馬鐵菊頭蝠瘦素蛋白及其cDNA序列的製作方法

2023-08-08 00:38:31

專利名稱：馬鐵菊頭蝠瘦素蛋白及其cDNA序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及痩素蛋白，具體涉及一種來源於馬鐵菊頭蝠(i /2/"o/op/z^
)的痩素蛋白及其cDNA序列。
背景技術：
痩素蛋白(leptin)是1994年發現的一個由167個胺基酸組成的小蛋白， 由脂肪組織分泌的蛋白質類激素，目前研究結果已經證實其它組織也能產生， 包括胎盤、大鼠的骨胳肌、大鼠的胃、人的乳腺上皮細胞、人和鼠的腺垂體等。
痩素蛋白是肥胖相關的信號，脂肪組織的反饋信號作用到腦中心，控制飲 食行為和活動(代謝和運動)，是ob (obese)基因的產物。脂肪組織產生的瘦 素蛋白經血液運輸到腦，與下丘腦的受體作用後通過控制飲食攝入和能量消耗 來控制哺乳動物的體重，被認為是最具有潛力的減肥藥物之一。
痩素蛋白除了能夠降低食慾，控制體重，減少體內脂肪含量外，還可傳遞 動物體內外能量貯存信號到大腦中樞，影響神經內分泌系統，促進動物生殖系 統發育和獲得生育能力，調控動物初情期的啟動、性成熟和妊娠等生殖活動， 調節胎兒胎盤，使動物提前發情，縮短髮情周期，調節葡萄糖代謝，脂類代謝， 調節血壓、大腦和骨骼發育，傷口癒合，細胞分化增殖，參與造血作用，機體 免疫調節等功能。瘦素功能的多樣性尤其在能量調節方面的關鍵作用，也賦予 瘦素更大的產品開發的價值。
痩素蛋白的開發和利用已深入到許多領域包括減肥藥物的開發以及減肥 產品的深加工，治療糖尿病藥物開發，治療高血壓藥物開發，治療脂肪肝藥物開發等等，隨著對其功能認識的不斷深入，關於leptin產業化前景將更加廣闊。

發明內容
本發明的目的在於提供一種來源於馬鐵菊頭蝠(i^/"o/c^/ms /e庁wm^"/m^)的痩素蛋白，為今後開發痩素基因工程產品奠定物質基礎。 本發明的另一個目的在於提供含有上述痩素蛋白完整編碼區的cDNA序列。
本發明的上述目的通過如下方案予以實現
本發明提供一種痩素蛋白，該痩素蛋白為如下(i )或(ii)所述任一項 的蛋白質
(i ) 一種具有SEQIDNO: 3所示胺基酸序列的蛋白質；
(ii)在胺基酸序列(i )中，由缺失、取代或加成1個或幾個胺基酸的
胺基酸序列所組成，且與胺基酸序列(i )的蛋白質具有相同功能的蛋白質。 本發明的痩素蛋白優選具有SEQIDNO: 3所示的胺基酸序列。 本發明還提供編碼上述痩素蛋白的cDNA序列，該cDNA序列為編碼如
下(i )或(ii)所述任一項蛋白質的cDNA序列
(i ) 一種具有SEQIDNO: 3所示的胺基酸序列的蛋白質；
(ii )在胺基酸序列(i )中，由缺失、取代或加成1個或幾個胺基酸的氨
基酸序列所組成，且與胺基酸序列(i )的蛋白質具有相同功能的蛋白質。 上述編碼痩素蛋白的cDNA序列優選其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 本發明的痩素蛋白來自於馬鐵菊頭蝠(i^Z"o/o/ /n^y^rwme^^""m)，提取
馬鐵菊頭蝠脂肪組織總RNA反轉錄後作為模板，根據已知哺乳動物痩素蛋白
序列保守區設計簡併引物進行簡併PCR擴增，測序後得到本發明痩素蛋白的全長cDNA序列，並對該全長cDNA序列進行胺基酸分析，得到本發明馬鐵 菊頭蝠痩素蛋白為SEQIDNO: l所示的胺基酸序列，總共164個胺基酸，其 中前21個胺基酸為信號肽序列。
與現有技術相比，本發明具有如下優點
1. 本發明從馬鐵菊頭蝠的脂肪組織中獲得了一種痩素蛋白的全長cDNA, 並進行了蛋白表達，通過利用GST重組表達技術和凝血酶酶切除去GST標記 物，成功獲得了馬鐵菊頭蝠瘦素蛋白，此外對該蛋白進行細胞活性分析，結果 表明本發明的馬鐵菊頭蝠痩素蛋白具有明顯的脂肪降解活性，可用於製備減肥 藥物、治療糖尿病藥物、治療高血壓藥物以及治療脂肪肝藥物等；
2. 本發明的痩素蛋白是來源於馬鐵菊頭蝠的，而馬鐵菊頭蝠是一種冬眠動 物，冬眠動物較之其他動物能更加好的增加體內能量使用率，使其燃燒更多脂 肪，從而使體內脂肪控制在一定量，因此來源於冬眠動物馬鐵菊頭蝠的痩素蛋 白也具有更加好的脂肪降解能力。


