黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶的製作方法

2023-08-07 23:52:36

專利名稱：：黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶的製作方法
技術領域：
：本發明涉及輔酶結合型葡萄糖脫氫酶及其用途。本發明具體涉及以黃素腺嘌呤雙核苷酸作為輔酶的葡萄糖脫氫酶，以及該酶的生產菌、該酶的製造方法、使用該酶的葡萄糖測定法等。
背景技術：
：近年來，廣泛應用的是採用電化學生物傳感器的簡易型自我血糖測定器。生物傳感器是在絕緣性的基板上形成電極、酶反應層而形成的。作為其中可以使用的酶，可以例舉葡萄糖脫氫酶(GDH)、葡萄糖氧化酶(GO)等。現已指出使用GO的方法容易受到測定試樣中所溶解氧的影響，溶解氧對測定結果產生影響這樣的問題。另一方面，作為不受溶解氧影響且在不存在NAD(P)下作用於葡萄糖的酶，已知有以吡咯查啉醌(PQQ)作為輔酶的GDH(PQQ-GDH)(例如，參照專利文獻1-3)。但是，PQQ-GDH中卻存在著如下問題(l)PQQ容易被酶解離，(2)對葡萄糖選擇性低，以及(3)由於一般存在於膜餾分中因此其提取分離操作有困難等。可是，近年來報導了，在醫院使用簡易血糖自我測定器的患者中發生低血糖等的病例。隨後的調查分析的結果是，PQQ-GDH與作為輸液成分而含有的麥芽糖反應，顯示出比實際血糖值更高的值，從而清楚了其是這種發病例的原因(醫藥品■醫藥用具等安全性情報206號(PharmaceuticalsandMedicalDevicesSafetyInformationNo.206)，平成16年(2004年)IO月，厚生勞動省醫藥食品局)。由於有這樣的事情，而迫切希望開發特異性作用於葡萄糖，尤其是與麥芽糖的作用性低的血糖測定用酶。而且，除了PQQ-GDH之外，作為不受溶存氧的影響且在不存在NAD(P)下與葡萄糖作用的酶，已知有以黃素腺嘌呤雙核苷酸作為輔酶的葡萄糖脫氫酶(本說明書中也稱為"FAD-GDH")。迄今為止分別從5米麴黴(Aspergillusoryzae)(非專利文獻1~4)和土麴黴(Aspergillusterreus)(專利文獻4)中獲得了FAD-GDH。專利文獻l:特開2000-350588號>5^才艮專利文獻2:特開2001-197888號公報專利文獻3:特開2001-346587號公報專利文獻4:國際公開第2004/058958號小冊子非專利文獻l:StudiesontheglucosedehydrogenaseofAspergillusoryzae.I.Inductionofitssynthesisbyp國benzoquinoneandhydroquinone，T.C.Bak，andR.Sato，Biochim.Biophys.Acta，139，265-276(1967).非專利文獻2:StudiesontheglucosedehydrogenaseofAspergillusoryzae.II.Purificationandphysicalandchemicalproperties，T.C.Bak，Biochim.Biophys.Acta，139，277-293(1967).非專利文獻3:StudiesontheglucosedehydrogenaseofAspergillusoryzae.III.Generalenzymaticproperties,T.C.Bak,Biochim.Biophys.Acta，146,317-327(1967).非專利文獻4:StudiesontheglucosedehydrogenaseofAspergillusoryzae.IV.Histidylresidueasanactivesite,T.C.Bak,andR.Sato，Biochim.Biophys.Acta，146,328-335(1967).
