)以及Matteucci和Caruthers,j附.C7^附.6"oc. 103:3185(1981) 中描述了示例性的化學合成核酸的方法。
限制性酶消化、磷酸化、連接和轉化如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)所述進行。除非另外說明，所有用於細菌細胞 生長和維持的試劑和材料都得自 Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wis.)、 DIFCO Laboratories (Detroit, Mich.)、 Invitrogen (Gaithersburg, Md.)或Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.)。
術語"編碼"是指一個基因通過轉錄和翻譯機制給一個細胞提供 信息的過程，從該細胞中 一 系列胺基酸可以裝配為特定的胺基酸序 列，從而產生活性酶。由於遺傳密碼的簡併性，DNA序列中的某些 鹼基變化不改變蛋白質的胺基酸序列。因此可以認為，可以預期涉 及基本上不影響蛋白質的功能特性的編碼C3HC4蛋白的DNA序列 的{奮飾。
在本說明書中，"表達，，表示由基因編碼的蛋白質產物或多肽的 產生。可選擇地或者另外，"表達"表示為了產生多肽，編碼DNA分 子(如結構基因)所經歷的細胞內過程的組合，包括轉錄和翻譯。"超 表達，，是指特定基因序列的表達，其中轉基因生物體中mRNA或多肽 的產量超過了非轉基因生物體中的產量水平。
術語"異源核酸"是指已通過人工努力導入細胞(或細胞的祖先) 中的核酸、DNA或RNA。這種外源核酸可以是在所導入的細胞中天 然發現的序列的拷貝，或其片段。
相反，術語"內源核酸"是指存在於將要基因工程化的植物或生 物體中的核酸、基因、多核香酸、DNA、 RNA、 mRNA或cDNA分子。內源序列對於將要基因工程化的植物或生物體來說是"天然的"， 即，固有的。
術語"同源序列"是指由於共同的祖先和序列保守性而相似的多 核苷酸或多肽序列。
對於本發明，"旁系同源物(paralog)"是通過基因複製產生的同源 物。它們代表在生物體內複製然後趨異的來源於共同祖先基因的基 因。"直向同源物(ortholog)"是通過物種形成產生的同源物。它們代 表由於相關的生物體趨異而趨異的來源於共同祖先的基因。參見 Brinkman和Leipe， BIOINFORMATICS, A PRACTICAL GUIDE TO THE ANALYSIS OF GENES AND PROTEINS 323-58, Wiley-Interscience (2001)。
術語"功能同源物"是指由於共同的祖先和序列保守性而相似， 並且在催化、細胞或生物體水平上具有相同或相似功能的多核苷酸 或多肽序列。
C3HC4序列
生物體代謝和發育所需的許多生物學過程由基因家族控制。 C3HC4蛋白就是這樣，它屬於一個包括許多基因的基因家族。 C3HC4-結構域蛋白質屬於所謂的"鋅指"蛋白質家族，其特徵在於"環 指"結構域，該結構域包括8個由共有基序C3HC4形成的金屬配體。 環指結構域通常以獨特的橫拉條(cross brace)排列結合兩個鋅離子， 並且基本上可以被認為是一個蛋白質相互作用結構域。Jackson等, 3>6"& Ce〃歷o/. 10: 429-39 (2000)。
環指蛋白與從轉錄和翻譯調節到發育和定向蛋白質水解的許多 不同的生物學過程有關。因此，其它C3HC4家族成員也將提高纖維 素含量。SEQIDNO:l中顯示的一個示例性的C3HC4基因是從白楊 中分離的。
預計來自任一編碼環指基因的生物體的、編碼具有類似於 C3HC4基因翻譯產物的結構和生物學性質的蛋白質的任一基因，對
ii影響相同。這些基因可以通過序列對比進行鑑定和功能注釋。有見 識的分子生物學家可以藉助於常規方法，例如使用合適的雜交探針
篩查cDNA或基因組文庫，或者檢索公共資料庫如NCBI的Genbank, 容易地鑑定與C3HC4序列有關的序列。也可以藉助於簡併寡核苷酸， 利用已知的基於PCR的技術分離同源序列。
也可以使用允許利用各種已知技術通過序列對比鑑定基因的計 算程序。例如，Innis等，PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)和 Genome Analysis: A Laboratory Manual,第 1 巻和第 2 巻,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997)描述了這方面的技術的例子。
在與本發明相關的研究中，本發明人在種間雜種巨尾桉雜交種 (五.gra"&、 x^0/ /^//")植物中誘導了 TW。因此鑑定了大量在TW 和正常木中差異表達的基因。在應拉木中表達發生改變的基因中， 確定有許多編碼在桉樹TW中高表達的C3HC4-型鋅指家族的成員。
由於C 3 H C 4蛋白家族的成員在T W (主要由高度結晶的纖維素組 成的組織)中高表達，且C3HC4成員似乎與維管分生組織和次生生長 的控制有關，因此可以預期用包含編碼C3HC4家族成員的分子的核 酸構建體對木本樹木進行基因轉化將會改變維管模式及纖維素合成 和沉積。因此，當C3HC4基因超表達時將發生纖維素合成和沉積的 增加。相反，當C3HC4基因下調時，本發明人預期纖維素合成將減 少。由於纖維素合成和沉積的改變通常導致木素合成和沉積的改變， 參見Hu等，A^z^e Ao^c/j 17: 808-19 (1999)，本發明人同樣理解， 提高纖維素合成和沉積將降低木本樹木的木素含量。如果纖維素合 成減少，則出現相反的情況。
在本發明的上下文中， 一個序列可以通過如上所述的方法鑑定， 並且由此功能注釋為屬於C3HC4家族。在本說明書中，短語"C3HC4 多核苷酸序列"和"C3HC4核酸序列"表示任何編碼C3HC4多肽的核 酸、基因、多核苷酸、DNA、 RNA、 mRNA、 cDNA分子，當其超表
12達時導致植物的纖維素含量提高和/或木素含量降低。短語"C3HC4 多核苷酸序列"和"C3HC4核酸序列"也包括任何具有在嚴格條件下 能夠與此處所述的任一序列雜交的核普酸序列並且編碼C3HC4多肽 的核酸分子，當其超表達時導致植物的纖維素含量提高和/或木素含 量降低。該短語也表示與SEQ ID NO:l交叉雜交的序列，優選地具 有與SEQ ID NO: 1至少40%、更優選至少60%、甚至更優選至少 80%、最優選至少90%的同源性或同一性的序列。