圖1為馬鐵菊頭蝠痩素蛋白全長cDNA序列的PCR擴增電泳其中，l為分子量標記，2為PCR擴增產物；
圖2為實施例2中重組質粒表達產物的SDS-PAGE檢測電泳其中，1為分子量標記，2為重組表達菌未誘導對照樣品，3為重組表達
菌IPTG誘導3h後樣品，箭頭所指處為新的表達條帶；
圖3為實施例3中蛋白表達的SDS-PAGE檢測電泳其中，l為分子量標記，2為過柱純化但未經凝血酶切對照樣品，3為過
柱純化且經凝血酶切的樣品，4為GST， 5為痩素蛋白；圖4為馬鐵菊頭蝠痩素蛋白MTT活性檢測結果柱狀其中，1為GST對照組，2為馬鐵菊頭蝠痩素蛋白組，3為空白對照組，
**: PO.01;
圖5為馬鐵菊頭蝠痩素蛋白LDH活性檢測結果柱狀其中，1為GST對照組，2為馬鐵菊頭蝠瘦素蛋白組，3為空白對照組，
**: PO.Ol。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的描述，但具體實施例並不對本發 明做任何限定。
實施例1馬鐵菊頭蝠瘦素蛋白全長cDNA序列的獲得
1、 模板製備
按照RNAiso試劑盒(TakaRa公司)說明書提取馬鐵菊頭蝠(i /z/"o/op/n^ /ewwme^//"wm)脂肪組織總RNA，並採用反轉錄試劑盒，以該總RNA為模板， 進行反轉錄試驗得到下述PCR擴增用模板。
2、 引物設計
根據已知的哺乳動物痩素蛋白序列保守區設計簡併引物，如下所示 Primer 1，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示； Primer 2，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
3、 PCR擴增
PCR擴增反應體系(50^1) : PCR擴增模板2pl，引物Primer 1/ Primer 2 (10pM)各lpl， lOXTaq Polymerase mix (TaKaRa公司)5^1， ddH2041|^l; PCR擴增反應條件94。C預變性5min， 94。C變性l min， 54。C退火90s， 72匸延伸2min， 30個循環，最後72'C延伸5 min。 4、 PCR產物的連接、轉化和測序
將上述PCR反應產物經膠回收、連接、轉化等常規操作後克隆入pMD-19T 載體(市售)，陽性克隆經藍白斑篩選和PCR鑑定後，送測序公司進行測序， 同時對測序結果進行胺基酸序列分析。
測序結果及胺基酸序列分析結果表明，本實施擴增所得馬鐵菊頭蝠痩素蛋 白的全長cDNA為495 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示，該cDNA序列 編碼164個胺基酸編碼，其胺基酸序列如SEQIDNO: 3所示，其中前21個氨基 酸為信號肽序列。
實施例2重組表達載體的構建
根據實施例l所得馬鐵菊頭蝠痩素蛋白基因序列設計引物(P1和P2)，擴 增不含信號肽序列的全部編碼區，並引入BamH I / Sal I限制酶切位點用於重組 表達載體的構建。
Pl，其核苷酸序列如SEQIDNO: 6所示；
P2，其核苷酸序列如SEQIDNO: 7所示。
上述PCR擴增反應體系可參照PCR反應試劑盒說明書，其具體反應條件 為94。C預變性5min， 94°C變性l min， 55。C退火90s， 72。C延伸2min， 30個 循環，最後72'C延伸5min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，可見到清晰的目 的片段擴增條帶，如圖1所示，擴增出的片段長度約432bp，與設計的擴增片段 長度相符，且未出現非特異性擴增。
將上述PCR擴增產物經膠純化回收後，用BamHI和Sal I於37"C消化過夜， 隨後與PGEX-4T-2載體(Invitrogen)連接構建重組表達質粒，挑選陽性克隆進行測序，測序結果與原序列相同，表明擴增克隆後的基因未發生突變，而且
開放閱讀框架(ORF)與載體ORF—致，融合蛋白約372個胺基酸(含GST)， 理論分子量為41.7 kDa。
