一種解脲脲原體pcr檢測試劑盒及其檢測方法
2023-08-08 02:42:11
專利名稱：一種解脲脲原體pcr檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及微生物檢測領域，具體涉及一種解脲脲原體菌株PCR檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
解脲脲原體⑴reaplasmaurealyticum簡稱UU)是人類泌尿生殖道常見的寄生菌之一，在特定環境下可致病。在人體的定植可有二次上升趨勢，即分娩時由母體產道感染新生兒，以後迅速減少；從性生活開始又漸增多。近年來，解脲脲原體所致泌尿生殖道感染日益受到重視，是引起非淋菌性尿道炎的病原體之一。現已被列為性傳播疾病的病原體。解脲脲原體是泌尿生殖道感染的常見病原體之一，一般為表面感染，大多不侵入血液。致病機制尚不十分清楚，目前認為可能與侵襲性酶和毒性產物有關。解脲脲原體在一定條件下能引起泌尿系統感染和不孕症。解脲脲原體多寄生在男性尿道、陰莖包皮和女性陰道。若上行感染，可引起男性前列腺炎或附睪炎、女性陰道炎、宮頸炎，並可感染胎兒導致流產、早產及低體重胎兒，也能引起新生兒呼吸道和中樞神經系的感染。常用幾種檢測方法MDI分析法作為一種活體檢查的方法，MDI分析支原體的手段在業內一直倍受爭議，該技術存在下列不足在泌尿生殖系統疾病中能檢出的支原體高達7種之多，對支原體的類型鑑別存在困難；L-型細菌形態與支原體都缺乏細胞壁，兩者在鏡下難以分辨；國內尚無規範的實驗方案，檢測結果的標準化也有待完善，但該技術具備經濟、直觀和疾速的典型特徵。我們的經驗和研究證實，MDI分析能降低檢查成本。縮短檢查時間，且可以直接觀察病原體，對檢測UU有一定的應用價值，但僅適合於初篩。培養法是目前臨床上發現傳染源的主要途徑和手段，是解脲脲原體診斷和治療方案的重要依據，目前仍然以培養法為「金標準」。UU固體培養是公認的檢測UU的金標準。 《全國臨床檢驗操作規程》(第3版)對UU培養和藥敏方法作了明確規定。由於固體培養對實驗環境和操作人員要求較高，實驗周期較長，同時藥敏檢測方法——瓊脂稀釋法比較繁瑣，在一定程度上限制了其臨床應用。免疫螢光檢測這是最早使用的檢測抗原的方法，通常是在固體培養的菌落上加入特異的螢光標記的一抗或二抗，在螢光顯微鏡下觀察結果。但不易區分螢光染色的菌落和未染色的菌落；需要特殊的螢光顯微鏡，不易普及使用；免疫螢光抗體非特異性的反應會影響實驗結果及實驗結果保存時間短等缺點。免疫酶檢測這種方法類似於菌落免疫螢光試驗，只是用酶標抗體代替螢光標記抗體，操作步驟基本相同，普通顯微鏡下觀察結果。但它需要的抗血清較多，染色過程中會衝掉菌落，抗原抗體反應影響因素複雜都制約了其應用。免疫結合檢測這種方法是在免疫酶法的基礎上發展而來的，其關鍵的一步是採用硝酸纖維素膜作為載體，利用該膜對蛋白質較好的吸附力，並與免疫酶方法相結合，完成對支原體表面抗原的測定。但免疫結合檢測的敏感性不高，並且固定在NC膜上的支原體有時會減少特異的染色而加強了各支原體之間的交叉反應。
發明內容
本發明目的是採用聚合酶鏈式反應及分子信標螢光探針技術對解脲脲原體基因中高保守特異性核酸序列進行擴增檢測，從而判斷解脲脲原體存在，對解脲脲原體感染的輔助診斷。本發明的技術方案為提供一種解脲脲原體PCR檢測試劑盒，包括PCR反應液，其特徵在於，所述PCR反應液包括引物和螢光探針，所述引物分為上遊引物A和下遊引物A 所述上遊引物A的核苷酸序列為5』 -GCTAAATCAACAGACGGT-3』 ；所述下遊引物A的核苷酸序列為5』 -GCTGCACTTACATCAGCTG-3』 ；所述螢光探針A的核苷酸序列為5，-TGCGGTTTACGAAATTGAAAACT-3，。優選的，所述試劑盒還包括DNA提取液、dNTPs、t ap酶、UNG酶、DNA聚合酶、陽性對照，陰性對照、定量參比品。優選的，所述dNIPs 包括 dATP、dCTP、dGTP、dCTP。