具有增強的3』-錯配辨別力的dna聚合酶的製作方法

2023-08-07 21:49:31

專利名稱：具有增強的3』-錯配辨別力的dna聚合酶的製作方法
具有增強的3』 -錯配辨別力的DNA聚合酶發明領域
本發明提供了具有增強的3』 -錯配辨別力的DNA聚合酶及它們在各種應用，包括核酸多核苷酸延伸和擴增中的用途。
發明背景DNA聚合酶負責基因組的複製和維護，這是在世代間(from generation to generation)精確傳遞遺傳信息的中心職責。DNA聚合酶在細胞中的功能是作為負責DNA 合成的酶。它們在有金屬活化劑如Mg2+存在的情況下，以被複製的DNA模板或多核苷酸模板支配的順序聚合脫氧核糖核苷三磷酸。在體內，DNA聚合酶參與一系列DNA合成過程，包括DNA複製、DNA修復、重組和基因擴增。在每一 DNA合成過程期間，複製DNA模板一次或最多幾次以產生相同的複製品。與此相反，在體外，DNA複製可以重複多次，例如在聚合酶鏈式反應期間(參見例如美國專利號4，683，202)。
在聚合酶鏈式反應(PCR)的最初研究中，DNA聚合酶是在每一輪DNA複製的開始時添加的(參見上述美國專利號4，683，202)。後來，確認了從在高溫下生長的細菌中可獲得熱穩定DNA聚合酶，這些酶只需要添加一次(參見美國專利號4，889，818和美國專利號 4，965，188)。在PCR期間使用的高溫下，這些酶沒有不可逆地失活。因此，可以進行聚合酶鏈式反應的重複循環而不需要在每一合成加成過程開始時添加新鮮的酶。DNA聚合酶特別是熱穩定聚合酶，是重組DNA研究和疾病的醫療診斷中大量技術的關鍵。特別是對於診斷應用，目標核酸序列可能僅僅是所考察(in question) DNA或RNA的一小部分，因此在不擴增的情況下可能難以檢測到目標核酸序列的存在。
DNA聚合酶的總體摺疊模式類似人的右手，包含手掌、手指和拇指三個獨特的亞結構域 。(參見 Beese 等，Science 260:352-355, 1993) ;Patel 等，Biochemistry 34:5351-5363, 1995)。儘管在大小和細胞功能不同的聚合酶之間手指和拇指亞結構域的結構變化很大，但是催化性的手掌亞結構域全部都是重疊的(superimposable)。例如，在化學催化作用期間與引入的dNTP相互作用並穩定過渡態的基序A在哺乳動物pol α和原核生物的pol I家族DNA聚合酶之間是重疊的，平均偏差約為IA(Wang等，Cell 89:1087 -1099，1997)。在結構上基序A以主要包含疏水性殘基的反向平行β-摺疊鏈起始，延續到α-螺旋。DNA聚合酶活性位點的主要胺基酸序列是特別保守的。在基序A的情況下，例如，序列DYSQIELR(SEQ ID NO:28)保留在從數百萬年進化分離的生物體包括例如水生棲熱菌 ijhermus aquaticus)、沙眼衣原體{Chlamydia trachomatis)和大腸桿菌 ipscherichia coli)的聚合酶中。
除了高度保守以外，DNA聚合酶的活性位點也被證明是相對易變的，能夠容納某些胺基酸取代而不顯著降低DNA聚合酶活性。(參見例如美國專利號6，602，695)。這種突變型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反應的診斷和研究應用中提供各種選擇優勢。因此，本領域需要鑑別適於突變的胺基酸位置以產生改進的聚合酶活性。本發明，如同本文中所述，滿足這些及其它需要。
發明概述本文提供了相對於對應的未修飾的對照聚合酶具有增強的3』 -錯配辨別力的DNA聚合酶以及製備和使用這種DNA聚合酶的方法。在一些實施方案中，聚合酶是熱穩定DNA聚合酶。在一些實施方案中，DNA聚合酶是熱活性的DNA聚合酶。在一些實施方案中，本發明的 DNA聚合酶源自棲熱菌種{Thermus species)。在一些實施方案中,DNA聚合酶源自棲熱袍菌種{Thermotoga species)。
根據本發明，發現對應於SEQ ID NO:1的493位的DNA聚合酶的胺基酸可以在該位置從天然胺基酸突變，以產生相對於對應的未修飾的對照聚合酶具有增強的3』 -錯配辨別力的聚合酶。在源自棲熱菌種的DNA聚合酶中，對應於SEQ ID NO:1的493位的天然胺基酸是E。在源自棲熱袍菌種的DNA聚合酶中，對應於SEQ ID NO:1的493位的天然胺基酸是S。在源自其它非棲熱菌、非棲熱袍菌種的DNA聚合酶中，對應於SEQ ID N0:1的493位的胺基酸可以是除E或S以外的胺基酸，例如，A或G。參見

圖1。
在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1的493位的DNA聚合酶的胺基酸是除E， S，A或G以外的任何胺基酸，除了對應於SEQ ID NO:1的493位的對照DNA聚合酶的胺基酸是E，S，A或G，對照DNA聚合酶具有與所述DNA聚合酶相同的胺基酸序列。例如，在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1的493位的位置處的胺基酸選自V，L, I, M, F，W，P, T, C，Y, N, Q, D, K, R 或 H。
