定量檢測玉米赤黴烯酮的方法
2023-08-07 17:52:46 2
專利名稱：定量檢測玉米赤黴烯酮的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物檢測技術領域的方法，具體是涉及一種定量檢測玉米赤黴烯酮的方法。
背景技術：
玉米赤黴烯酮毒素(karalenone，ZEN)是鐮刀菌在一定溼度和溫度條件下繁殖所產生的次級代謝產物。玉米赤黴烯酮毒素可存在於玉米、小麥、大麥、高粱、黑麥等穀物， 也可存在於食用含^N飼料的動物組織中，包括牛奶、雞蛋等。玉米赤黴烯酮毒素與自發性乳腺癌，輸卵管和子宮水腫、增生，精細胞畸變、凋亡等疾病有關。玉米赤黴烯酮毒素具有分布廣泛、殘留時間長、難處理、和其他毒素一起有增強毒性的現象。加入WTO之後，農產品及相關食品的國際貿易量日益增加，隨之對進出口產品的生物安全性的要求也越來越高，為了保證這類產品的順利上市和食用者的健康，出入境檢疫、海關、生產企業、監督部門等部門迫切需要一種快速簡便的玉米赤黴烯酮毒素檢測方法。
膠體金標記技術是以膠體金作為示蹤標誌物，應用抗原抗體反應的一種免疫標記技術。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、單寧酸/檸檬酸鈉和檸檬酸三鈉等作用下，聚合成特定大小的金顆粒，由於靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，故稱為膠體金。 膠體金標記，實質上是蛋白質高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理是膠體金顆粒表面的負電荷，與蛋白質分子的正電荷基團因靜電作用而形成牢固結合。這種球型的膠體金顆粒具有高電子密度，能夠對多種生物高分子物質如葡萄球菌、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、BSA(牛血清白蛋白)等非共價結合，形成可見的紫紅色，使其成為免疫反應的優良標記物，因此廣泛應用於各種物質的檢測。
酶聯免疫吸附實驗由於液相中的抗原(或抗體)需經擴散才能與固相上的抗原或抗體反應，需較長時間，各個步驟需徹底地洗滌，並且需要特定的酶和底物顯色，因此耗時長，程序繁瑣；高效液相色譜法因其對檢測樣品、儀器及操作人員的要求，不利於基層常規檢測使用。膠體金免疫層析法能克服上述方法的不足，膠體金免疫層析定量試驗法利用抗原抗體反應原理，膠體金標記示蹤物與固定在膜上的抗原或抗體形成複合物被截留而顯色，不需要特定的酶和底物顯色，也不需要抗原抗體之間的較長時間的物理吸附，而根據顯色深淺判定陰陽性結果並根據標準曲線計算出具體濃度，安全有效，簡單方便。
膠體金免疫層析試驗的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的膠體金標記。 固定在NC膜上的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，膠體金標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又有示蹤的功能。在測定時，受檢樣品(測定其中的抗體或抗原)通過毛細作用向前移行與金標墊上的抗原或抗體起反應。繼續向前移行，與固定在T線(檢測線)抗原或抗體結合形成免疫複合物被截留而顯色，約為一條寬為Imm的棕紅色條帶，多餘的金標抗體繼續向前移動，與固定在C線(質控線)的二抗結合被截留而顯色，約為一條寬為Imm 的棕紅色條帶。此時T線形成金標複合物與標本中受檢物質的量呈一定的比例，故可根據 T線呈現的顏色深淺進行定量分析。