發明內容本發明是在上述背景下以提供可以更正確地測定葡萄糖量的新酶及其生產菌以及其用途作為課題。本發明人為了解決上述課題，首先關注於以黃素腺嘌呤雙核苷酸作為輔酶的葡萄糖脫氫酶(FAD-GDH)。而且，以廣泛微生物作為對象進行篩選的結果是，發現了在FAD-GDH的生產性上優異的菌抹。鑑定的結果判明為米麴黴(Aspergillusoryzae)。而且，還成功純化出該菌林生產的FAD-GDH，確定其各種性狀。根據所確定的各種性狀，判斷該FAD-GDH是一種新酶。而且，還表明該FAD-GDH對葡萄糖的選擇性優異，而且難以受到存在於反應系中的溶解氧的影響，可以更正確地測定試樣中的葡萄糖量。另一方面，確認了其它菌林(米麴黴)生產與該FAD-GDH同等的酶。進一步研究的結果是，成功確定了上述菌林所具有的FAD-GDH的胺基酸序列以及編碼它的基因的序列。本發明基於上述認識及成果，提供如下所示的黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶等。具備以下性狀的黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶，(1)作用催化在電子受體存在下氧化葡萄糖的羥基而生成葡萄糖酸-5-內酯的反應，(2)分子量通過SDS-聚丙烯醯胺電泳測得的分子量為約100kDa，通過凝膠過濾色鐠法測得的分子量為約400kDa,(3)底物特異性對麥芽糖、D-果糖、D-甘露糖和D-半乳糖的反應性低。中記載的黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶，將其對D-葡萄糖的反應性設為100%時對麥芽糖的反應性為5%以下。根據[1或[2]中記載的黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶，將其對D-葡萄糖的反應性設為100%時對D-半乳糖的反應性為5%以下。黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶基因，其由選自以下的(A)~(C)中任意一個DNA構成(A)編碼序列號20所示的胺基酸序列的DNA;(B)由序列號19所示的鹼基序列構成的DNA;(C)具有與序列號19所示的鹼基序列同源的鹼基序列，且編碼具有黃素腺噤呤雙核普酸結合型葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質的DNA。11]含有[10中記載的基因的載體。12導入了[10中記載的基因的轉化體。中記載的轉化體的步驟；(ii)回收產生的前述蛋白質的步驟。葡萄糖測定法，其特徵在於，使用[1~[8中任一項記載的黃素腺噤呤雙核普酸結合型葡萄糖脫氫酶測定試樣中的葡萄糖。表8,i，io-鄰二氮雜菲終濃度(mM)米麴黴來源的fad-gdh抑制效果(％)0050—25—10385211213.米麴黴BB-56林的鑑定(l)方法(l-l)菌林米麴黴BB-56(1-2)培養基組成參考Klich,M.A.(2002).Identi打cationofCommonAspergillusspecies.Utrecht:CentraalbureauvoorSchimmelcultures,116pp.的報告，調製出以下培養基。CYA培養基lgK2HP04，10mLCzapek濃縮物，5g酵母提取物(Difco),30g蔗糖，15g瓊脂(和光)，1000mL純化7jCCZ培養基lgK2HP04，10mLCzapek濃縮物，30g蔗糖，17.5g瓊脂(和光)，lOOOmL純化水CY20S培養基lgK2HP04,10mLCzapek濃縮物，5g酵母提取物(Difco),200g蔗糖，15g瓊脂(和光)，1000mL純化水MEA培養基20g麥芽提取物(Difco)，20g葡萄糖，lg細菌蛋白腖(Difco)，15g瓊脂(和光)，lOOOmL純化水PDA培養基使用馬鈴薯右旋糖瓊脂(榮研)。Czapek濃縮物30gNaNO3,5gKCl,5gMgS047H20，0.1gFeSO47H20,0.1gZnSO47H20,0.05gCuSO4'5H20，lOOmL純化水(1-3)表現性狀生長程度，於25C或37X:培養7天，測定菌落的直徑。在CYA培養基、CZ培養基、CY20S培養基、MEA培養基中觀察生長狀態(25匸，7天)。形態觀察在CYA培養基、於251C培養下進行(培養6~21天)。用掃描型電子顯微鏡進行分生孢子表面的觀察，在CYA培養基中25匸培養15天，通過鋨酸蒸汽固定進行處理，觀察。菌落的色調按照日本園芸植物標準色卡(財團法人日本色彩研究所發行)。