一種在固體發酵中進行固定化em菌的方法
2023-08-08 05:12:06 1
專利名稱：一種在固體發酵中進行固定化em菌的方法
技術領域：
本發明涉及細菌的固體發酵以及固定化微生物技術中的物理吸附法。具體的說是一種在固體發酵中進行固定化EM菌的方法。
背景技術：
固定化微生物技術是用化學的或者物理的手段和方法將游離微生物限制或定位在某一特定空間範圍內，保留其固有的催化活性，且能夠被重複和連續使用的現代生物工程技術。由於固定化微生物技術能夠大大提高細菌對水質的淨化效果，因而廣泛用於汙水處理、景觀水體淨化和水產養殖水質調節等方面。目前，固定化微生物的製備方法很多，一般分為物理固定法(主要有包埋法、吸附法和包絡法)和化學固定法(主要有共價結合法和交聯法)兩大類，其中吸附法和包埋法是比較常用的微生物固定化方法，吸附法又分為物理吸附和離子吸附兩種。物理吸附是使用具有高吸附能力的物質，如矽膠、活性炭、多孔玻璃、碎石、木屑、卵石、鉛炭、硅藻土、多孔磚等吸附劑，通過將吸附載體浸泡在液體微生物製劑中，微生物被吸附到載體的毛細孔來達到固定化。現有的物理吸附法，工藝比較繁瑣，也比較耗時，載體必須經過菌劑的浸泡、乾燥、再浸泡的多次重複操作才能達到理想的吸附效果。雖然可用作吸附劑載體的材料很多，但目前常用的吸附劑都存在某些不足，如碎石、木屑、卵石、鉛炭、硅藻土、多孔磚等載體，雖然資源廣，來源容易，價格也低廉，但吸附效果不理想。而矽膠、活性 炭、多孔玻璃等載體材料，雖然吸附效果較好，但不容易加工製作，價格也較高，難以大規模使用。因此，研究更高效，更經濟環保，工藝簡單，省時省力的微生物固定化方法以及尋找更好的載體材料，仍然是這一領域的重點。針對目前微生物固定技術存在的問題，人們對固定化的工藝以及載體的固定效果等做了很多改進。人們嘗試通過將一些載體浸泡在液體發酵劑中，進行簡單的液體發酵將細菌固定化，但由於發酵難以進行攪拌，細菌的發酵效果並不好，而且培養出來的細菌大部分都分散在培養劑中，難以被載體吸附，因此固定化效果不太理想。馬放等，同時培養法與吸附法微生物固定化對比[J]《哈爾濱工業大學學報》2012年04期，為一種適用於菌絲球生物質載體高效、快捷的微生物固定化方法，分別採用同時培養法和吸附法將高效苯胺降解細菌JH-9固定於黑麴黴菌Y3形成的生物質載體菌絲球上。馬海榮等，XM固態菌劑載體選擇的初步研究[J]《哈爾濱工業大學學報》2005年02期，採用實驗所選擇的最適條件，將通過網孔尺寸為0.420mm分樣篩的麥麩、麥殼、鋸末、活性炭和磚粉按一定比例混合，將含水量控制在50% (質量分數)左右，在30°C進行發酵和固定化製成固態菌劑，每克含菌量可達到4X 10~8 5X 10~8。但其仍然是一種固體發酵工藝，固定化效果也不太理想。可見，現有的微生物固定方法雖然多種多樣，但都存在一定的不足，不管在工藝上還是在載體材料上都必須進行改進。EM菌是一種由光合細菌、乳酸桿菌、酵母菌和放線菌四大菌群組成的有益複合細菌。迄今為止，EM菌已被日本、美國、巴西、法國、臺灣等90多個國家和地區認可和使用。我國1992年從日本引進EM菌，目前已被廣泛用於水產養殖水質調節、養殖病害防治和汙水淨化等領域。EM菌產品一般為水劑和粉劑，由於水劑和粉狀菌劑的細菌在水中容易變成游離狀態，難以形成優勢種群，細菌存活時間短，因而大大降低其作用效果。
發明內容
本發明的目的在於提供一種在固體發酵中進行固定化M菌的方法。M菌在固體發酵過程中通過載體的吸附以及在菌劑製作過程中通過培養劑的粘附雙重作用固定在載體上，使得固定化EM菌劑的製作能夠在一個工藝流程中完成。本發明解決上述技術問題的技術方案如下。