本發明的核苷酸序列也可以編碼與SEQ ID NO: 2所示的預測基 因產物同源的蛋白質。
短語"C3HC4多核香酸序列"和"C3HC4核酸序列"也表示那些由 SEQ ID NO: 1的片段或變體代表的序列，它們具有與SEQ ID NO: 1 至少50%、優選至少60%、更優選至少70%、甚至更優選至少80%、 最優選至少90%的同一性，並且編碼C3HC4多肽，當其超表達時導 致植物的纖維素含量提高和/或木素含量降低。基於同樣的理由，本 發明的核苷酸序列包括那些編碼包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列或 與SEQ ID NO: 2至少50%、優選至少60%、更優選至少70%、甚至 更優選至少80%、最優選至少90%相同的胺基酸序列的多肽的序列， 其超表達導致植物的纖維素含量提高和/或木素含量降低。
短語"嚴格條件"在此表示本領域中熟悉的參數。當單鏈多核苷 酸基於多種良好表徵的物理化學力如氫鍵、溶劑排斥和鹼基堆積而 結合時，它們發生雜交。雜交的嚴格性反映了所涉及的核酸的序列 同一性的程度，因此嚴格性越高，兩條多核苷酸鏈越相似。嚴格性 受多種因素的影響，包括雜交和洗滌溶液的溫度、鹽濃度和組成、 有機和無機添加劑、溶劑等以及孵育(和次數)。本領域普通技術人員 通過改變雜交反應和洗滌過程中的溫度、雜交反應和洗滌過程中的 鹽濃度等，能夠容易地選擇這些條件。
印跡中在濾膜上的雜交，"嚴格"雜交條件的例子是在限定的離子強 度和pH下，比特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低大約5°C至20°C的溫度。Tm是在限定的離乎強度和pH下，50%的靶序列與完全匹配的 探針雜交時的溫度。在嚴格條件下雜交的核酸分子一般基於整個 cDNA或選擇的部分與探針雜交。更優選地，此處的"嚴格條件"是指 本領域熟悉的參數，例如在3.5xSSC、 lxDenhardt's溶液、25mM磷 酸鈉緩衝液(pH7.0)、0.50/。 SDS和2mMEDTA中65°C雜交18小時， 然後於65。C在2xSSC、 0.1%SDS中洗滌濾膜4次，各20分鐘，且 為了獲得更高的嚴格性，在0.5xSSC、 0.1% SDS或0.3xSSC和0.1% SDS中進行最多20分鐘的最後一次洗滌，為了獲得甚至更高的嚴格 性，在O.lxSSC、 0.P/。SDS中洗滌。可以用其它條件代替，只要嚴 格性程度基本上等同於此處使用0.5xSSC的最後洗滌提供的程度。
需要指出，本說明書中的短語"C3HC4核酸序列"是指具有在嚴 格條件下能夠與此處公升的序列雜交的核苷酸序列的任何核酸分 子，其編碼與具有此處SEQIDN0:2公開的胺基酸序列的蛋白質等 同的多肽。該短語也包括與SEQ ID NO:l交叉雜交的序列，優選地 具有與SEQ ID NO: 1至少55%、優選地至少65%、更優選地至少 75%、甚至更優選地至少85%、最優選地至少90%的同源性或同一 性。本發明的核苷酸序列可以編碼與SEQIDNO: 2的預測基因產物 同源的蛋白質。
進一步的實施方案包括包含具有一個或多個缺失、置換、插入 或添加的鹼基的上述任何鹼基序列，並且編碼與SEQ ID NO: 2編碼 的蛋白質同源的多肽的任何核酸分子。這些核酸分子包括SEQ ID NO: 1的等位基因變體和選擇性剪接變體。
相應地，術語"變體"是與特定基因或蛋白質的標準的或者給定 的核苷酸或胺基酸序列偏離的核苷酸或胺基酸序列。變體可以具有 "保守性"改變，其中置換的胺基酸具有相似的結構或化學性質，例 如，用異亮氨酸替換亮氨酸。變體可以具有"非保守性"改變，例如， 用色氨酸替換甘氨酸。類似的微小變化也可以包括胺基酸缺失或插 入，或缺失和插入。確定哪些胺基酸殘基可以被置換、插入或刪除 的指導可以使用本領域公知的電腦程式來獲得，例如Vector NTISuite (InforMax,MD)軟體。"變體"也可以指"改組的基因"，例如，如 美國專利6,506,603、 6,132,970、 6,165,793和6,117,679所述。此處提到的"具有一個或多個缺失、置換、插入或添加的i鹹基的 鹼基序列，，是本領域普通技術人員公知的，甚至當通常具有生理活性 的蛋白質的胺基酸序列具有一個或多個置換、缺失、插入或添加的 胺基酸時，也保留其生理活性。具有這些修飾並且編碼C3HC4蛋白 的核苷酸序列包括在本發明的範圍內。例如，可以刪除polyA尾或 5'-或3'-端非翻譯區，並且可以刪除鹼基到刪除胺基酸的程度。鹼基 也可以被置換，只要不導致移碼。也可以"添力p"鹼基到添加胺基酸 的程度。但是，重要的是這些修飾不導致C3HC4蛋白功能的喪失。 這些修飾的核酸可以通過以下方法獲得，例如，修飾本發明的鹼基 序列，使得特定位點的胺基酸通過定點誘變被置換、刪除、插入或 添加。參見Zoller和Smith, 7Vwc/dc乂c/di 仏10: 6487-500 (1982)。應當理解，胺基酸和核酸序列可以包括額外的殘基，例如額外 的N-或C-末端胺基酸或5'或3'序列。只要得到的序列編碼保持相同 或相當的生物蛋白質活性的多肽，這些添加就是合適的。本發明提供編碼C3HC4蛋白的核苷酸序列。該序列可以來源於 cDNA,例如美洲黑楊cDNA，或者來源於基因組DNA。 一個示例性 的cDNA克隆如以上SEQ ID NO: 1所示，其編碼C3HC4蛋白。根 據本發明的一個方面，通過控制C3HC4蛋白的表達，改變植物組織 (例如木質部或棉籽的纖維細胞)中的纖維素含量。因此，植物細胞或 整個植物(例如)用C3HC4蛋白編碼序列基因工程化，該編碼序列例 如來源於美洲黑楊，在纖維細胞中優先表達，並且導致纖維素合成 和沉積增力口。另外，本發明提供包含選自下組的核苷酸序列的核酸分子(a) SEQ ID No: 1或其部分或其互補序列；(b)在相當於0.1X SSC至l.OX SSC、 0.1 % SDS、 50-65。C的洗滌嚴格性下與所述(a)的核苷酸序列 雜交的核香酸序列；(c)編碼具有與(a)的核苷酸序列編碼的蛋白質相 同的胺基酸序列的蛋白質，但是根據遺傳密碼簡併性而簡併的核苷酸序列；和(d)編碼與(b)的核苷酸序列所編碼的相同的胺基酸序列， 但是根據遺傳密碼簡併性而簡併的核苷酸序列。