將上述經測序驗證序列讀碼框正確的陽性克隆轉入大腸桿菌表達菌BL21 (市售)內，經lmmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導3 h，將重組表達 菌誘導前、後菌體裂解物一起經SDS-PAGE檢測，電泳檢測結果如圖2所示， 與重組表達菌誘導前的SDS-PAGE電泳圖對比後，發現重組表達菌誘導後在42 kDa處出現了一條新的表達條帶(圖中箭頭所指條帶)，該條帶的分子量大小 與理論推導值相符，說明誘導表達產物為GST-Leptin重組蛋白。
本實施例所涉及的膠回收、雙酶切消化、載體連接、大腸桿菌轉化以及 IPTG誘導表達等技術均採用本領域技術人員的常規操作。
實施例3蛋白表達與純化
將實施例2中製備得到的含有馬鐵菊頭蝠痩素蛋白基因重組表達質粒陽 性克隆的大腸桿菌BL21，按l: 100 (菌液LB+培養基，體積比)接種於含 有氨苄青黴素的LB+培養基(酵母提取物5g，蛋白腖10g，瓊脂15g， NaCl 5g， ddH20至l升，pH=7.4，氨苄抗生素1%)中，37°C， 190rpm，培養約3h。當 OD6oo=0.6~l時，加入IPTG至工作濃度為0.6mM，於28。C， 190rpm，誘導 3h。
將上述誘導後的菌液於5000g， 4'C離心10min收集菌體，菌體用PBS洗 2遍，期間5000g， 4-C離心10min;按照每2~5ml菌液加入28ml裂解液、50^1 溶菌酶、30-40^1苯甲基磺醯氟(PMSF)(終濃度lOO)iM)對菌體裂解0.5~lh; 裂解好的菌體於4'C或冰浴破碎(工作時間3s，間隔時間5s， 300W) 150次，約20 25min，然後於4。C離心Cl2000g， 10min)收集上清；上清用0.45pm 慮膜過濾後，作為下一步GST親和純化的上樣品。
本實施例的GST親和純化的填料採用High-Affinity GST Resin (市售)， 其純化具體操作可參考相關試劑說明書填料4ml，先用25 30mlPBS洗柱， 然後加入前述已製備好的上樣品過柱，流速控制2 4s/滴；再用20倍柱床體積 的PBS清洗純化柱；還原型穀胱甘肽洗脫新鮮配製0.154g穀胱甘肽+50ml Tris-HCl (50mM， PH8.0),每次3ml，流速4 5s/滴；最後用PBS清洗純化柱
對上述過柱樣品進行超濾濃縮，可採用5000rpm， 4'C離心30min。 按照每lmg蛋白加入10U凝血酶比例，採用凝血酶(市售)對上述濃縮樣 品進行常溫酶切3h，酶切後的產物再次進行親和純化以去除GST (具體操作同 前述的GST親和純化)，回收過柱樣品再次進行超濾濃縮(操作同前)，從而最 終得到馬鐵菊頭蝠痩素蛋白。將該濃縮上清液、進行凝血酶酶切的樣品一起進 行SDS-PAGE檢測，檢測結果如圖3所示，從圖3可以看出，過柱純化且經過凝 血酶酶切後的樣品得到兩條帶， 一條在26KD位置，根據現有材料可知該條帶 為GST (GST的分子量為26KD)，另外一條帶在16KD的位置，這與理論值(本 發明的痩素蛋白不含信號肽的成熟肽序列為143個胺基酸，而143個胺基酸編碼 蛋白約為15.7KD)相符，說明馬鐵菊頭蝠痩素蛋白與GST標籤成功分離，同時 蛋白濃度檢測結果也表明分離、回收的馬鐵菊頭蝠痩素蛋白濃度和純度達到細 胞實驗要求。
實施例4 細胞活性分析
本實施例首先採用傳統細胞培養的操作培養3T3-L1前脂肪細胞，然後以培養好的3T3-L1前脂肪細胞作為實驗樣品，對實施例3分離純化出的馬鐵菊 頭蝠痩素蛋白(15.7KD)進行MTT檢測和LDH檢測。
本實施例的MTT檢測以及LDH檢測，均採用本領域技術人員的常規操 作，將馬鐵菊頭蝠痩素蛋白(10—6M)孵育3T3-Ll前脂肪細胞24h，同時每個 檢測均設兩個平行實驗對照， 一個是不含3T3-L1前脂肪細胞的空白對照組， 一個是採用GST (1(T6M)孵育3T3-L1前脂肪細胞24h的對照組。
細胞活性分析結果
1. 圖4給出馬鐵菊頭蝠瘦素蛋白MTT活性檢測結果，從圖中可以看出， 空白對照組的數據為0，用馬鐵菊頭蝠瘦素基因重組蛋白(10—SM)孵育3T3-L1 前脂肪細胞24h後，活細胞比率(MTT)下降27.8%，與GST對照組(6.6%) 相比差異極顯著(PO.01);
2. 圖5給出馬鐵菊頭蝠痩素蛋白LDH活性檢測結果，從圖中可以看出， 空白對照組的數據為0，用馬鐵菊頭蝠瘦素基因重組蛋白(10—SM)孵育3T3-L1 前脂肪細胞24h後，脂肪細胞的乳酸脫氫酶釋放比率(LDH)顯著升高(5.9c/。)， 明顯高於GST對照(0.2%) (PO.Ol)。