一種在固體發酵中進行固定化EM菌的方法，包括以下步驟:I)載體的製備 選取油質少，木質鬆軟的木屑，木屑經60 V以下低溫烘乾或者進行曬乾後，用網孔尺寸為0.425mm的粉碎機進行粉碎2次，使木屑變成纖維木粉，用作EM菌固定化的載體；2)發酵料配製2.1)培養劑的配製:以甘蔗糖蜜作為發酵配方的碳源和粘稠劑，配製成培養齊U，培養劑的重量百分數配方為:甘蔗糖蜜20 30%、腐植酸4 6%、NH4CI8 12%、KH2PO41 3 %、複合酶0.7%、微量元素0.3 %、自來水48 % 66 % ;其中，複合酶使用普通的獸用複合酶，微量元素根據常規配方自行配製；配製時，首先放入水，然後慢慢加入甘蔗糖蜜，攪拌均勻後，再一一加入其他原料，配製的培養劑具有一定的粘稠性；2.2)發酵料配製:將步驟2.1)的培養劑與含活菌數為10 40億個/g的液體EM菌種或者含活菌數為10 40億個/g的固體EM菌種按重量百分數10%的接種量進行接種；如果是液體菌種，在配製培養劑時自來水的加入量要比配方的量少重量百分數10%，如果是固體菌種，先加入一定重量的自來水，自來水的重量按照培養劑配方的固體與水分比例，根據接種的固體菌種重量來算出，然後將菌种放入培養劑中並攪拌均勻。然後再與木粉載體進行混合製成固體發酵料，發酵料的pH值為7.5 ;3)發酵製備EM菌劑將上步驟的發酵料裝入發酵容器，適當封蓋後，在20°C -40°C的溫度下進行發酵20 50天，發酵完成，製得EM菌劑；4)固定化的固體EM菌劑的製備將上步驟發酵好的EM菌劑在50°C的低溫下烘乾，在烘乾過程中，具有粘稠性的培養劑將EM菌粘附固定在載體上，製作成固定化的固體EM菌劑。上述步驟I)中油質少，木質鬆軟的木屑中的木材種類為油質較少且鬆軟的杉木、楊木和柳木，要求木屑新鮮乾淨，不發黑。上述步驟I)中粉碎機為木屑粉碎機。上述步驟2)中甘蔗糖蜜為糖廠製糖的副產品，飼料級，含水分的重量百分數為35%。上述步驟2)中配製發酵料時，水分的含量通過用手緊攝發酵料，有液體從指縫滲出但不下滴為準。上述步驟3)中發酵容器的容積必須在20L以上，可以是發酵桶、發酵罐和水泥池。
上述步驟3)中在發酵過程中載體將培養出來的EM菌吸附在載體纖維孔隙中，發酵好的EM菌菌劑可以聞到酒精的芳香氣味。本發明和現有技術相比的有益效果是:1.本發明EM菌的固定化是在固體發酵過程中完成，解決了目前固定化技術先發酵然後再固定化分兩步進行的繁瑣工藝，縮短了操作時間，提高了工作效率，節省了生產成本，比現有技術中只靠單一的吸附固定效果更好，解決了現有技術的吸附固定化細菌容易脫落問題。2.本發明在菌劑乾燥中又通過粘附作用進行固定化，因此效果明顯，製成的菌劑是一種優質的固定化EM菌產品。3.固定化載體由木屑經過微細粉碎製成，其具有效果好，來源廣，價格低廉，對細菌無副作用等特點。4.本發明通過載體的吸附和培養劑的粘附相結合製成的固定化EM菌製劑，使細菌能牢固地固定在載體纖維上，在水體中能夠形成局部的種群優勢，因此，對水質的作用時間長，效果明顯。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步描述。實施例1最優的實施例。在固體發酵中進行固定化EM菌的方法，操作步驟如下:1.選取新鮮、乾淨的杉木木屑，經60°C以下低溫烘乾後，選用鞏義市張升機器有限公司生產的500型號帶篩木粉機，選用網孔尺寸為0.425mm的篩片粉碎2次，使木屑變成絮狀纖維木粉。2.配製培養劑的重量百分數配方為:甘蔗糖蜜25%、腐植酸5%、NH4CI10%、KH2P042%、複合酶0.7%、微量元素0.3%、自來水57%。配製時，首先放入水，然後慢慢加入甘蔗糖蜜，攪拌均勻後，再一一加入其他原料，配製好的培養劑具有一定的粘稠性。接入活菌數為30億個/g的固體EM菌種，接種量重量百分數為10%，先加入菌種重量4.05倍的自來水，然後將菌种放入培養劑中並攪拌均勻。將步驟I製備的載體和接種好的培養劑進行混合併充分攪拌均勻製成發酵料，發酵料的溼度以用手緊攝發酵料，有液體從指縫滲出但液體不下滴為準。步驟3.將步驟2制好的發酵料裝入容積為I立方米發酵罐中，裝料時，放入高度20公分的發酵料後，攤平壓實，再放入20公分再攤平壓實，直到裝滿，然後進行封閉發酵，封閉時留出小孔隙以便排出氣體。發酵的環境溫度保持30°C，初始發酵PH值7.5，發酵過程不需要翻動發酵料也不需要添加營養液。