本發明的 一個進一 步的特徵是本發明的核酸分子編碼的蛋白質 和多肽，其例子包括但不限於具有由SEQIDNO:2組成的胺基酸序 列的多肽。優選地，本發明的多肽具有含有與上述序列至少60%相 同的區域的胺基酸序列。相對於上述序列具有大於70%的同一性是 優選的，而大於80%、 90%或甚至95%的同一性是最優選的。本發明的核酸分子可以"乾淨地"使用，或者優選地在表達載體 構建體中使用，用於導入細胞，例如植物細胞中。可以採用熟練技 術人員公知的標準分子生物學技術。核酸構建體重組核酸構建體可以用標準:汰術製備。例如，用於轉錄的核苷 酸序列可以通過用限制性內切酶處理含有所述序列的載體以切下適 當的片段而獲得。用於轉錄的核苦酸序列也可以通過退火和連接合 成寡核苷酸或者通過在聚合酶鏈反應(PCR)中使用合成寡核苷酸在 每 一 末端得到合適的限制酶切位點而產生。然後將核苷酸序列克隆 到含有諸如上遊啟動子和下遊終止子序列的適當調節元件的載體 中。植物轉化載體一般包括一個或多個處於5'和3'調節序列的轉錄 控制下的克隆的植物編碼序列(基因組或cDNA)以及選擇性標記。這 樣的植物轉化載體一般也含有啟動子、轉錄起始位點、RNA加工信 號(如剪接信號序列)、轉錄終止位點和/或多腺苷酸化信號。也可以 存在增強子和靶向序列。可用於表達C3HC4蛋白序列的合適的組成型植物啟動子包括但 不限於花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子、玉米和楊樹聚泛素啟動 子，它們在大多數植物組織中引起組成型的、高水平的表達(參見， 例如，WO 2007/00611,美國專利5,510，474; Odell等，7V^w", 1985, 313: 810-812);胭脂氨酸合酶啟動子(An等，1988， P/aW P/o^'o/. 88: 547-552);來自玄參花葉病毒的FMV啟動子(美國專利5,378,619);和章魚氛酸合酶啟動子(Fromm等，1989, P/a"f Ce〃 1: 977-984)。載體也可以含有終止序列，終止序列位於本發明的核酸分子的 下遊，使得mRNA的轉錄終止，並且添加polyA序列。終止子的例 子有花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S終止子和胭脂氨酸合酶基因(NOS) 終止子。表達載體也可以含有選擇標記，通過該選擇標記可以在培養中 鑑別出被轉化的細胞。標記可以結合異源核酸分子，即與啟動子可 操作地連接的基因。此處使用的"標記"是指編碼一種性狀或一種表 型的基因，該性狀或表型允許選擇或篩選含有該標記的植物或細胞。 在植物中，例如，標記基因可編碼抗生素或除草劑抗性。這允許從 未被轉化或轉染的細胞中選擇出轉化細胞。合適的選擇性標記的例子包括腺苦脫氨酶、二氫葉酸還原酶、 潮黴素B磷酸轉移酶、胸苷激酶、黃嘌呤-鳥噤呤磷酸核糖基轉移酶、 草甘膦和草丁膦抗性和氨基-糖苷3'-0-磷酸轉移酶(卡那黴素、新黴 素和G418抗性)。這些標記可以包^l舌對G418、潮黴素、博來黴素、 卡那黴素和慶大黴素的抗性。該構建體也可以含有選擇性標記基因 萬ar， 賦予對除草劑膦絲菌素類似物如草丁膦銨的抗性。 Thompson等，五M50/. 6: 2519-23 (1987)。其它合適的選擇標記也是 已知的。也可以使用可視標記，例如綠色螢光蛋白(GFP)。基於細胞分裂 的控制來鑑別或選擇轉化植物的方法也已描述。參見John和Van Mellaert, WO 2000/052168和Fabijansk等，WO 2001/059086。也可以包含細菌或病毒來源的複製序列，以允許載體在細菌或 噬菌體宿主中克隆。優選地，使用廣宿主範圍的原核生物複製起點。 可以包含用於細菌的選擇性標記，以允許篩選帶有所需構建體的細 菌細胞。合適的原核生物選擇性標記也包括對抗生素如卡那黴素或 四環素的抗性。本領域中^^知，載體中也可以存在編碼另外的功能的其它核酸 序列。例如，當土壤桿菌是宿主時，可以包含T-DNA序列，以利於17後續向植物染色體中的轉移和整合。根據本發明的進一步的方面，提供了包含如上所述的處於在植物中工作的轉錄起始區的控制下的C3HC4 DNA序列的核酸構建體， 使得該構建體可以在植物細胞中產生RNA。優選地，該轉錄起始區 是器官或組織特異性的^i物啟動子的一部分，如WO 2005/096805 7> 開申請中所述的任一種。更優選地，當組織特異性啟動子與C3HC4 DNA序列可I喿作地連接時，該啟動子確保在特定細胞類型、組織或 器官中轉錄，使得纖維素合成可以特異性地定向，而不影響其它植 物功能。本發明的轉基因植物的特徵可以是提高的纖維素含量和/或降低 的木素含量。基因工程植物中提高的纖維素含量優選地通過發生纖 維素沉積的植物組織中C3HC4表達的提高來實現。因此，在一個優 選實施方案中，本發明的轉基因植物含有一種核酸構建體，該核酸 構建體包含與編碼C3HC4蛋白的基因可操作地連接的形成層/木質 部優先的啟動子，如以上引用的'805公開國際申請中所述的那些， 從而導致C3i/0/基因在植物維管系統中的表達提高，這又實現了這 些組織中纖維素合成和沉積的增加，而不影響其它植物功能。如上所述，植物部分的纖維素含量和相關特性可以通過用本發 明的核酸構建體進行基因工程來改變。本發明也提供了含有這些構 建體或用這些構建體基因工程化的植物細胞、由這些細胞產生的 C3HC4基因表達發生改變的植物，和這些植物的種子。本發明的核酸構建體可以包含最小長度的鹼基序列，以產生 mRNA,並因此產生保留C3HC4功能的多肽。為了方便起見，通常 發現使用長度為大約100至大約1000個鹼基的序列是適當的，但是 鹼基序列的長度沒有理論上限。這些構建體的製備在下面更詳細地 描述。本發明的分離的核酸分子可以整合到核酸構建體內，使得它們 與啟動子可操作地連接。優選地，啟動子是已知在植物細胞中起作 用的啟動子，更優選地在諸如根、苗、葉、木質部等特定植物器官或組織的細胞中起作用。本發明的核酸分子可以與組成型或誘導型 啟動子可操作地連接。或者，本發明的核酸分子可以與將下遊基因 的表達優選地或特異性地定向於植物器官或組織(如木質部和形成層) 的啟動子可操作地連接。另外，維管系統特異性的、木質部特異性的或木質部優先的啟 動子可以用於促進本發明的核酸分子特別在維管組織、特別是木質 部組織中的表達。