關於玉米赤黴烯酮毒素的檢測國內外已建立了多種方法。目前檢測ZEN的方法主要為高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜-質譜聯用法(GC-MQ，液譜和質譜聯用法(LC-MS)。 然而，這些方法需要對檢測樣品進行嚴格的預處理，還需要高效液相色譜儀等貴重儀器，同時要求有專業的操作人員，不利於現場常規檢測使用。發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種快速定量檢測玉米赤黴烯酮毒素的方法。本發明檢測對象單一且針對性強，準確率高，檢測速度快，所需時間短，只需20 分鐘，不需經培訓的專業人員就可使用本發明方法來檢測，滿足糧食儲存銷售機構、出入境、海關等檢驗部門快速、正確地判斷ZEN含量的要求，並且便於基層推廣和運用。
本發明是通過以下技術方案實現
一種檢測玉米赤黴烯酮的方法，該方法包括如下步驟
步驟一，將^N半抗原分別與BSA和OVA偶聯，得到偶聯物^N-BSA和^N-OVA ；
步驟二，用^N-OVA作為免疫原，採用常規方法製備抗^N的單克隆抗體；
步驟三，製備膠體金，用該膠體金標記抗^N的單克隆抗體，將標記後的單克隆抗體噴塗到金標墊上；
步驟四，在硝酸纖維素膜上進行觀N-BSA、兔抗鼠抗體的噴塗，之後將所述噴塗後的硝酸纖維素膜放入牛血清白蛋白溶液中封閉；
步驟五，將所述金標墊、所述噴塗後的硝酸纖維素膜、樣品墊和吸水墊組裝成試紙條，乾燥；
步驟六，根據已知不同濃度^NS準品的顯色值，繪製^N濃度與顯色值的標準曲線.一入 ，
步驟七，取待測樣品用甲醇提取，離心，取上清，並用稀釋液稀釋，根據該待測樣品的甲醇提取液的顯色值，通過標準曲線得到該待測樣品提取液中的ZEN濃度。
優選地，所述步驟三中，所述膠體金的顆粒直徑為25nm。
優選地，所述步驟三中，所述膠體金的製備包括如下步驟將IOOml的0.01% HAuCl4溶液加熱至沸騰，之後加入Iml的1 %檸檬酸三鈉溶液，煮沸7 lOmin，最後加三蒸水至100ml，製備得到25nm的膠體金溶液，所述百分數為質量體積百分數。
優選地，所述步驟三中，所述抗玉米赤黴烯酮的單克隆抗體在被標記之前經過透析除鹽處理。
優選地，所述步驟三中，所述標記包括如下步驟在攪拌的條件下，向膠體金溶液中加入抗玉米赤黴烯酮的單克隆抗體，使其終濃度達到3. 6 μ g/mL,室溫下孵育15min，用 0. lmol/L K2CO3調節膠體金溶液的pH為6. 5，然後加入10% BSA至BSA的終濃度為0. 1%, IOOOOrpm離心20min，棄上清，再用含1 % BSA的2mM pH為8. 0的硼酸鹽緩衝液洗滌，共洗滌3次，最後加入含4%蔗糖、6%海藻糖、BSA和疊氮鈉分別為和0. 05%的2mM pH為 7. 4的硼酸鹽緩衝液中，即完成標記，所述百分數為質量體積百分數。
優選地，所述步驟五中，所述乾燥為37°C烘箱乾燥。
優選地，所述步驟七中，所述甲醇為80 %的甲醇，所述百分數為體積百分數。
優選地，所述步驟七中，所述離心為2500g離心15分鐘。
優選地，所述步驟七中，所述稀釋液為含10%甲醇的0. 05M pH為7. 4的PBST，所述百分數為體積百分數。