(2)結果(2-1)生長程度(菌落的直徑)各種培養基中的生長程度(培養7天)如下表所示。[表9表9.各培養基中的生長程度(培養7天)培養基米麴黴BB-5625。C37。CCYA59-62誦3-5mmCZ33-38mm2-3mmCY20S49-56mm3-8mmMEA52-64mm2-3mmPDA44-54mm2-4mm(2-2)生長狀態各種培養基中的生長狀態(251C，培養7天)如下表所示。而且，顏色按照日本園芸植物標準色卡(財團法人日本色彩研究所發行)(括號內的數字為色卡編號)。[表1034表10各培養基中的生長狀態(25TC,培養7天)tableseeoriginaldocumentpage35(2-3)形態參考Raper，K.B.&Fennell,D.I.(1965).ThegenusAspergillus.Williams&WilkinsCo.,Baltimore,686pp、Kozakiewicz，Z.(1989).Aspergillusspeciesonstoredproducts.MycologicalPapers.No.161:1-188、Klich，M.A.(2002).IdentificationofCommonAspergillusspecies.Utrecht:CentraalbureauvoorSchimmelcultures，116pp.、Samson,R.A.Hoekstra,E.S.Frisvad,J.C&Filtenborg，O.(2002).Introductiontofood-andairbornefungi,6thedn，pp.64-97.Utrecht:CentraalbureauvoorSchimmelcultures，389pp.，則米麴黴BB-56其菌落顏色是濃綠黃色或暗綠黃色(表7),生長程度在CYA培養基(25C培養7天)中為59-62mm，在MEA培養基(25匸，培養7天)中為52-64mm(表6),分生孢子頭呈放射狀這樣的緩柱狀，分生孢子柄由頂嚢向下沒有中間變細，單列和2列的麴黴混合存在，頂嚢呈亞球形或瓶狀，其直徑為10~42jim,分生孢子為亞球形或球形，其大小為5.6~8.8x5.2~8.8nm,表面為光滑表面或略微粗糙的表面(表8)，由此確認其為米麴黴。[表11表ll.在CTA培養基中的形態tableseeoriginaldocumentpage3614.米麴黴BB-56來源FAD-GDH的鑑定(l)胺基酸序列的分析培養米麴黴(Aspergillusoryzae)BB-56，用6.所示的方法對獲得的純化酶進行等電點分離。將獲得的純化酶提供給採用凝膠PAGMiniDAIICHI7.5(第一化學藥品林式會社)的SDS-PAGE。使用轉印緩衝液1(0.3MTris(pH10.4)，20%甲醇)，轉印緩衝液2(30mMTris(pH10.4)，20%甲醇)，轉印緩衝液3(40mM6-氨基已酸(pH7.6)，20。/。甲醇)作為轉印緩沖液，將電泳後的凝膠轉印到PVDF膜上。轉印操作，在陽極側使用轉印緩衝液1，在含有膜的中央部位使用轉印緩衝液2，在陰極側使用轉印緩衝液3，用半乾轉印裝置，在定電流0.8mA/PVDF膜cm2，90min的條件下進行。轉印後進行CBB(考馬斯亮藍R-250)染色、切出該酶相應的條帶，作為N末端胺基酸序列分析用試樣。同樣，對電泳後的凝膠進行CBB染色，切出該酶相應的條帶，照原樣作為內部胺基酸序列分析用試樣。分析的結果清楚了N末端胺基酸序列和內部胺基酸序列。(2)通過N末端胺基酸序列進行的同源性檢索從特開2005-176602的申請人獲得特開2005-176602公開的米麴黴RIB40的基因信息中的全CDS序列，用資料庫軟體Kirokuver.3(WorldFusion公司)，實施依據已經清楚的N末端胺基酸序列的同源性檢索。其結果確認葡萄糖氧化酶前體與具有同源性的某種胺基酸序列(特開2005-176602的序列表中的序列號20494)之間有高同源性。同序列中還存在與通過內部胺基酸序列分析已經清楚的胺基酸序列一致的區域。根據這些事實，清楚了同序列(序列號l)對應於該酶的胺基酸序列。(3)由米麴黴BB-56提取基因組用裝入了100mlYPD培養基(1%酵母提取物,2%蛋白腖，2%葡萄糖)的廣口瓶將米麴黴BB-56於30X:培養一夜後，用布氏漏鬥和Nutsche吸濾瓶過濾培養液，獲得菌體。於-80lC冷凍後，通過冷凍乾燥獲得的重量約0.3g的菌體與1藥匙的海砂一起用乳缽、乳棒破碎，然後懸浮於12ml提取緩沖液(l%十六烷基三甲基銨，0.7MNaCl,50mMTris-HCl(pH8.0),10mMEDTA，1%巰基乙醇)中。