使用組成型啟動子通常影響在植物的所有部分中 的蛋白質水平和功能，而使用組織優先的啟動子允許將改變的基因 表達定向於特定的植物部分，導致更易控制的表型。因此，在應用 本發明時，發現可以方便地使用將在木質部發育過程中引起表達的 啟動子，由此本發明的蛋白質將只在此處公開的應用需要其作用的 器官或組織或細胞類型中過量產生。可以使用的維管組織特異性的、 木質部特異性的、維管組織優先的和木質部優先的啟動子包括但不限於上述'805公布國際申請中描述的木質部優先的香豆酸-4-羥化酶 (C4H)基因啟動子、木質部優先的微管蛋白(TUB)基因啟動子和木質 部優先的脂質轉移蛋白(LTP)基因啟動子。所選擇的特定啟動子應當 能夠引起足夠的表達，以使本發明的蛋白質超表達，以改變木質部 的大小或改變物木質部的化學組成，或這些效應的組合。儘管基因表達速率主要由啟動子調節，但是也可以通過鑑定和 使用增強子序列，例如基因的內含子部分，來實現表達的提高，增 強子序列以獨立的方式定向提高位置靠近的基因的表達水平。對於 植物，在基因構建體中啟動子和基因編碼序列之間的位置處包含某 些內含子將導致mRNA和蛋白質積累增加。已知可提高植物中表達 的內含子在玉米基因中已經鑑定，例如，hsp70、 tubAl、 Adhl、 Shl、 UbH (Brown和Santino,美國專利5,424,412和5,859,347; Jeon等， 2000, P/a"《屍一》/. 123: 1005-1014; Callis等,1987， Ge廳Dev. 1: 1183-1200; Vasil等,1989, 屍一Wo/. 91: 1575-1579),並且在雙子 葉植物基因中已經鑑定，例如來自矮牽牛的rbcS (Dean等，1989, P/""f CW/ 1: 201-208)、來自馬鈴薯的ST-LSl (Leon等,1991,屍一o/ 95: 968-972)和t/鄉(Norris等，1993,屍to Mo/.所o/. 21: 895-906)和來自擬南芥(Jras Aa"aw")的iMJ7 (Rose和Last, 1997,P/aW, 11: 455-464)。另外，重組表達載體包含在植物細胞中起作用的啟動子、作為 上述核苷酸序列的同源物的核酸分子，該核酸分子編碼其胺基酸序 列含有與上述SEQ ID NO: 2所示的序列至少60%相同的區域的多 肽。更優選地，該核酸分子編碼一種多肽，該多肽的胺基酸序列含 有與上述序列至少70%、 80%或者甚至90%相同的區域。本發明的構建體可以用來利用任何合適的技術基因工程化任何 植物。單子葉和雙子葉#皮子才直物或棵子植物細胞都可以用本領域/> 知的各種方法基因工程化。Klein等，所o化c/mo/ogy 4: 583-90 (1993); Bechtold等，C.兄^ca《i^r^ 316: 1194-99 (1993); Bent等，Mo/ GWz. 204: 383-96 (1986); Paszowski等，五MS(9/ 3: 2717-2722(1984); Sagi等，P/耐C"/~ 13: 262-66 (1994)。用於基因工程的植物本發明 一 般地涉及表達編碼此處公開的新型多肽組成的基因或 基因區段的轉基因植物。此處使用的術語"轉基因植物"是指已經整 合有核酸序列的植物，該核酸序列包括但不限於正常情況下也許不 存在的基因、正常情況下不轉錄為RNA或翻譯為蛋白質("表達")的 核酸序列，或者希望導入植物中的其它任何基因或核酸序列，例如 正常情況下可能存在於植物中但是希望基因工程化或改變其表達的 基因。可以設想，在某些情況下本發明的轉基因植物的基因組將通 過穩定地導入轉基因而增加。但是在另外一些情況下，導入的基因 或序列將代替內源序列。可以導入的優選基因包括但不限於來自美 洲黑楊的C3HC4核酸序列。可以按照本發明工程化的植物包括但不限於如下的樹木桉屬 的種(白桉CE. a/6a)、白花桉(五.a/^w力，杏仁桉(五.am少g^〃"a)、五.、 圓葉桉(五.6m7e;;awa)、 6a〃adom.ews/s、 雙月永桉(五.206/coi^flfa)、 葡萄桉(五.Z o^yozWe力、鄉豆iE桉(五.6n2c/^awdn2)、淨曷桉(五. Z ra肌'fl"G)、 短柱按(五.6rev"(y/z》、布羅韋按(五.Z rocAw—)、 純蓋赤 桉(五.cflima/dw/e"^s7、) 、 ceracea、 大花序按(jE1. c/oez/awa)、 聚果才姿(五. coccz/en3)、 異心葉桉(五.cordato)、 角蕾桉(E, conw^3)、 五.coW/cosa、 常才安(五.cre6nat)、五.croq/7wgo/ew^51、五.cwr^s7'z'、山鬥務(五.c/a/rjv附i^eawa)、 剝桉(五.deg7wpto)、 大鬥姿(五.c/e/ego^e/w^)、 五.t/e//ca^ 、 卡瑞桉(五. iizVerWco/orh五.(^vens7/0/ia、五.dz'ves、五.t/o/Zc/zoc<2rp 2、五.t/wwc/^/in>/>/i/ofa 、五.ewt/e5moz'des、 /a/cafa、五.gamop/^〃a、五.g/awciwa、 藍桉(五.g/o6w一、雙脈藍桉(五.g/o6w/ws Z /面加a)、藍桉原種(五.g7o6w/ws sw65p. g/o6w/ws)、 go打gy/ocarpa、 巨桉(五.grcmcf^)、 巨 尾桉雜交種(五.graw6^51 x wn / /^〃a)、五.gwz.(foy/e" 西達才姿(五.gwww")、 Ziowseawa、五.j'acfcso打"、/awsc/o"vv打ea打a、 /a"w'打e打s^s、 五./ewcoj!7/j/m'a、 白蘚葉桉(五./ewcox少/ow)、 五./oc^yen'、 /wcoy"、 直 片幹藍桉(五.wcnWe"")、邊糹彖桉(五.margz'""^2)、五.megaca a、蜜p未4妾(五. me〃z'0(ion3)、 五.w/c/we/z'a"a 、'卜巾冒桉(五.mz'crc>cc>r>\y) 、 'J、套桉(五. wz'cro^eca)、糹f"孝力糹f皮桉(五.mwe〃en.awa)、亮果4耍(五.w"ews)、五.wZ"da、 在牛葉桉(五.oZ /Z《i^)、五.06^s7y ora、西方桉(五.occzWew^z/z'51)、五.op"ma、 卵葉桉(五.ovato)、五./ ac/j;;/7/^〃a、雪桉(￡. /7aMcz/7ora)、粗皮桉(￡. / e//"a)、 穿口十桉(五./ ern>zz'aw")、五.