與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果待測樣品若有ZEN毒素，由於毛細效應向前層析移動，樣品液中的ZEN與金標單克隆抗體形成的複合物，競爭了檢測線上抗原與金標單克隆抗體結合的機會，所以膠體金不能或僅少量能被檢測線上的抗原截流而沉積故而以檢測線顯色強度來判定ZEN含量，並可精確定量，由此判定穀物、食品、動物產品等檢測樣品中^NW含量。本發明檢測對象單一且針對性強，準確率高。檢測速度快，所需時間短，只需20分鐘、不需經培訓的專業人員就可使用本發明方法來檢測，滿足糧食儲存銷售機構、出入境、海關等檢驗部門快速、正確地判斷ZEN毒素含量的要求，並且便於基層推廣和運用。
圖1為本發明實施例試紙條的結構示意圖2為本發明實施例試紙條的結果示意圖。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。
下面實施例中，未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。本發明中，BSA為牛血清白蛋白；OVA為卵清白蛋白；ZEN為玉米赤黴烯酮； ZEN-BSA和ZEN-OVA分別表示^N與BSA、OVA的偶聯物，PBST代表在PBS中加入Twen-20 配置而成的緩衝液，這些技術術語都是本領域技術人員所熟知的。
實施例
1、抗原的製備
(1)玉米赤黴烯酮包被抗原的製備
取0. 33ml (3mg/ml) ZEN,混合於1. 2ml吡啶中，加入^ig 0-羧甲基羥胺，室溫攪拌反應24h ；將溶液真空乾燥後，加入蒸餾水，並使其溶解，調整pH至8. 0 ；未反應的ZEN 用苯抽提除去(3ml苯，共抽提3次)，除去苯相，保留水相。水相調pH至3. 0，用乙酸乙酯抽提(IOml乙酸乙酯，共抽提4次)，抽出酯相，棄水相。酯相用無水硫酸鈉濾過後吹乾。吹乾後的結晶物溶於0. 5ml鹼性氧化鋁處理過的二氧六環中；稱取20mgBSA溶於0. 7ml 0. 05mol/ L (pH7. 2)的PBS中；之後，將兩溶液於4°C下緩慢混合，得溶液a ；取Img NHS和^ig DCC溶於0. 2ml 二氧六環中得溶液b，並緩慢將溶液b滴加到溶液a中，進而得到溶液C。將溶液 c室溫下攪拌反應16h，調pH至6. 0，通風櫥中吹乾，緩慢滴加DCC溶液(^igDCC溶於0. 2ml 二氧六環中而得)，室溫下攪拌反應48h，最後用PBS透析2 3d，-20°C保存，得^N-BSA完全抗原。
(2)玉米赤黴烯酮免疫抗原的製備
玉米赤黴烯酮免疫抗原的製備方法基本同玉米赤黴烯酮包被抗原的製備方法，所不同的地方在於將BSA替換為0VA，製備得到^N-OVA完全抗原。
2、抗玉米赤黴烯酮的單克隆抗體的製備
將^N-OVA完全抗原溶解於PBS中，測定完全抗原中載體蛋白的濃度。將抗原與等量的弗氏完全佐劑充分乳化，皮下注射免疫6周齡Balb/C小鼠，每隻0. Iml ；二免兩周後， 改用弗氏不完全佐劑，用同樣的方法和劑量，進行免疫；三免，操作同二免。免疫5天後眼底靜脈採血測效價，效價達到1 10000以上時加強免疫腹腔注射不加佐劑的抗原0.1ml， 三天後處死小鼠，取其脾臟，與骨髓瘤細胞融合。用間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞。 通過小鼠腹腔注射雜交瘤細胞來大量製備小鼠腹水，腹水經過過濾、離心初步純化後，採用辛酸法和親和層析法純化腹水，得玉米赤黴烯酮單克隆抗體的製備。
3、膠體金的製備
先將IOOml的0. 001% (ff/V) HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入Iml的1 % (W/V) 檸檬酸三鈉水溶液，開始有些藍色，然後淺藍、藍色，再加熱出現紅色，煮沸7 IOmin出現透明的酒紅色，最後加三蒸水至100ml，就這樣製備了 25nm的膠體金溶液。然後用電鏡鏡檢，確保製備的金顆粒儘量使其大小一致，均勻，顆粒直徑在25nm左右。