發酵30天，打開封蓋，可以聞到很濃的帶有酸甜氣味的酒精芳香氣味，取中間發酵料，可見發酵料已由原來淡黃色變為深黃色，取少量發酵料，加入少量超純水並高速振蕩，取上層液體放到顯微鏡下觀察，可見到大量的細菌時發酵完成。4.發酵好的EM菌劑在50°C的低溫下烘乾，由於培養劑在發酵完成後還具有一定的粘稠性， 載體表面的EM菌就被牢固地粘附在纖維上，變成固定化的固體菌劑。通過載體的吸附和發酵劑的粘附雙重固定化的EM菌劑，其活菌數達到120億個/g，成為一種優質的固定化EM菌製劑產品。實施例2在固體發酵中進行固定化菌的方法，操作步驟如下:1.選取新鮮、乾淨的楊木木屑，經曬乾後，選用鞏義市張升機器有限公司生產的500型號帶篩木粉機，選用網孔尺寸為0.425mm的篩片粉碎2次，使木屑變成絮狀纖維木粉。2.配製培養劑的重量百分數配方為:甘蔗糖蜜20%、腐植酸4%、NH4CISKH2PO4I %、複合酶0.7%、微量元素0.3 %、自來水66 %。配製時，首先放入水，然後慢慢加入甘蔗糖蜜，攪拌均勻後，再一一加入其他原料，配製好的培養劑具有一定的粘稠性。接入活菌數為50億個/g的固體EM菌種，接種量重量百分數為10%，先加入菌種重量5.62倍的自來水，然後將菌种放入培養劑中並攪拌均勻。將步驟I製備的載體和接種好的培養劑進行混合併充分攪拌均勻製成發酵料，發酵料的溼度以用手緊攝發酵料，有液體從指縫滲出但液體不下滴為準。3.將步驟2制好的發酵料裝入容積為20L發酵桶中，裝料時，放入高度20公分的發酵料後，攤平壓實，再放入20公分再攤平壓實，直到裝滿，然後進行封閉發酵，封閉時留出小孔隙以便排出氣體。發酵的環境溫度保持40°C，初始發酵PH值7.5，發酵過程不需要翻動發酵料也不需要添加營養液。發酵20天，打開封蓋，可以聞到很濃的帶有酸甜氣味的酒精芳香氣味，取中間發酵料，可見發酵料已由原來淡黃色變為深黃色，取少量發酵料，加入少量超純水並高速振蕩，取上層液體放到顯微鏡下觀察，可見到大量的細菌時發酵完成。4.發酵好的EM菌劑在50°C的低溫下烘乾乾燥，由於培養劑在發酵完成後還具有一定的粘稠性，載體表面的EM菌就被牢固地粘附在纖維上，變成固定化的固體菌劑。通過載體的吸附和發酵劑的粘附雙重固定化的EM菌劑，其活菌數達到50億個/g，成為一種優質的固定化EM菌製劑產品。
實施例3在固體發酵中進行固定化EM菌的方法，操作步驟如下:1.選取新鮮、乾淨的柳木木屑，經60°C以下低溫烘乾後，選用鞏義市張升機器有限公司生產的500型號帶篩木粉機，選用網孔尺寸為0.425mm的篩片粉碎2次，使木屑變成絮狀纖維木粉。2.配製培養劑的重量百分數配方為:甘蔗糖蜜30%、腐植酸6%、NH4CI12%、KH2P043%、複合酶0.7%、微量元素0.3%、自來水38%。配製時，首先放入水，然後慢慢加入甘蔗糖蜜，攪拌均勻後，再一一加入其他原料，配製好的培養劑具有一定的粘稠性。接入活菌數為10億個/g的液體EM菌種，接種量重量百分數為10%，由於是液體菌種，所以前面配製培養劑時自來水的加入量要比配方的量少重量百分數10%，將菌种放入培養劑中並攪拌均勻。將步驟I製備的載體和接種好的培養劑進行混合併充分攪拌均勻製成發酵料，發酵料的溼度以用手緊攝發酵料，有液體從指縫滲出但液體不下滴為準。3.將步驟2制好的發酵料裝入容積為10立方米水泥池中，裝料時，放入高度20公分的發酵料後，攤平壓實，再放入20公分再攤平壓實，直到裝滿，然後進行封閉發酵，封閉時留出小孔隙以便排出氣體。發酵的環境溫度保持20°C，初始發酵PH值7.5，發酵過程不需要翻動發酵料也不需要添加營養液。發酵50天，打開封蓋，可以聞到很濃的帶有酸甜氣味的酒精芳香氣味，取中間發酵料，可見發酵料已由原來淡黃色變為深黃色，取少量發酵料，加入少量超純水並高速振蕩，取上層液體放到顯微鏡下觀察，可見到大量的細菌時發酵完成。4.發酵好的EM菌劑經過50°C的低溫烘乾乾燥，由於培養劑在發酵完成後還具有一定的粘稠性，載體表面的EM菌 就被牢固地粘附在纖維上，變成固定化的固體菌劑。通過載體的吸附和發酵劑的粘附雙重固定化的EM菌劑，其活菌數達到80億個/g，成為一種優質的固定化EM菌製劑產品。