然而，進一步發現，在棲熱菌聚合酶的493位插入A或G (在一些非棲熱菌、非棲熱袍菌種的天然胺基酸)代替E也增加了 3』-錯配辨別力。因此，在一些實施方案中，本發明的DNA聚合酶源自棲熱菌種，對應於SEQ ID NO:1的493位的DNA聚合酶的胺基酸是除E以外的胺基酸，除了對應於SEQ ID NO:1的493位的對照DNA聚合酶的胺基酸是E，對照DNA 聚合酶具有與所述DNA聚合酶相同的胺基酸序列。例如，當DNA聚合酶源自棲熱菌種時，對應於SEQ ID NO:1的493位的位置處的胺基酸選自S，A, G, V, L, I, M, F，W, P, T, C，Y, N, Q, D, K, R或H。在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1的493位的位置處的胺基酸選自S，A, Q, G, K或R。在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1的493位的位置處的胺基酸選自A，G, K或R。在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1的493位的位置處的胺基酸是K。
在一些實施方案中，本發明的DNA聚合酶源自棲熱菌種，對應於SEQ ID N0:1的 493位的胺基酸是在中性pH時，具有極性、不帶電荷的側鏈的胺基酸(例如，N，Q, H, S， T或Y)，具有非極性、不帶電荷的側鏈的胺基酸(例如，G，A, L, M, W, P, F，C，V或I)， 或具有極性、帶正電荷的側鏈的胺基酸(例如，R或K)。在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1的493位的具有非極性的、不帶電荷的側鏈的胺基酸是A或G。在一些實施方案中，對應於SEQ ID N0:1的493位的具有極性、帶正電荷的側鏈的胺基酸是R或K。在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1的493位的具有極性、帶正電荷的側鏈的胺基酸是K。
而且，根據本發明，位於對應於SEQ ID NO:1的493位的胺基酸附近的其它胺基酸也可以被突變，以產生相對於對應的未修飾的對照聚合酶具有增強的3』 -錯配辨別力的酶。例如，對應於SEQ ID NO:1的488和/或497位的胺基酸的突變也產生相對於對應的未修飾的對照聚合酶具有增強的3』 -錯配辨別力的酶。
在一些實施方案中，具有改進的3』-錯配辨別力的DNA聚合酶在聚合酶結構域中包含基序，所述基序包含A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L,其中X6 是 S，G, A, D, F，K, C，T 或 Y;X10是除E以外的任何胺基酸；X13 是 F，A, G, S，T, Y, D 或 K (SEQ ID NO:8)。
在一些實施方案中，X1。選自L，M, W, P, T, F，Y, C，N, D, V, I, R, K, Q, H, S，A 或 G。
在一些實施方案中，X1。選自R，K, A或G (SEQ ID N0:49)。
在一些實施方案中，具有改進的3』-錯配辨別力的DNA聚合酶在聚合酶結構域中包含基序，所述基序包含A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L,其中Xltl是除E以外的任何胺基酸(SEQ ID N0:9)。
在一些實施方案中，X1。選自L，M, W, P, T, F，Y, C，N, D, V, I, R, K, Q, H, S，A 或 G。
在一些實施方案中，X1。選自R，K, A或G (SEQ ID N0:50)。
在一些實施方案中，具有改進的3』-錯配辨別力的DNA聚合酶在聚合酶·結構域中包含基序，所述基序包含A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L,其中X10 是八，G, K 或 R (SEQ ID NO: 10)。
在一些實施方案中，在所述DNA聚合酶中，Xltl選自L，M, W, P, T, F，Y, C，N, D, V, I, R, K, Q, H, S，A 或 G。
在一些實施方案中，在所述DNA聚合酶中，選自A, G，K或R (SEQ ID NO:50)。
在一些實施方案中，在所述DNA聚合酶中，選自A或G。
在一些實施方案中，具有改進的3』 -錯配辨別力的DNA聚合酶在聚合酶結構域中包含基序，所述基序包含A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L- X10-R-V-L-F-D-E-L,其中X10 是 K (SEQ ID NO: 11)。