在室溫下連續旋轉攪拌30分鐘後，加入等量的苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)溶液進行攪拌，進行離心分離(1500g，5分鐘，室溫)獲得了上清。在獲得的上清中加入等量的氯仿異戊醇(24:1)溶液進行攪拌，然後進行離心分離(1500g，5分鐘，室溫)。在所獲得的上清中緩緩加入等量的異丙醇。用70%乙醇對通過該處理析出的染色體DNA進行離心分離(20000g，10分鐘，4C)而獲得的沉澱進行清洗，然而進行真空乾燥。將這樣獲得的染色體DNA再次溶解到4mlTE中，加入200n110mg/mlRNaseA(Sigma-AldrichJapan公司)後，於37匸溫育30分鐘。然後，加入40H1的20mg/ml蛋白酶K,重組，PCRGrade(Rochediagnostics7〉司)溶液，於37匸溫育30分鐘後，加入等量的苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)溶液。攪拌後，進行離心分離(1500g，5分鐘，室溫)，從而獲得了上清。重複進行2次這種清洗操作後，在獲得的上清中加入等量的氯仿異戊醇(24:1)溶液進行攪拌，然後進行離心分離(1500g，5分鐘，室溫)。通過在所獲得的上清中加入其1/10容量的3MNaOAc(pH4.8)和2倍容量的乙醇，於-80X:冷卻使染色體DNA析出。通過離心分離(20000g,20分鐘，4X:)析出的染色體DNA進行回收。用70%乙醇清洗回收的染色體DNA後，真空乾燥，最後溶解於400pl的TE溶液，獲得了濃度為約lmg/ml的染色體DNA溶液。(4)合成引物的設計合成相當於編碼序列號1的胺基酸序列(特開2005-176602的序列表中的序列號20494所示的序列)的總鏈長為3226bp的RIB40林來源的基因序列(序列號2)的5，、3，兩末端序列的合成引物FG-F、FG-R(序列號3、4)。(5)通過PCR法進行的FAD-GDH基因的擴增以(3)中調製的染色體DNA作為模板來實施PCR反應。反應使用TAKARALA-TaqTM(takarabio公司)，反應液組成按照所附的常規方法。加入引物(FG-F、FG-R)，使之終濃度分別為0.4jiiM，加入模板基因組使之終濃度達到10ng/jLil,然後實施PCR。反應循環如下。即，重複進行35個由94匸反應2分鐘後，94X:反應30秒，60匸反應30秒，721C反應10分鐘構成的循環，最後在721C反應IO分鐘。反應結束後，於4"C保存試樣。(6)FAD-GDH基因的鹼基序列分析將PCR反應液提供給瓊脂糖電泳，分離擴增片段和引物，用GENECLEANIII(BIO101公司)從瓊脂糖凝膠中提取。將提取的擴增片段亞克隆到載體pUC19(Takarabio公司)的Smal位點。然後，對亞克隆的質粒pFG2的相當於該酶基因的區域實施鹼基序列分析。測序反應用BigDyeTMTerminatorv3.1循環測序試劑盒(Appliedbiosystemjapan公司)，按照製品的使用說明書進行測序反應。分析中使用ABIPRISM310測序儀(Appliedbiosystemjapan乂>司)。為了實施該酶基因的鹼基序列分析，合成了合成引物FG-l(序列號5)、FG-2(序列號6)、FG-3(序列號7)、FG-4(序列號8)、FG-5(序列號9)、FG-6(序列號10)、FG-7(序列號11)、FG-8(序列號12)、FG-9(序列號13)、FG-10(序列號14)、FG-11(序列號15)、FG-12(序列號16)、M13-M5(序列號17)、M13-RV2(序列號18)。鹼基序列分析的結果是，清楚了序列號19所示的總鏈長為3241bp的米麴黴BB-56來源的該酶基因序列。根據該酶基因序列預測的該酶基因的胺基酸序列示於序列號20。產業上利用的可能性本發明的FAD-GDH底物特異性優異，可以更為正確地測定葡萄糖量。因此，本發明的FAD-GDH可以說適於血糖值的測定、食品(調味料、飲料等)中的葡萄糖濃度的測定等中。本發明不限於上述發明的實施方式和實施例說明。在不脫離專利請求的範圍的記載，而本領域技術人員可以容易想到的範圍內的各種變化形態都包含於本發明中。本說明書中援引公開的論文、公開特許公報和特許公報等內容的全部。權利要求1、具備以下性狀的黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶(1)作用催化在電子受體存在下氧化葡萄糖的羥基而生成葡萄糖酸-δ-內酯的反應，(2)分子量通過SDS-聚丙烯醯胺電泳測得的分子量為約100kDa，通過凝膠過濾色譜法測得的分子量為約400kDa，(3)底物特異性對麥芽糖、D-果糖、D-甘露糖和D-半乳糖的反應性低。