根據圖4和圖5的對比結果，說明本發明的馬鐵菊頭蝠痩素蛋白具有明顯 的脂肪降解活性。馬鐵菊頭蝠瘦素蛋白及其cDNA序列序列.txt SEQUENCE LISTING
<110〉廣東省昆蟲研究所
<120〉馬鐵菊頭蝠瘦素蛋白及其cDNA序列

7
<170〉 Patentln version 3. 5
1
495
<212〉 DNA 一
<213〉 馬鐵菊頭蝠(Rhinolophus ferru卿uinum)
<400〉 1
atgcgttgtggatcgctgtgccagttcctgtgcctttggctctgtctgtcctgcgttgaa60
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2
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<212〉 DNA 一
<213〉 馬鐵菊頭蝠(Rhinolophus ferruraequin咖)
<220〉 〈221〉( <222〉:DS (1)…(492)
〈400> : stg cgt Met Arg 12 tgt Cysgga Glytcg Ser 5ctg Leutgc Cyscag Ginttc Phectg l>eu 10tgc Cysctt tgg etc tgt ctg Leu Trp Leu Cvs Leu 化48
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gtg etc Val Leuate lie 35犯g Lysacg Thran lieate lieacc Thr 40agg Arg￡LtC lieaat Asnggc ate tcg ca_c atg Gly lie Ser His Met 45144
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ttc cac Phe His 65tct Sergtc Valctg Leuggt Gly 70ttg Leutec Seratg Metatg Metaac Asn 75gag ate 1:t:g gag acc Glu lie Leu Glu Thr 80240
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tct aat Ser Asnga_c Aspatg Met 100gag Glu犯c Asnetc Leuca^ GinC3C His 105ctt Leuetc Leucaa ctg ctg gcc tec Gin Leu Leu Alai Ser 110336馬鐵菊頭蝠瘦素蛋白及其cDNA序列序列.txt
tcc aag ggc tgt cac ttc cac cag gcc gag ggc ttg cag tec ctg aag Ser Lys Gly Cys His Phe His Gin Ala Glu Gly Leu Gin Ser Leu Lys
115
120
125
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150 155 160
145
age cct ggg tgc tga Ser Pro Gly Cys
<210〉 3
164
PRT 一
馬鐵菊頭蝠(Rhinolophus ferrumequinum) <■〉 3
Met Arg Cys Gly Ser Leu Cys Gin Phe Leu Cys Leu Trp Leu Cys Leu
1
5
10
15
Ser Cys Val Glu Ala Val Pro Thr Gin Lys lie Gin Asp Asp Thr Lys 20 25 30
Val Leu lie Lys Thr lie lie Thr Arg lie Asn Gly lie Ser His Met 35 40 45
Gin Ser Val Ser Lvs Tyr Met Val Thr Gly Leu Asp Phe Leu Pro Gly 50 55 60