在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的胺基酸是除D 或E以外的任何胺基酸。在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的胺基酸是除D以外的任何胺基酸。在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1的580位的 DNA聚合酶的胺基酸選自L，G, T, Q, A, S，N, R和K。在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的胺基酸是G。
在一些實施方案中，本發明的DNA聚合酶進一步包含基序，所述基序包含 T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N ;其中X7 是 Ser (S)或 Thr (T);以及X8是除D或E以外的任何胺基酸(SEQ ID NO: 27)。
在一些實施方案中，對應於&位的胺基酸選自L，G, T, Q, A, S，N, R和K (SEQ ID N0:51)。
在一些實施方案中，DNA聚合酶進一步包含在對應於選自SEQ ID NO:1的488和/ 或497的位置的一個或多個胺基酸處的突變。在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1的488位的DNA聚合酶的胺基酸是除S以外的任何胺基酸。在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1 的 488 位的 DNA 聚合酶的胺基酸選自 G，A, V, L, I, M, F，W, P, E, T, C，N, Q, D, Y, K, R或H。在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1的488位的DNA聚合酶的胺基酸是G，A, D, F，K, C，T或Y。在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1的497位的DNA 聚合酶的胺基酸是除F或Y以外的任何胺基酸。在一些實施方案中，對應於SEQ ID N0:1的 497 位的 DNA 聚合酶的胺基酸選自 R，V, L, I, M, W, P, T, C，N, D, E, S，A, G, K, E或H。在一些實施方案中，DNA聚合酶源自棲熱菌種，對應於SEQ ID NO:1的497位的DNA 聚合酶的胺基酸是除F以外的任何胺基酸。因此，在一些實施方案中，對應於SEQ ID NO:1 的497位的DNA聚合酶的胺基酸是A，G, S，T, Y, D或K。
各種DNA聚合酶適於本發明的突變。尤其適合的是熱穩定聚合酶，包括來自各種嗜熱菌(thermophilic bacteria)的野生型或天然存在的熱穩定聚合酶，以及通過胺基酸取代、插入或缺失或其它修飾而源自這種野生型或天然存在的酶的合成的熱穩定聚合酶。 示例性的聚合酶的未修飾形式包括例如CS5 (SEQ ID NO: 29)或CS6 (SEQ ID NO: 30)或Z05 DNA聚合酶(SEQ ID NO:1),或與其具有至少80%、優選至少90%或更優選至少95%的序列同一性的功能性DNA聚合酶。其它未修飾的聚合酶包括例如來自於下列嗜熱菌中任一種的 DNA聚合酶(或與這種聚合酶具有至少80%、優選至少90%或更優選至少95%的序列同一性的功能性DNA聚合酶)海棲熱袍菌ijhermotoga maritima) (SEQ ID NO: 38)；水生棲熱菌 ijhermus aquaticus) (SEQ ID NO:2)；嗜熱棲熱菌(Jhermus thermophilus) (SEQ ID NO:6)；黃棲熱菌(Jlwrmus fIavus) (SEQ ID NO:4)；絲狀棲熱菌 iThormus filiformis) (SEQ ID NO: 3)；棲熱菌種{Thermus sp. spsl7) (SEQ ID NO: 5)；棲熱菌種 ZO5 {Thermus sp. Z05) (SEQ ID NO:1)；那不勒斯棲熱袍菌 ijhermotoga neopolitana) (SEQ ID NO :39)；非洲棲熱腔菌{Thermosipho africanus) (SEQ ID NO :37) ； Thermus caldophilus (SEQ ID NO:7),耐放射異常球菌{Deinococcus radiodurans) (SEQ ID NO: 36)，嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus s tearo thermophi I us) (SEQ ID NO: 40)或熱堅芽孢桿菌{Bacillus caldotenax) (SEQ ID NO:41)。合適的聚合酶還包括具有逆轉錄酶(RT) 活性和/或能夠摻入非常 規核苷酸如核糖核苷酸或其它2』 -修飾的核苷酸的那些。