； edo/a/^s1、子單丸桉(五.； 〃w/an、)、 五./ ^ en'^;、 闊葉桉(五.p/a/^/ /y^/a)、 多花桉(五./ o(yaw^emas1)、 五. /popw/wea、 /7re^57'awa 、五./wewfifog7o6w/us1、 pw/c/ze〃<3 、五.n^(iz'a^3、 五.na^Za^3 sw65^. n2c/Za^a!、王桉(五.廠eg za/15)、五.n'5^/ow"、五.n 6eWi"ow"、 五.rodw""'、河紅桉(五.n/6/c/a)、赤褐桉(五.n^^7'"ow)、柳葉桉(五. sa/Zgwa^ 糹工皮才姿(五.sa/m0"0;7a/0&)、五.sco; an'a、 4艮頂白蠟桉(五. 5z'eZ en〕、五.spo^Aw/a^3 、五.s^j;en'、五.^stoa化z'、五.^"M/pe51、五.&""7>0!附&、 糹田葉桉(五.^Wc&)、五.脅，亂達爾文纖皮桉(五.敏odo齒)、 五.&'w<ia/z-ae、五.for《wa,a 、 wmZ ra、尾p十才耍(五.w廠o/p/ 少〃a)、五.vemZccwa、 多衝支桉(五.W m'"a/&)、 五.wa"cZoo、 韋i荅桉(五.weto廠ews&)、五.w〃fo"、五."vW〃^s7'Z swZ 5^./a/cz/orm&、五.swZ 51/7. vW///^/、五.woodwani/0, 楊屬的種(銀白楊(屍.fl/Z fl)、銀白楊大齒白楊雜交種CP. g/6a jc屍. gra"^flfew/a^z)、 4艮白才為歐洲山才為雜交種(屍.a/6axi3. ^emw/a)、 4艮白才為 歐洲山楊雜交種(變種)(屍.a/6" x屍.f謂w/a美洲山楊雜交種(i3. a/Z a義戶."emw/ozWe力、香月旨才為CP. 6a/sa m/en2)、 毛果香月旨才為CP. 6aAs^mz/en3 swZ^;7. ^7'cAocfl/7 fl)、 毛果香月旨才為美洲黑牙勿 雜叉種CP. 6"/sa附ii/^廠a s"Z^/7. ^7'c/ ocarpa jc i3. de/Zoz'(is)、糹彖毛4為(i3. cz7/a&)、美洲黑楊(屍.胡楊(屍.ew; /zra"ca)、歐美黑楊(屍. ewn2wen'cawa)、雜交實貞衝為(屍.A:""A:am/eww、)、大p十片為(i3. /aw.ocar/ a)、 苦 楊(屍./awn/o//a)、馬氏楊(屍.ma;a'mowz'czz'0、毛果馬氏楊香脂楊雜交 種(屍.m"xz.movw'cz" x屍.Z a/samz/erfl swZwp, frz.c/zocflTpa)、，繁、才勿(屍. m'gra)、西氏才勿大齒白才為雜交種(屍.We6oW/Z x屍.gn3wAWewto^0 、甜才勿 (屍.swaveo/ew"、川szec/zwam'ca)、毛白fomewtos"")、區欠洲山 楊(屍.^"emw/a)、 歐洲山楊北美顫楊雜交種(屍./"mw/a x屍. ^emw/o/(iM)、北美顫楊CP. ^-eww/ozWe51)、才爭楊(jP. wz7sow")、力口拿大楊 (P. Canadensis)、、真^/(i3. ;^mw""e is7、)), 木〉類3口火火巨木》(i^wws ^;ec/a)、 溼i也+〉(屍z'ww51 e〃z.o&7)、 美國黃(i^'打ws ; ow(ien^")、 小幹+〉 (i^'wws co自他)和輻射松(/^wtw ra^z《a)，花旗松(屍"W(io加g^ ,wz^")，美 國西部4失杉(加拿大4失杉(2^ga Oma^ww\s0), 北美雲杉(屍&ea g7flwca), 紅杉(5e《woZa wm/7wW"/w), 真杉(true fir)如4艮杉(JZ z'e51 ama&7&)和香脂;令杉04Z^M 6a/^mea),及雪爭》類:^大側柏(北美喬柏 (77my'a / /Zca^))牙口黃扁^白(CAamaec少/ an、 woo汰(^ew^s7V)。本發明還涉及產纖維植物的修飾，如棉花(棉屬的種(G^W^wm spp.))、 亞麻(Ziwwm wwYa/Z^s^z'mwm)、 d、蕁麻(異才朱蕁麻(C/r&ca c^oz'c"))、 蛇麻(/Zwmw/1^ /wpw/i )、椴樹類(歐洲小葉椴(77"a conia&)、歐洲都殳(r.薴麻(5oe/zmen'a w&ea)、 才者(Srowssowe(ya papyn/era), #斤西蘭麻 (jP/zomn'讓^wax)、 羅布麻(磁麻(J/ oc"wm ca朋"6/m/m》、秀尾屬的 種(道氏秀尾(/. c/owg/osr'a打a)、 / macnwip/fOM禾口 /./7wni3^)、專'L草類(馬利筋屬的種(^c/e/ ^^ecz'M))、菠蘿、香蕉和其它才直物。還包括飼衝+ 作物，如紫花苜蓿、黑麥草、羊茅和三葉草。在本說明書中，"植物"概括地表示任何可以被遺傳操作的含有 纖維素的植物材料，包括但不限於分化的或未分化的植物細胞、原 生質體、完整的植物、植物組織和植物器官，以及才直物的任何部分， 例如葉、莖、根、芽、塊莖、果實、根莖等。在本說明書中，"轉基因植物"是指已整合有核酸序列的植物， 該核酸序列包括但不限於正常情況下不存在於'宿主植物基因組中的 基因，正常情況下不轉錄為RNA或翻譯為蛋白質的核酸序列，或其 它任何希望導入野生型植物中的基因或核酸序列，例如正常情況下 可能存在於野生型植物中但是希望基因工程化或希望改變其表達的 基因。"轉基因植物"類別包括原代轉化體和例如，通過標準基因漸 滲或另外一種育種程序而在其譜系中包括轉化體的植物。相反，沒 有進行遺傳操作的植物是對照植物，被稱為"非轉基因"植物。非轉 基因植物可以是其基因組未通過導入包含本發明的多核苷酸序列或 其片段的構建體而修飾的植物。也可以是由培養的細胞或組織再生 的，而沒有通過導入包含本發明的多核苷酸序列的構建體事先修飾 的植物，或者可以包括由轉基因植物自花受精產生的純合隱性後代 (即，不具有任何轉基因拷貝)。此處使用的"雜種植物"是指由兩個親 本植物之間雜交獲得的植物或其部分，其中一個親本是本發明的基 因工程植物。