4、單克隆抗體的標記
待標記的抗體蛋白用0. 005mol/L的氯化鈉溶液透析48小時除鹽，然後用製備好的25nm的膠體金來標記多克隆抗體蛋白。具體步驟為①向攪拌中的膠體金溶液裡迅速加入抗體蛋白使其終濃度達到3. 6 μ g/mL,室溫下孵育15min ；②用0. lmol/L K2CO3調節金溶液的PH為6. 5，然後加入10% (ff/V)BSA至終濃度0. 來穩定膠體金溶液，反應5min ； ③IOOOOrpm離心20min，棄上清，再用含1 % (ff/V) BSA的2mM pH為8. 0的硼酸鹽緩衝液洗滌，共洗滌3次；④最後加入含4% (W/V)蔗糖、6% (W/V)海藻糖、BSA和疊氮鈉分別為 (W/V)和0.05% (W/V)的2mM硼酸鹽緩衝液(pH 7.4)中，4°C儲存備用。以上操作中應注意，一切溶液中不應含雜質微粒，可用高速離心或微孔濾膜預處理。
5、膠體金試紙條的組裝
將標記好的單克隆抗體蛋白噴塗到金標墊上，噴塗^N-BSA偶聯抗原到硝酸纖維素膜上的T線，噴塗兔抗鼠的單克隆抗體到硝酸纖維素膜上的C線，之後將硝酸纖維素膜放入牛血清白蛋白溶液中封閉。將金標墊、噴塗後的硝酸纖維素膜、樣品墊和吸水墊組裝成試紙條，37°C烘箱乾燥。試紙條的組裝順序如圖1所示，試紙條的組成由下到上依次包括塑料底襯1、硝酸纖維素膜2、金標墊3、樣品墊4、吸水墊5，其中塑料底襯1的作用是提供組裝平臺，硝酸纖維素膜2上具有以兔抗鼠單克隆抗體噴塗的C線，以^N-BSA噴塗的T線，金標墊3上加有金標抗體，樣品墊4提供了待測樣品加入的位置。
6、膠體金試紙條的使用及結果判定
取ZEN標準品，分別稀釋為l、2、4、8、16、32ng/ml溶液，並同時配製空白溶液，取 250 μ 1滴入試紙條樣品槽中；取0. 75g待檢樣品用:3ml 80%甲醇(甲醇水=80 20) 提取，2500g離心15min，取上清，並用稀釋液稀釋2. 4倍，取250 μ 1滴入試紙條樣品槽中， 20min後將顯色完成的標準品與待測樣品的試紙條放入讀條儀中，讀取C、T線的顯色值，並記錄；利用Excel軟體繪製^N標準品濃度與顯色值的標準曲線，將待測樣品顯色值帶入標準曲線中，得到ZEN濃度結果；將此結果X稀釋因子0X2.4)，即為樣品中所含ZEN濃度(μ g/kg)ο
把待檢樣品滴入試紙條的樣本槽中，由於毛細效應，液體的層析方向向上，對於層析的結果見圖2，其中a為樣品中 N含量超過32ng/ml時的結果示意圖；bl_b4分別為^N 濃度分別為l、4、8、32ng/ml時的結果示意圖。
鑑定方法具體為
若在C線上出現紅色條帶，則判定試紙條測試結果有效；
若在T線和C線上均出現棕紅色條帶，將T線顯色值代入標準曲線中；
若T線顯色值等於或大於空白溶液的值，則樣品中不含或含有少於lng/ml的 ZEN ；
若T線顯色值在標準曲線範圍內，則樣品中含有的ZEN濃度可根據標準曲線算出；
若T線顯色值為0，則待測樣品中ZEN含量超出32ng/ml。
可以看出，本實施例的方法可直接定量檢測樣品中的^N，不需要專業培訓，操作方便、快速，20分鐘即可獲得結果，本發明滿足糧食儲存銷售機構、出入境、海關等檢驗部門快速、正確地判斷^N含量的要求，並且便於基層推廣和運用。
權利要求