儘管具有有效的3』 -錯配辨別力活性的熱穩定性DNA聚合酶尤其適合用於進行 PCR,具有有效的3』 -錯配辨別力活性的熱活性的、但不是熱穩定的DNA聚合酶也適於本發明的突變。
在一些實施方案中，DNA聚合酶是棲熱菌屬DNA聚合酶。例如，在一些實施方案中， DNA聚合酶與選自下列的聚合酶具有至少80%,優選至少90%,更優選至少95%的序列同一性(a)棲熱菌種ZOOTNA 聚合酶(ZO5) (SEQ ID NO:1);(b)水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq)(SEQ ID NO: 2);(c)絲狀棲熱菌DNA聚合酶(Tfi)(SEQ ID NO: 3);(d)黃棲熱菌DNA 聚合酶(Tfl) (SEQ ID NO:4);(e)棲熱菌種Spsl7DNA 聚合酶(Spsl7) (SEQ ID NO: 5);(f)嗜熱棲熱菌DNA聚合酶(Tth)(SEQ ID NO:6);和(g)Thermus caldophilus DNA 聚合酶(Tea) (SEQ ID NO: 7)。
在一些實施方案中，DNA聚合酶是棲熱袍菌DNA聚合酶。例如，在一些實施方案中， DNA聚合酶與選自下列的聚合酶具有至少80%,優選至少90%,更優選至少95%的序列同一性(a)海棲熱袍菌DNA聚合酶(Tma)(SEQ ID NO: 38);(b)那不勒斯棲熱袍菌DNA聚合酶(Tne)(SEQ ID NO: 39);在某些實施方案中，DNA聚合酶與SEQ ID NO:1具有至少80%，優選至少90%，更優選至少95%的序列同一性。在一些實施方案中，DNA聚合酶是棲熱菌種Z05 DNA聚合酶(Z05) DNA聚合酶(即SEQ ID NO:1)，除了 493位的胺基酸是除E或S以外的任何胺基酸。在一些實施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，493位的胺基酸是除E以外的任何 胺基酸。例如，在一些實施方案中，493位的胺基酸選自V，L, I, M, F，W, P, T, C，Y, N, Q, D, K, R, S，A, G或H。在一些實施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，493位的胺基酸是G,A, K或R。在一些實施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，493位的胺基酸是K。在一些實施方案中，DNA聚合酶是進一步包含580位的取代的Z05 DNA聚合酶，580位的胺基酸是除D或E以外的任何胺基酸。在一些實施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，580 位的胺基酸是除D以外的任何胺基酸。在一些實施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶， 580位的胺基酸選自L，G, T, Q, A, S，N, R和K。在一些實施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，580位的胺基酸是G。
突變的或改進的聚合酶可以包括其它非取代的修飾。一種這種修飾是熱可逆的共價修飾，其使酶失活，但是在高溫，如通常用於多核苷酸延伸的溫度下孵育後其被逆轉而激活酶。美國專利號5，773，258和5，677，152中描述了這種熱可逆的修飾的示例性試劑。
在一些實施方案中，通過在具有預定拷貝數的野生型BRAF V600R目標多核苷酸和預定拷貝數的突變型BRAF V600目標多核苷酸(數量上等於或少於野生型目標的拷貝數(例如，10，000或更少拷貝))的一個或多個反應混合物中在正向引物(與突變型序列完美匹配並且與野生型序列具有一個單一的3』A:C錯配)存在的情況下使用具有SEQ ID N0:35(野生型BRAF = SEQ ID NO:34)的核酸序列的突變型BRAF V600R目標多核苷酸而測定3』 -錯配活性。兩個或更多的反應混合物可以具有滴定的拷貝數的突變型BRAF V600R 目標多核苷酸(例如，在數個反應混合物中，1:5滴定，1:10滴定，例如，10，000拷貝，1000 拷貝，100拷貝，10拷貝，I拷貝，O拷貝)。如本文中所述，可以在預先選擇的單位時間，將本發明的聚合酶的3』 -錯配辨別力與參照聚合酶(例如，天然存在的或未修飾的聚合酶)的3』-錯配辨別力相比較。當與突變型等位基因完美匹配的引物接觸時，具有增強的 3』 -錯配辨別力的聚合酶將不能擴增野生型序列，或者，與天然存在的或未修飾的聚合酶相比，使用突變型等位基因特異性引物擴增野生型序列將需要更大的PCR循環數(即，表現出更高的Cp值)。