這可以通過(例如)有性繁殖自然發生，或者可以通過(例 如)體外核融合人工發生。本發明的轉基因植物含有如此處所述的在植物中有效啟動子的 控制下表達的核酸序列，使得該植物的特徵為，例如，降低的木素 含量和纖維素含量提高。植物基因工程方法可以使用合適的工程才支術將本發明的構建體導入任何植物細胞 中。單子葉和雙子葉被子植物或棵子植物細胞都可以用本領域所知的各種方法基因工程化。例如，參見Klein等，1993, AWec/mo/ogy 4: 583-590; Bechtold等，1993, C.兄」ca乂 Pan、 316: 1194-1199; Koncz和Schell， 1986， Mo/, G匿A 204: 383-396; Paszkowski等, 1984,五MBO 3: 2717-2722; Sagi等，1994， P/aW CW/ 13: 262-266。例如，可以按照Nagel等，1990, MZcro&o/丄e〃 67: 325所述，使 用土壤桿菌屬的種，如根癌土壤桿菌(A ^me/ac^"力和髮根土壤桿菌r/^zogew^)。簡言之，土i裡桿菌可以用植物表達載體轉化，例如 通過電穿孔轉化，之後通過例如公知的葉盤法(leaf-disk method)將土 壤桿菌引入植物細胞中。其它實現這一目的方法包括但不限於用根瘤菌屬(i /^o&wm)、 中華根瘤菌屬(5V"oW^'zoZ)^m)或中慢生根瘤菌屬(M^oW^o^"m)轉 化(Broothaerts等，2005, A^w廠e 433: 629-633)、電穿孔、粒子槍轟擊、 磷酸鈣沉澱和聚乙二醇融合、向萌芽的花粉粒中轉移、直接轉化(Lorz 等，1985,^1"/. G^zW. 199: 179-82),及其它已知的方法。如果使用選 擇性標記，如卡那黴素抗性，則更易於確定哪些細胞被成功轉化。已知以上所述的土壤桿菌轉化方法可用於轉化雙子葉植物。另 外，de la Pena等，1987,淘訓325: 274-76; Rhodes等，1988, 5We匿 240: 204-207;和Shimamoto等，1989,淑匿328: 274-76公開了使用 土i裡桿菌轉化穀類單子葉才直物。另外參見Bechtold和Pelletier， 1998, MeAoAMo/. 5"/. 82: 259-66,其證明了真空滲入在土壤桿菌介導的 轉化中的應用。可以^r測特定細胞中蛋白質、多肽或核酸分子的存在，以確定， 例如，細胞是否已被成功地基因工程化。進行這種試驗的能力是公 知的，在此不需贅述。定量纖維素/木素含量在此用來描述本發明植物的短語"提高的纖維素含量"是指與野 生型植物中的纖維素量相比，本發明植物中纖維素量的定量增加。纖維素的定量增加可以通過幾種方法測定，例如在磨碎的莖木中多衝唐酸7jc解後基於總衝唐進;f亍定量。Chiang和Sarkanen,Tec/mo/, 17: 217-26 (1983); Davis,『ooc/ C/z亂rec/mo/ 18: 235-52(1988)。本發明的工程植物中的纖維素含量可以升高野生型植物纖維素 含量的大約30%至大約50%、優選大約25%至大約45%，甚至更優 選大約20%至大約40%的水平。本發明植物的最優選的實施方案具 有為野生型纖維素含量的大約10%至大約15%的纖維素含量。短語"減少的木素含量"和"降低的木素含量"在此用來描述本發 明的植物的 一個方面，分別是指植物中的木素量比野生型或非轉化 植物中的木素量定量減少。木素的定量減少可以通過Klason木素測 定(Kirk等，Me&o^7z五nzj;mo/. 161: 87-101 (1988))和乙醯溴木素測定 (Iiyama等，『ood rec/mo/. 22: 271-80 (1988))說明的常規方法測 定。本發明的工程植物中的木素含量可以降至野生型植物的木素含 量的大約5%至大約卯％，優選地大約10%至大約75%,更優選地大 約15%至大約65%乾重的水平。本發明的植物的最優選的實施方案 具有野生型木素含量的大約20%至大約60%的木素含量。以下提供了用於獲得美洲黑楊C3HC4基因的方法的實施例，並 且下面給出了使用土壤桿菌導入靶基因從而產生植物轉化體的技 術。這些只是實施例，而不是對本發明的限制。實施例1在應拉木、應力木和正常木中優先表達的基因的表達概況 如Huang和Madan， Gewomei 仏9: 868-77 (1999)(引入作為參考) 所述，利用CAP3程序，將來自巨尾桉雜交種(五wca/j;7a^ gram/^ x 五wca(y/7,w wrop/y;〃a)的表達序列標籤(ESTs)聚類。從代表以下組織的 文庫中獲得一組53,522個EST:來自野外生長的高6.5m的桉樹(巨 尾桉雜交種)的應拉木、應力木和正常木。在這樣產生的簇組中搜索至少由90%的來自代表應拉木組織的文庫的EST讀數組成的簇。另 外，在簇組中搜索由至少3個來自應拉木組織的EST讀數和優選地 少於兩個來自其它文庫的讀數組成的簇。這樣選擇的一個簇，由14個來自應拉木cDNA文庫的EST讀數 和0個來自其它文庫(應力木和正常木)的讀數組成，代表C3HC4蛋 白家族的成員(圖1)。然後使用Blast-X算法，採用<=le-5的截止e-值(參見Altschul 等，A^c/^c ^c^y Z5.' 3389-402 (1997)),將使用這些參數選擇的 簇與來自專門楊樹資料庫的序列進行比對，該資料庫由從JGI毛果楊 (Popw/tw WcAoca/7 a) vl.O 數 據 庫(http:〃genome.jgi-psf.org/Poptrl/Poptrl.home.html)獲得的序列組成。比 較結果存儲在楊樹序列本地資料庫中。通過這一過程，取得編碼與 選自桉樹文庫的序列直向同源的C3HC4蛋白的簇。該簇中最長讀數 的序列如本文中SEQ ID NO: 1所示，其編碼本文中SEQ ID NO: 2 所示的多肽。實施例2從美洲黑楊中分離C3HC4 DNA序列 (a)從美洲黑楊形成層/木質部製備RNA和合成cDNA 從一年的美洲黑楊樹的枝插(stem cutting)上除去樹皮。將包括形 成層、木質部和木髓的莖的內部切成小片，在液氮中冷凍，用溴化 十六烷基三甲基銨(CTAB)提取法(Aldrich和Cullis, Plant Mol. Biol. Report., 11:128-141 (1993))進行RNA提取。