1.一種檢測玉米赤黴烯酮的方法，其特徵在於，包括如下步驟步驟一，將^N半抗原分別與BSA和OVA偶聯，得到偶聯物^N-BSA和^N-OVA ；步驟二，用^N-OVA作為免疫原，採用常規方法製備抗^N的單克隆抗體；步驟三，製備膠體金，用該膠體金標記抗^N的單克隆抗體，將標記後的單克隆抗體噴塗到金標墊上；步驟四，在硝酸纖維素膜上進行觀N-BSA、兔抗鼠抗體的噴塗，之後將所述噴塗後的硝酸纖維素膜放入牛血清白蛋白溶液中封閉；步驟五，將所述金標墊、所述噴塗後的硝酸纖維素膜、樣品墊和吸水墊組裝成試紙條， 乾燥；步驟六，根據已知不同濃度^NS準品的顯色值，繪製^N濃度與顯色值的標準曲線；步驟七，取待測樣品用甲醇提取，離心，取上清，並用稀釋液稀釋，根據該待測樣品的甲醇提取液的顯色值，通過標準曲線得到該待測樣品提取液中的ZEN濃度。
2.如權利要求1所述的檢測玉米赤黴烯酮的方法，其特徵在於，所述步驟三中，所述膠體金的顆粒直徑為25nm。
3.如權利要求1所述的檢測玉米赤黴烯酮的方法，其特徵在於，所述步驟三中，所述膠體金的製備包括如下步驟將IOOml的0. 01% HAuCl4溶液加熱至沸騰，之後加入Iml的檸檬酸三鈉溶液，煮沸7 lOmin，最後加三蒸水至100ml，製備得到25nm的膠體金溶液，所述百分數為質量體積百分數。
4.如權利要求1所述的檢測玉米赤黴烯酮的方法，其特徵在於，所述步驟三中，所述抗玉米赤黴烯酮的單克隆抗體在被標記之前經過透析除鹽處理。
5.如權利要求1所述的檢測玉米赤黴烯酮的方法，其特徵在於，所述步驟三中，所述標記包括如下步驟在攪拌的條件下，向膠體金溶液中加入抗玉米赤黴烯酮的單克隆抗體，使其終濃度達到3. 6 μ g/mL,室溫下孵育15min，用0. lmol/L K2CO3調節膠體金溶液的pH為 6. 5，然後加入10% BSA至BSA的終濃度為0.1%, IOOOOrpm離心20min,棄上清，再用含1 % BSA的2mM pH為8. 0的硼酸鹽緩衝液洗滌，共洗滌3次，最後加入含4%蔗糖、6%海藻糖、 BSA和疊氮鈉分別為1%和0. 05%的2mM pH為7. 4的硼酸鹽緩衝液中，即完成標記，所述百分數為質量體積百分數。
6.如權利要求1所述的檢測玉米赤黴烯酮的方法，其特徵在於，所述步驟五中，所述乾燥為37 °C烘箱乾燥。
7.如權利要求1所述的檢測玉米赤黴烯酮的方法，其特徵在於，所述步驟七中，所述甲醇為80%的甲醇，所述百分數為體積百分數。
8.如權利要求1所述的檢測玉米赤黴烯酮的方法，其特徵在於，所述步驟七中，所述離心為2500g離心15分鐘。
9.如權利要求1所述的檢測玉米赤黴烯酮的方法，其特徵在於，所述步驟七中，所述稀釋液為含10%甲醇的0. 05M PH為7. 4的PBST，所述百分數為體積百分數。
全文摘要
本發明涉及一種定量檢測玉米赤黴烯酮的方法，包括如下步驟1、製備偶聯物ZEN-BSA和ZEN-OVA；2、製備抗ZEN的單克隆抗體；3、製備膠體金，標記抗ZEN的單克隆抗體；將標記後的單克隆抗體噴塗到金標墊上；4、在硝酸纖維素膜上進行點樣；5、組裝成試紙條；6、繪製ZEN濃度與顯色值的標準曲線，將待測樣品的顯色值帶入標準曲線中，得到待測樣品中ZEN的含量。本發明檢測對象單一且針對性強，準確率高，檢測速度快，所需時間短，不需經培訓的專業人員就可使用本發明方法來檢測，滿足糧食儲存銷售機構、出入境、海關等檢驗部門快速、正確地判斷玉米赤黴烯酮含量的要求，並且便於基層推廣和運用。
文檔編號G01N33/531GK102520177SQ20111040271
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者嚴亞賢, 孫建和, 王元凱 申請人:上海交通大學