一種小分子抗炎藥物的篩選方法
2023-08-07 18:02:31 2
一種小分子抗炎藥物的篩選方法
【專利摘要】本發明提供一種高通量篩選小分子抗炎藥物的方法，利用LPS（內毒素）刺激腹腔巨噬細胞來模擬體內炎症發生時巨噬細胞被激活這一生物學現象。通過檢測藥物對巨噬細胞分泌細胞因子的影響作用來評價藥物的抗炎活性。
【專利說明】一種小分子抗炎藥物的篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及到一種抗炎藥物篩選的新方法，更具體地說是從細胞水平角度，通過化合物對腹腔巨噬細胞分泌細胞因子的影響來評價該化合物是否有希望發展成為新型抗關節炎藥物。
【背景技術】
[0002]炎性反應，俗稱發炎，指生物組織受到外傷、出血、或病原感染等刺激，激發的生理反應，是先天免疫系統為移除有害刺激或病源體及促進修復的保護措施，其中包括了紅腫、發熱、疼痛等症狀。通常情況下，炎症是有益的，是人體的自動的防禦反應，但是有的時候，炎症可以引起人體自身免疫系統的過敏，進而攻擊自身的組織及細胞、如類風溼性關節炎和紅班狼瘡症等免疫系統過敏病症，免疫系統過敏所生成的C0X-2及IL-1 β，使到軟骨組織疼痛及發炎。長期發炎可引起一系列疾病，如花粉症，牙周炎，動脈粥樣硬化，類風溼性關節炎，甚至癌症(如膽囊癌)。炎性反應可分為急性炎症和慢性炎症。急性炎症是生物體應該有害刺激的初步反應，更多的血漿和白血球(特別是粒細胞)從血液移往受損組織。一連串的生化反應進行傳播並熟成進一步的炎性反應，當中牽涉局部的血管系統，免疫系統及受損組織內的各個細胞。慢性炎症引致發炎部位的細胞類型改變，組織的毀滅與修復同時進行。
[0003]抗炎藥物目前主要有兩類，一類是NSAIDs (非留體抗炎藥)，是一類疾病症狀改善類藥物，以COX酶抑制劑居多。它通過抑制前列腺素的合成而緩解炎症的紅腫熱痛等症狀，但是並無法阻止慢性炎症的發展進程，對疾病的發展沒有很好的控制作用。而且這一類藥物以COX酶為靶標，存在潛在的心腦血管和胃腸道出血的風險。另一類則是一些免疫調劑藥物，這一類藥物可以通過幹預異常免疫應答的進程，從而可以有效控制慢性炎症，如自身免疫病的疾病的發展。
[0004]炎症是一個複雜的過程，炎症發生過程中涉及到多種細胞的活化和細胞因子的釋放。其中，巨噬細胞是參加炎症反應的一種重要的細胞。巨噬細胞是IL-1 i3、TNF-a和IL-6等細胞因子的主要來源，針對這幾個炎性因子的生物大分子在臨床應用上也取得了成功，於是我們選擇巨噬細胞作為我們的篩選體系，選擇IL-1 β、TNF-a和IL-6作為我們的評價標準。
[0005]目前，科研人員主要利用永生化的人或嚙齒類動物的細胞系進行抗炎藥物的篩選。這種篩選方式能夠實現藥物的快速篩選，但由於體外培養的永生化細胞已失去體內細胞的一些活性和特徵，篩選結果不能完全反映藥物在體內的作用情況。而原代培養的細胞與生物體內細胞性狀相似性大，更能反映細胞在體內真實的功能狀態。因此將原代培養的細胞模型應用到抗炎藥物的篩選將會彌補當前篩藥方法的不足。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種抗炎藥物的細胞靶標篩選系統。從6-8周雌性Balb/c小鼠腹腔中分離巨噬細胞，在96孔板培養後用內毒素(LPS)進行處理，激活巨噬細胞。與此同時採用待測藥物處理，用ELISA檢測細胞培養上清中炎症細胞因子TNF-α，IL-1 β以及IL-6的表達水平，評價藥物的抗炎效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0007]圖1:利用所建篩選系統TNF- a指標對陰性陽性對照藥的藥效評價。