在RT-PCR實驗中使用 cDNA庫，其中使用分離的總RNA作為模板，且使用Superscript II 逆轉錄酶(Invitrogen)和oligo (dT)引物合成第一鏈cDNA。如下所述， 使用基因特異性引物，通過隨後的聚合酶反應獲得雙鏈cDNA。 (b) PCR引物的設計和RT-PCR反應 合成基於SEQIDNO: 1的寡聚體作為PCR引物，包括編碼該多 肽的主要ORF的第一個ATG密碼子周圍的區域或終止密碼子周圍的區域，以擴增該主要ORF的完整編碼區。引物序列為 C3HC4NDE:長度30catatgaata cgcggtaccc ctttccaatg (SEQ ID NO: 3) C3HC4XBA:長度31tctagactat ctctccaatc cttgtttaca g (SEQ ID NO: 4)在PCR反應中，使用(a)中獲得的cDNA庫作為模板，使用SEQ IDNOs:5、 6、 7和8的引物。PCR包括94°C 1分鐘、51°C 1分鐘 和72°C 2分鐘的40個循環，隨後是72°C 7分鐘的一個額外的延伸 步驟。PCR產物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，然後用溴化乙4走染 色電泳凝膠，並在UV透射儀上檢測擴增的條帶。驗證檢測到的擴 增條帶，並用刀片從瓊脂糖凝膠上切下。將凝膠片轉移到1.5mL微 型管中，分離DNA片,殳，並用GFX PCR淨化和凝月交條帶純化試劑 盒(Amersham)純化。將回收的DNA片段亞克隆到可商購的克隆載體 中，轉化大腸桿菌，然後用來製備質粒DNA,然後採用標準方法通 過二脫氧法(Messing, M"AoA &五"z戸o/ 101， 20-78 (1983))測序。得 到核苦酸序列SEQIDNO. 1,其編碼此處公開的SEQIDNO:2的多 肽。實施例3轉基因本氏菸草(Mco"awa 6e"&aw&加)植物的製備 將以上實施例2中獲得的來自美洲黑楊的核酸分子導入植物宿 主中以產生轉基因菸草植物。將實施例2中獲得的從美洲黑楊中分離的核酸分子克隆到表達 載體中木質部優先的香豆酸-4-羥化酶基因(C4H)啟動子的下遊(圖 2)。得到的表達構建體在大腸桿菌中擴增，然後通過化學轉化法轉化 到根癌土壤桿菌LBA4404林中。土壤桿菌介導的本氏菸草的轉化利用Horsch等，6Wwce 227: 1229 (1985)的葉盤法實現。簡言之，LBA4404 土壤桿菌抹生長過夜， 直到達到對數中期生長。用無菌水1:10稀釋培養物，並與來自無菌27生長的幼小本氏菸草植物的葉盤共培養20分鐘。這些葉盤在Murashige-Skoog培養基中在暗處培養。48小時後，將葉盤顛倒置於 添加有0.4 mg/L 。引哚乙酸(IAA)、 2 mg/L節基氨基。票呤(hOBAP)、 1 mg/L Finale和500 mg/L羧節西林的相同生長培養基的新鮮平板上。 當形成幼苗時，從葉盤上取下，置於只添加1 mg/L Finale的新鮮培 養基中。讓轉基因雜合的本氏菸草原代轉化體的幼苗在Murashige 和Skoog培養基上生根，然後轉移到土壤中，並在溫室中生長。按 照此處提供的說明，條件(~50 pM/m2/sec光，27。C)足以鑑定那些顯示 改變的木質部結構和/或木質部化學組成或這些效應的組合的轉基因 植物。實施例4外源基因插入宿主植物基因組的PCR驗證利用PCR驗證基因構建體在轉基因植物的基因組中的整合。合 成一對引物，用於從選擇性標記基因Sar擴增400bpDNA序列。另 外，合成另一對引物，用於擴增內源本氏菸草查耳酮合酶(Ci^S)基因。 這些引物組在公開的國際申請WO 2006/096951中均有描述。Bar 35:長度20tctaccatga gcccagaacgBar 36:長度23aattcggggg atctggattt tagCHS 150:長度24gccagcccaa atccaagatt actcCHS 151:長度23aatgttagcc caacttcacg gag利用Sar引物PCR擴增含有本發明核酸分子的表達構建體的 T-DNA部分的 一部分，即從本氏菸草轉化體的基因組DNA擴增。PCR反應混合物含有使用溴化十六烷基三曱基銨(CTAB)提取法 (Aldrich和Cullis,屍/福Mo/.腸/. 11: 128-41 (1993))製備的轉化植物的100 ng基因組DNA、 0.2 ]uM用於萬『基因的各引物、0.2 ]iiM 用於內源C/^控制基因的各引物、100pM各脫氧核糖核苷三磷酸、 lxPCR緩衝液和2.5單位AmpliTaq DNA聚合酶(Applied Biosystems),總體積為50 |uL。循環參數如下94°C 1分鐘，57°C 1 分鐘，72。Cl分鐘，40個循環，加上72。C5分鐘延伸。PCR產物在 1%瓊脂糖凝膠上電泳。實施例5轉基因植物中轉基因表達水平的確定 利用半定量RT-PCR檢測轉基因植物的莖組織中美洲黑楊 C3HC4轉錄物的積累。利用CTAB法(Aldrich和Cullis，屍/a"f Mo/. 5io/. 鄉oW. 11:128-141 (1993))從4個月大的轉基因菸草TO植物的莖切段 中分離總RNA。使用Superscript II RNase H-RT (Invitrogen, USA)由 500 ng總RNA合成cDNA。上述引物與用於編碼查耳酮合酶(C/f5) 的組成型基因的引物一起使用，後者作為標準化每個樣品中使用的 總RNA的量的內部控制。使用第一鏈cDNA的12.5倍稀釋液在下 列條件下進行PCR: 94°C 3分鐘，和94°C 1分鐘、51°C 1分鐘、72。C 1分30秒的27個循環。上述公開內容和實施例描述了本發明的各個特徵，基本上需要 分離和克隆可用於產生基因工程植物的、編碼C3HC4蛋白家族成員 的核酸分子。已經用這種分離的核酸分子轉化或轉染的重組植物可 顯示纖維素和/或木素含量的定量改變。實施例6 轉基因植物的組織化學分析 將轉基因菸草和對照非轉基因植物的莖切段，並在4%低聚甲醛 中固定24小時。然後在切片機(LeicaRM2255)上將固定的組織切片， 之後用星藍/番紅染色。組織學染色的切片在Leica DM1L倒置顯微 鏡下採用亮視野和暗視野照明進行觀察。