在各種其它方面，本發明提供了編碼本文所述的突變的或改進的DNA聚合酶的重組核酸，包含該重組核酸的載體，和/或用所述載體轉化的宿主細胞。在某些實施方案中， 所述載體是表達載體。包含這種表達載體的宿主細胞可用於本發明的生產突變的或改進的聚合酶的方法，所述方法通過在適於表達重組核酸的條件下培養宿主細胞。反應混合物和 /或試劑盒中可以包含本發明的聚合酶。重組核酸，宿主細胞，載體，表達載體，反應混合物和試劑盒的實施方案如上面和本文中所述。
在另一方面，提供了實施多核苷酸延伸的方法。該方法總體包括在適於引物延伸的條件下將本文所述的具有增強的3』 -錯配辨別力的DNA聚合酶與引物、多核苷酸模板以及三磷酸核苷接觸，從而產生延伸的引物。多核苷酸模板可以是例如RNA或DNA模板。三磷酸核苷可以包括非常規核苷酸如核糖核苷酸和/或標記的核苷酸。此外，引物和/或模板可以包括一個或更多個核苷酸類似物。在一些變型中，多核苷酸延伸方法是用於多核苷酸擴增的方法，包括在適於多核苷酸擴增的條件下將突變的或改進的DNA聚合酶與引物對、 多核苷酸模板以及三磷酸核苷接觸。多核苷酸延伸反應可以是，例如，PCR，等溫延伸，或測序(例如，454測序反應)。在一些實施方案中，引物延伸方法是用於實施聚合酶鏈式反應 (PCR)的方法。
本發明還提供了用於這種多核苷酸延伸方法中的試劑盒。通常，試劑盒包括至少一個提供本文所述的突變的或改進的DNA聚合酶的容器。在某些實施方案中，試劑盒進一步包括提供一種或更多種額外試劑的一個或更多個額外的容器。例如，在特定的變型中，一個或更多個額外的容器提供三磷酸核苷；適於多核苷酸延伸的緩衝劑；和/或在多核苷酸延伸條件下與預定的多核苷酸模板雜交的引物。
進一步提供了包含本發明的聚合酶的反應混合物。反應混合物也可以包含模板核酸(DNA和/或RNA)，一種或多種引物或探針多核苷酸，三磷酸核苷(包括，例如，脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，標記的核苷酸，非常規的核苷酸)，緩衝劑，鹽，標記(例如，突光團)。
本文描述了本發明的進一步的實施方案。
定義除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同的意義。儘管基本上與本文所述的那些相似的任何方法和材料都可用於本發明的實踐或試驗，但是僅僅描述了示例性的方法和材料。對於本發明的目的，下列術語定義如下。
術語「一(a)，」 「一(an)，」和「該(the) 」包括複數對象，除非上下文清楚地指出別的含義。
「胺基酸」是指可以併入肽、多肽或蛋白的任何單體單位。如本文所用，術語「胺基酸」包括下列20種天然或遺傳編碼的α-胺基酸丙氨酸(Ala或Α)、精氨酸(Arg或R)、天冬醯胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷胺醯胺(Gln或Q)、穀氨酸 (Glu或Ε)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(lie或I)、亮氨酸(Leu或L)、賴氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、絲氨酸(Ser或 S)、蘇氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和纈氨酸(Val或V)。在其中「X」 殘基沒有定義的情況下，這些應該定義為「任何胺基酸」。這20種天然胺基酸的結構見例如 Stryer 等，BioChemistry, 5th ed. , Freeman and Company (2002)。額外的胺基酸如硒代半胱氨酸和批咯賴氨酸也能夠被遺傳編碼(Stadtman (1996) 「Selenocysteine, 」 Annu Rev Biochem. 65:83-100 和 Ibba 等· ( 2002) 「Genetic code:1ntroducing pyrrolysine,，， Curr Biol. 12(13) :R464-R466)。術語「胺基酸」還包括非天然胺基酸、修飾的胺基酸(例如， 具有修飾的側鏈和/或骨架)和胺基酸類似物。參見，例如，Zhang等.(2004) 「Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells, 」 Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 101 (24) :8882-8887, Anderson 等·(2004) 「An expandedgenetic code with a functional quadruplet codon，，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 101 (20) : 7566-7571, Ikeda 等· (2003) 「Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo, 」 Protein Eng. Des. Sel. 