2、根據權利要求1所述的黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶，將其對D-葡萄糖的反應性設為100%時對麥芽糖的反應性為5%以下。3、根據權利要求1或2所述的黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶，將其對D-葡萄糖的反應性設為100%時對D-半乳糖的反應性為5%以下。4、根據權利要求1~3中任一項所述的黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶，將其對D-葡萄糖的反應性設為100%時對D-果糖和D-甘露糖的反應性均為5%以下。5、根據權利要求1~4中任一項所述的黃素腺噤呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶，其還具備以下性狀(4)最適pH:7附近，(5)最適溫度:60"C附近，(6)pH穩定性:在pH3.0~7.0的範圍內穩定，(7)溫度穩定性:在40n以下穩定。6、根據權利要求1~5中任一項所述的黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶，其還具備以下性狀(8)Km值對於D-葡萄糖的Km值為約8mM。7、根據權利要求1~6中任一項所述的黃素腺噤呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶，其是來源於米麴黴的酶。8、根據權利要求1~7中任一項所述的黃素腺噪呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶，其特徵在於，具有序列號20所示的胺基酸序列、或與該胺基酸序列同源的胺基酸序列。9、具有生產黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶能力的保藏編號為NITEBP-236的米麴黴BB-56。10、黃素腺嘌呤雙核香酸結合型葡萄糖脫氫酶基因，其由選自以下的(A)~(C)中任意一個DNA構成(A)編碼序列號20所示的胺基酸序列的DNA;(B)由序列號19所示的鹼基序列構成的DNA;(C)具有與序列號19所示的鹼基序列同源的鹼基序列，且編碼具有黃素腺噪呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質的DNA。11、含有權利要求10所述的基因的栽體。12、導入了權利要求10所述的基因的轉化體。13、黃素腺噪呤雙核苦酸結合型葡萄糖脫氫酶的製造方法，其包括以下的步驟(1)和(2)、或步驟(i)和(ii):(1)培養具有生產權利要求7所述的黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶能力的米麴黴的步驟；(2)由培養後的培養液和/或菌體回收黃素腺噤呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶的步驟；(i)在產生所述基因編碼的蛋白質的條件下培養權利要求12所述的轉化體的步驟；(ii)回收產生的所述蛋白質的步驟。14、葡萄糖測定法，其特徵在於，使用權利要求1~8中任一項所述的黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶測定試樣中的葡萄糖。15、葡萄糖測定用試劑，其特徵在於，含有權利要求1~8中任一項所述的黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶。16、葡萄糖測定用試劑盒，其含有權利要求15所述的葡萄糖測定用試劑。全文摘要本發明提供了一種黃素腺嘌呤雙核苷酸結合型葡萄糖脫氫酶，該酶(1)具有催化在電子受體存在下氧化葡萄糖的羥基而生成葡萄糖酸-δ-內酯的反應的作用，(2)通過SDS-聚丙烯醯胺電泳測得的分子量為約100kDa，通過凝膠過濾色譜法測得的分子量為約400kDa，(3)對麥芽糖、D-果糖、D-甘露糖和D-半乳糖的反應性低。而且，還提供了生產該酶的米麴黴。而且，還提供了採用該酶的葡萄糖測定法、葡萄糖測定用試劑和葡萄糖測定用試劑盒。文檔編號C12N9/04GK101454443SQ200780019640公開日2009年6月10日申請日期2007年5月25日優先權日2006年5月29日發明者田中憲彰,結城健介申請人:天野酶株式會社