實施例7在維管組織中超表達C3HC4的轉基因植物中纖維素含量的提高收集用包含在木質部優先的美洲黑楊C4H啟動子控制下的美洲 黑楊C3HC4基因的構建體轉化的菸草轉基因事件(event)和非轉基 因對照植物的主莖，風乾兩周。將乾燥的莖切片，使用30目的篩在 切碎機上製成粉末。然後對莖粉末樣品進行化學分析，以確定纖維 素和木素含量。簡言之，在酸水解這些從莖中提取的多糖後基於總 糖確定纖維素和半纖維素含量。碾碎的莖於45°C真空乾燥，並用 H2S04水解。高pH陰離子交換層析後，基於水解物的組成對葡聚糖 和其它多糖(半纖維素)進行定量。Chiang和Sarkanen (1983)和Davis (1988)，同上。按照實施例5詳述的程序得知表達轉基因的三個 C3HC4轉基因事件，顯示統計學顯著的纖維素含量升高(圖3)。與對 照非轉基因植物的50.00%相比，轉基因事件6B顯示54.09%的纖維 素，表明纖維素含量顯著提高了 8.18。/。(P^).05,t-檢驗)。與對照植物 的50.00%相比，轉基因事件24B顯示53.90%的纖維素，表明纖維素 含量提高了 7.80% (圖3; t-檢驗)。與對照非轉基因植物的50.00%相比，轉基因事件4B顯示53.26%的纖維素含量，表明纖維 素含量提高了 6.52% (圖3;PS0.05, t-檢驗)。生長成熟後，TO事件自花受精產生Tl株。這裡顯示了已分析 其Tl後代的三個事件的相關結果。對來自事件6B的Tl群體的分析表明，C3HC4基因的純合顯性 條件是致死性的，因為在分離群體中沒有檢測到純合顯性植物。植 物發育可能受到影響。儘管如此，與純合隱性植物相比，C3HC4基 因半合植物顯示纖維素含量顯著提高8.4% (P<0,05， t-檢驗)(圖4)。 與純合隱性植物相比，它們也顯示木素含量降低18% (P<0.05， t-檢驗) (圖5)。在事件24B和25B的分離群體中，可以鑑別出純合顯性植物。 但是與純合隱性植物相比，在半合植物組中觀察到纖維素含量的較大提高。與純合隱性植物相比，來自事件24B的半合植物顯示纖維 素含量提高9.7%,純合顯性植物顯示纖維素含量提高7.5% (圖6;t-檢驗)。與純合隱性植物組相比，來自事件25B的半合植物 顯示提高10.4% (圖7; PO.05, t-檢驗)。對於這兩個事件，沒有觀察 到木素含量的顯著改變。
權利要求
1.一種分離的核酸序列，其包含選自下組的序列(a)SEQ ID NO1所示的核酸序列，或其互補鏈；(b)編碼SEQ ID NO2所示的胺基酸序列的核酸序列；(c)在嚴格條件下能夠與(a)或(b)的核酸序列雜交的核酸序列，其中所述雜交序列編碼C3HC4多肽；(d)作為(a)或(b)的核酸序列的等位基因變體或選擇性剪接變體的核酸；和(e)與(a)或(b)的序列有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或更高的序列同一性的核酸序列。
2. —種分離的C3HC4蛋白，其選自(a) SEQ ID NO: 2所示的多肽;(b) 具有與SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列有至少85%或更高 序列同一性的胺基酸序列的多肽；和(c) 如(a)或(b)中定義的多肽的變體。
3. —種核酸構建體，其包含與一個或多個合適的啟動子可操作 地連接的分離的C3HC4多核苷酸序列，該啟動子驅動該C3HC4多 核苷酸序列的表達。
4. 如權利要求3所述的核酸構建體，其中所述啟動子是木質部 優先的啟動子。
5. 如權利要求4所述的核酸構建體，其中所述木質部優先的啟 動子選自TUB基因啟動子、SuSy基因啟動子、COMT基因啟動子 和C4H基因啟動子。
6. —種植物細胞，其包含如權利要求3所述的核酸構建體。
7. —種由權利要求6的植物細胞產生的轉基因植物，其中所述 植物與同種的非轉基因植物相比，具有改變的纖維素和/或木素含量。
8. 如權利要求6所述的植物細胞，其中所述啟動子是木質部優 先的啟動子。
9. 如^L利要求8所述的植物細^;,其中所述木質部優先的啟動 子選自TUB基因啟動子、SuSy基因啟動子、COMT基因啟動子和 C4H基因啟動子。 '
10. 如權利要求7所述的轉基因植物，其中所述植物是雙子葉植物。
11. 如權利要求7所述的轉基因植物，其中所述植物是單子葉植物。
12. 如權利要求7所述的轉基因植物，其中所述植物是棵子植物。
13. 如權利要求7所述的轉基因植物，其中所述植物是闊葉樹。
14. 如權利要求13所述的轉基因植物，其中所述闊葉樹是桉屬 植物。
15. 如權利要求13所述的轉基因植物，其中所述闊葉樹是楊屬 植物。
16. 如權利要求11所述的轉基因植物，其中所述針葉樹是松屬 植物。
17. 如權利要求7所述的轉基因植物的一部分，其選自葉、莖、 花、子房、果實、種子和愈傷組織。
18. 如權利要求7所述的轉基因植物的後代。
19. 如權利要求18所述的後代，其中所述後代是雜種植物。
20. —種改變植物中的纖維素和/或木素含量的方法，包括(a) 向分離的植物細胞中引入核酸構建體，該核酸構建體包含與 一個或多個合適的啟動子可操作地連接的分離的C3HC4多核苷酸序 列，該啟動子驅動該C3HC4多核苷酸序列的表達；和(b) 在促進植物生長的條件下培養所述植物細胞，其中所述植物 超表達C3HC4蛋白，並且與同種的非轉基因植物相比，具有提高的 纖維素含量和/或減少的木素含量。
21. 如權利要求20所述的方法，其中所述啟動子是木質部優先 的啟動子。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述木質部優先的啟動子選自TUB基因啟動子、SuSy基因啟動子、COMT基因啟動子和C4H 基因啟動子。
全文摘要
本發明公開了用於改變植物組織中纖維素和/或木素含量的多核苷酸、核酸構建體和方法。植物用編碼C3HC4蛋白的基因進行基因工程化，編碼C3HC4蛋白的基因在植物維管系統中超表達時導致纖維素含量提高。帶有C3HC4蛋白基因的植物轉化體顯示提高的纖維素含量和/或降低的木素含量，該性狀被認為改善了闊葉樹在製漿和造紙過程中的纖維素提取。
文檔編號C12N15/29GK101578370SQ200780046706
公開日2009年11月11日 申請日期2007年12月20日 優先權日2006年12月20日
發明者I·R·格哈特, P·阿魯達 申請人:阿萊利克斯有限公司