權利要求
1.一種在固體發酵中進行固定化EM菌的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)載體的製備 選取油質少，木質鬆軟的木屑，木屑經60 V以下低溫烘乾或者進行曬乾後，用網孔尺寸為0.425mm的粉碎機進行粉碎2次，使木屑變成纖維木粉，用作EM菌固定化的載體； 2)發酵料配製 2.1)培養劑的配製:以甘蔗糖蜜作為發酵配方的碳源和粘稠劑，配製成培養劑，培養劑的重量百分數配方為:甘蔗糖蜜20 30%、腐植酸4 6%、NH4CI8 12%、KH2PO4I 3%、複合酶0.7%、微量元素0.3%、自來水48% 66% ;其中:複合酶使用普通的獸用複合酶，微量元素根據常規配方自行配製；配製時，首先放入水，然後慢慢加入甘蔗糖蜜，攪拌均勻後，再一一加入其他原料，配製的培養劑具有一定的粘稠性； 2.2)發酵料配製:將步驟2.1)的培養劑與含活菌數為10 40億個/g的液體EM菌種或者含活菌數為10 40億個/g的固體EM菌種按重量百分數10%的接種量進行接種；如果是液體菌種，在配製培養劑時自來水的加入量要比配方的量少重量百分數10%，如果是固體菌種，先加入一定重量的自來水，自來水的重量按照培養劑配方的固體與水分比例，根據接種的固體菌種重量來算出，然後再與木粉載體進行混合製成固體發酵料，發酵料的PH值為 7.5 ; 3)發酵製備EM菌劑 將上步驟的發酵料裝入發酵容器，適當封蓋後，在20°C-40°C的溫度下進行發酵20 50天，發酵完成，製得EM菌劑； 4)固定化的固體EM菌劑 的製備 將上步驟發酵好的EM菌劑在50°C的低溫下烘乾，在烘乾過程中，具有粘稠性的培養劑將EM菌粘附固定在載體上，製作成固定化的固體EM菌劑。
2.根據權利要求1所述的一種在固體發酵中進行固定化EM菌的方法，其特徵在於，所述步驟I)中油質少，木質鬆軟的木屑中的木材種類為油質較少且鬆軟的杉木、楊木和柳木。
3.根據權利要求1所述的一種在固體發酵中進行固定化EM菌的方法，其特徵在於，所述步驟I)中粉碎機為木屑粉碎機。
4.根據權利要求1所述的一種在固體發酵中進行固定化EM菌的方法，其特徵在於，所述步驟2)中甘蔗糖蜜為糖廠製糖的副產品，飼料級，含水分的重量百分數為35%。
5.根據權利要求1所述的一種在固體發酵中進行固定化EM菌的方法，其特徵在於，所述步驟2)中配製發酵料時，水分的含量通過用手緊攝發酵料，有液體從指縫滲出但不下滴為準。
6.根據權利要求1所述的一種在固體發酵中進行固定化EM菌的方法，其特徵在於，所述步驟3)中發酵容器的容積必須在20L以上，可以是發酵桶、發酵罐和水泥池。
7.根據權利要求1所述的一種在固體發酵中進行固定化EM菌的方法，其特徵在於，所述步驟3)中在發酵過程中載體將培養出來的EM菌吸附在載體纖維孔隙中，發酵好的EM菌菌劑可以聞到酒精的芳香氣味。
全文摘要
本發明公開了一種在固體發酵中進行固定化EM菌的方法，方法經1)載體的製備、2)發酵料配製、3)發酵製備EM菌劑、4)固定化的固體EM菌劑的製備四步驟製得固定化的EM菌。本發明和現有技術相比的有益效果是1.本發明縮短了操作時間，提高了工作效率，節省了生產成本，比現有技術中只靠單一的吸附固定效果更好，解決了現有技術的吸附固定化細菌容易脫落問題。2.本發明通過載體的吸附和培養劑的粘附相結合製成的固定化EM菌製劑，使細菌能牢固地固定在載體纖維上，在水體中能夠形成局部的種群優勢，因此，對水質的作用時間長，效果明顯。
文檔編號C12N11/02GK103146672SQ20131003282
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月29日 優先權日2013年1月29日
發明者周宇, 朱佳傑, 甘西, 唐瞻楊, 譚芸 申請人:廣西壯族自治區水產研究所