Phe His Ser Val Leu Gly Leu Ser Met Met Asn Glu lie Leu Glu Thr
65
70
75
80
Tyr Gin Lys lie Leu lie Asn Leu Pro Ser Arg Asn Leu Met Gin lie ' 85 90 95
Ser Asn Asp Met Glu Asn Leu Gin His Leu Leu Gin Leu Leu Ala Ser 100 105 110
Ser Lys Gly Cys His Phe His Gin Ala Glu Gly Leu Gin Ser Leu Lys 115 120 125
Gly Ser lie Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Val Leu 130 135 140
Asn Gly Leu Lys Ala Phe Leu Gin Thr Met Leu Arg Gin Leu Glu Phe 145 150 155 160
Ser Pro Gly Cys
<210〉 4
<211〉 27
〈212〉 腿 〈213>人工序列
4
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■
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12馬鐵菊頭蝠瘦素蛋白及其cDNA序列序列.txt aaga3gmrasa tccyrggrag gaaaatg 27
5
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腿
<213〉 人工序列
5
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〈210〉 6
27
DNA
人工序列
<400〉 6
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7
22
腿 人工序列
<400〉 7
ccgtcgactc agcacccagg gc 2權利要求
1、一種瘦素蛋白，該瘦素蛋白為如下(i)或(ii)所述任一項的蛋白質(i)一種具有SEQ ID NO3所示胺基酸序列的蛋白質；(ii)在胺基酸序列(i)中，由缺失、取代或加成1個或幾個胺基酸的胺基酸序列所組成，且與胺基酸序列(i)的蛋白質具有相同功能的蛋白質。
2、 根據權利要求1所述痩素蛋白，其特徵在於該痩素蛋白具有SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列。
3、 根據權利要求2所述瘦素蛋白，其特徵在於該蛋白質胺基酸序列中的 前21個胺基酸為信號肽序列。
4、 一種編碼痩素蛋白的cDNA序列，其特徵在於該cDNA序列編碼如下 (i )或(ii)所述任一項蛋白質(i ) 一種具有SEQIDNO: 3所示的胺基酸序列的蛋白質； (ii )在胺基酸序列(i )中，由缺失、取代或加成1個或幾個胺基酸的氨 基酸序列所組成，且與胺基酸序列(i )的蛋白質具有相同功能的蛋白質。
5、 根據權利要求4所述的cDNA序列，其特徵在於該cDNA序列具有SEQ ID NO: l所示核苷酸序列。
6、 一種含有權利要求4所述cDNA序列的質粒。
7、 一種含有權利要求6所述質粒的轉化體。
全文摘要
本發明公開一種馬鐵菊頭蝠的瘦素蛋白及其cDNA序列，該瘦素蛋白為一種具有SEQ ID NO3所示胺基酸序列的蛋白質，或在胺基酸序列(i)中，由缺失、取代或加成1個或幾個胺基酸的胺基酸序列所組成，且與胺基酸序列(i)的蛋白質具有相同功能的蛋白質。本發明採用GST重組表達技術和凝血酶酶切除去GST標記物，從冬眠動物——馬鐵菊頭蝠中提取得到瘦素蛋白，細胞活性分析結果表明該馬鐵菊頭蝠瘦素蛋白具有明顯的脂肪降解活性，可用於製備減肥藥物、治療糖尿病藥物、治療高血壓藥物以及治療脂肪肝藥物等。
文檔編號C07K14/575GK101619101SQ200910039438
公開日2010年1月6日 申請日期2009年5月13日 優先權日2009年5月13日
發明者何靈江, 原麗紅, 左學國, 張樹義, 林本夫, 陳金平 申請人:廣東省昆蟲研究所