16 (9) : 699-706, Chin 等·(2003) 「An Expanded Eukaryotic Genetic Code,」 Science 301(5635):964-967, James等· (2001) 「Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues, 」 Protein Eng. Des. Sel. 14(12) :983-991, Kohrer 等· (2001) 「Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells:A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins, 」 Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 98(25):14310-14315, Bacher 等· (2001) 「Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue,」 T. Bacteriol. 183(18) :5414-5425, Hamano-Takaku 等· (2000) 「A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine, 」 T. Biol. Chem. 275 (51) :40324-40328,和Budisa等· (2001) 「Proteins with {beta} -(thienopyrrolyl) alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids, 」 Protein Sc1. 10 (7):1281-1292。
為了進一步說明，胺基酸典型地為包括取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的羧基和一種或多種側鏈或基團，或這些基團的任一種的類似物的有機酸。示例性的側鏈包括，例如疏基、砸基、橫酸基、燒基、芳基、酸基、麗基、置氣基、輕基、餅、氰1基、齒素、酸餅、 鏈烯基、炔基、醚基、硼酸酯(borate)、硼酸鹽(boronate)、二氧磷基、膦醯基、膦、雜環、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺或這些基團的任何組合。其它代表性的胺基酸包括但不限於， 包含光敏交聯劑的胺基酸、金屬結合胺基酸、自旋標記的胺基酸、發螢光的胺基酸、包含金屬的胺基酸、含新官能團的胺基酸、與其它分子共價或非共價相互作用的胺基酸、對光不穩 (photocaged)和/或可光異構化的胺基酸、放射性胺基酸、包含生物素或生物素類似物的胺基酸、糖基化的胺基酸、其它碳水化合物修飾的胺基酸、包含聚乙二醇或聚醚的胺基酸、 重原子取代的胺基酸、化學可裂的和/或光可裂的胺基酸、包含碳連接糖的胺基酸、氧化還原活性胺基酸、包含氨基硫代酸的胺基酸和包含一個或多個毒性部分的胺基酸。
術語「適配子」是指識別並結合DNA聚合酶並有效抑制聚合酶活性的單鏈DNA，如美國專利號5，693，502中所述。
在本發明的DNA聚合酶上下文中的術語「突變體」是指相對於對應的天然存在的或未修飾的DNA聚合酶包含一個或多個胺基酸取代的多肽，典型為重組的。
在突變型聚合酶上下文中的術語「未修飾的形式」在本文中是用來定義本發明的突變型DNA聚合酶的術語術語「未修飾的形式」是指具有除指定為表徵突變型聚合酶的一個或多個胺基酸位置以外的突變型聚合酶的胺基酸序列的功能性DNA聚合酶。因此，在(a) 其未修飾的形式和(b) —個或多個特定胺基酸取代的方面提到突變型DNA聚合酶是指除特定的胺基酸取代以外，突變型聚合酶在特定的基序中另外具有與未修飾的形式相同的胺基酸序列。「未修飾的聚合酶」(和因此還有具有增強的3』-錯配辨別力的修飾的形式)可以包含額外的突變以提供期望的功能性，例如雙脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、 核糖核苷酸類似物、染料標記的核苷酸的改進的摻入，調節5』 -核酸酶活性，調節3』 -核酸酶(或校正) 活性等。因此，在實施本文所述的本發明時，DNA聚合酶的未修飾的形式是預先確定的。DNA 聚合酶的未修飾的形式可以是，例如野生型和/或天然存在的DNA聚合酶，或已經有意識地修飾過的DNA聚合酶。聚合酶的未修飾的形式優選熱穩定DNA聚合酶,如來自各種嗜熱菌的 DNA聚合酶以及與野生型或天然存在的熱穩定聚合酶具有基本上序列同一性的其功能性變體。這種變體可以包括，例如，嵌合DNA聚合酶，如美國專利號6，228，628和美國申請
發明者F.L.賴切特, K.A.鮑爾, T.W.邁爾斯, N.J.肖恩布倫納, J.桑菲利波 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司