[0008]圖2:利用所建篩選系統IL-1 β指標對陰性陽性對照藥的藥效評價。
[0009]圖3:利用所建篩選系統IL-6指標對陰性陽性對照藥的藥效評價。
【具體實施方式】
[0010]下面結合附圖對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0011]I)取8周雌性balb/c小鼠，腹腔注射4%的肉湯培養基；
2)72-96小時後,處死小鼠,酒精浸泡5分鐘；
3)向小鼠腹腔內注射5mL4°C預冷DMEM培液，腹部按摩5分鐘；
4)用IOmL注射器吸取小鼠腹腔內的培液，轉移到50mL離心管中；
5)重複第三步和第四步一次；
6)1500轉/分鐘離心3分鐘，棄去上清，用37°C完全DMEM培養基重懸細胞；
7)計數，調整細胞濃素至2X105/mL，鋪在96孔板中培養，每孔IOOyL;
82小時後,換培液,吸去尚未貼壁的細胞；
9)培養24小時後，加入Iμ g/mL的LPS與特定濃度的待測小分子藥物；
10)培養12小時後ELISA檢測上清中細胞因子TNF-α和IL-6濃度(對於IL-1β的檢測，在LPS刺激後需要去掉上清，並加入300 μ L含5mM ATP的無血清DMEM重刺激lh，再取上清檢測)
結論
陽性對照藥物SB202190 (p38的抑制劑)、YL064 (本實驗室開發的抗炎藥物，已經證明有抗炎活性)均能在這個篩選系統中有效的抑制炎性細胞因子(TNF-α ,IL-1 β和IL_6)的產生，而陰性對照小分子藥物YL064* (YL064衍生物，喪失了其抗炎作用)則無相應的抑制效果。結果重複性好，穩定，證明了該系統是一個可靠有效的抗炎藥物篩選評價系統。
[0012]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本【技術領域】的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種小分子抗炎藥物的篩選方法，其特徵在於:所述的方法由如下步驟組成:a)從8周雌性Balb/c小鼠中分離出小鼠腹腔巨噬細胞，鋪在96孔板中，並在37°C二氧化碳培養箱中培養山)在鋪好的細胞中加入指定濃度待測小分子藥物共同孵育，與此同時加入內毒素進行刺激；c)藥物、細胞和內毒素共同培養一段時間後，直接收集或者加入ATP處理後收集培養上清，檢測炎症細胞因子的濃度。
2.根據權利要求1所述的篩選方法，其特徵在於:採取小鼠腹腔原代巨噬細胞；通過向小鼠腹腔中注射不完全DMEM培養基，輕揉按摩後抽提出巨噬細胞，再將DMEM培養液取出從而獲得原代巨噬細胞。
3.根據權利要求1所述的篩選方法，其特徵在於:被篩選化合物通過TNF-a、IL-1β和IL-6的表達水平反映被篩選化合物的抗炎活性；通過測定培液上清中TNF-a ,IL-1 β和IL-6的濃度反映被篩化合物的抗炎與免疫調劑能力。
4.根據權利要求1所述的篩選方法，其特徵在於:篩選抗炎藥物的方法包括如下步驟:I)抽提培養原代的小鼠腹腔巨噬細胞於96孔板中；2)加入被篩選化合物到DMEM細胞培液中，再加入一定濃度的LPS，然後和細胞共培養一天；3)收集細胞培養液，得培養液1，PBS清洗細胞後，加入混有ATP的DMEM培養基；4)培養一個小時後收集培液2 ；5)用ELISA方法檢測培養液I中的TNF- a , IL-6和培養液2中的IL-1 β。
【文檔編號】G01N33/543GK103983770SQ201410196240
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月12日 優先權日:2014年5月12日
【發明者】孫兵, 侯建, 馬麗豔, 伊春豔, 王江君, 凌志洋 申請人:中國科學院上海巴斯德研究所