優選的，引入了一個人工構建的內參照系統用於避免檢測結果假陰性的內參照系統包括內參探針、引物和內參DNA，所述內參照系統為擬南芥內參照系統，所述內參照系統包括上遊引物B:SEQ ID NO. 5、下遊引物B :SEQ ID NO. 6、螢光探針SEQ ID NO. 7，具體如下上遊引物B:5' -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3 『下遊引物B 5 『 -CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3 『螢光探針B:5' -HEX-CTTCTTATAGTCACTGCACTAAACTGGAT-TAMRA-3'。優選的，所述螢光探針A的5』端標記FAM螢光基團，3』端標記BHQ淬滅基團。本發明的另一種技術方案為提供一種解脲脲原體PCR檢測方法，其中PCR擴增的靶序列為SEQ ID NO. 4，PCR擴增所用引物為上遊引物序列如SEQ ID NO. 1，下遊引物序列如=SEQ ID N0. 2，螢光探針序列如=SEQ ID N0. 3。作為上述方法的進一步設置，所述螢光探針A的5』端標記FAM螢光基團，3』端標記TAMRA淬滅基團。本發明的有益效果為利用解脲脲原體基因中高保守特異性核酸序列進行核酸擴增檢測，從而判斷解脲脲原體的存在。本試劑盒具有DNA提取效果好，操作簡單、耗時短 O 3小時)，結果客觀可靠，儀器自動收集和分析數據。靈敏度和特異性高。最低檢出限為5.0X102COpieS/mL。使用了擬南芥內參照系統它在解脲脲原體基因組和人類基因組中均無同源基因，因此可作為內參照以檢測每次PCR反應中是否有PCR抑制物存在，從而確保 PCR結果的可信性。
圖1 靈敏度參比品檢測結果圖；圖2 標準曲線參比品檢測結果圖3:標準曲線；圖4 :UU特異性結果圖。
具體實施例方式本發明採用聚合酶鏈式反應(PCR)及分子信標螢光探針(MoleculA. r beacon)技術對解脲脲原體⑴reaplasmaurealyticum簡稱UU)基因中高保守特異性核酸序列進行擴增檢測，從而判斷解脲脲原體的存在。從而指導臨床醫生對解脲脲原體感染的病人用藥，幫助預後判斷。上述高保守特異性核酸序列如SEQ ID NO. 4所示。內參照原理試劑盒設置了內參照基因，即擬南芥基因。它在解脲脲原體基因組和人類基因組中均無同源基因，因此可作為內參照以檢測每次PCR反應中是否有PCR抑制物存在，從而確保PCR結果的可信性。當內參照結果為陽時，表示PCR反應體系以及操作正常； 因此當目的基因結果為陰時，內參照結果為陽就顯得十分重要了 ；但當目的基因結果為陽時，內參照的擴增曲線較目的基因擴增曲線要推遲，或是內參照結果為陰都是正常的；然而目的基因和內參照基因結果都為陰時，該實驗視為無效，需再重複。陽性對照原理每次試驗都需同時做陽性對照。陽性對照結果為陽，表明對靶基因的檢測系統是正常的；而當結果為陰時，表明該次實驗無效，需重複。陰性對照原理為證明有否汙染存在，每次試驗也需同時做陰性對照。陰性對照結果為陰，表明本次試驗無汙染；如結果為陽，則表明該次實驗無效，需重複。引物和探針本發明所應用的引物、探針均委託Sigma和Biosearch公司合成，並經Sigma質檢合格(含質譜鑑定)；其中UU基因保守序列最優引物、探針序列組合如下所述上遊引物A的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1 5』 -GCTAAATCAACAGACGGT-3』 ；所述下遊引物A的核苷酸序列為SEQ ID NO. 2 5， -GCTGCACTTACATCAGCTG-3，；所述螢光探針A的核苷酸序列為SEQ ID N0. 3 5， -TGCGGTTTACGAAATTGAAAACT-3，。本試劑盒的擬南芥內參照系統(Sue)，所述內參照系統包括上遊引物B :SEQ ID NO. 5、下遊引物B =SEQ ID N0. 6、螢光探針=SEQ ID N0. 7，具體如下上遊引物B 5 『 -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3 『下遊引物B 5 『 -CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3 『螢光探針B 5' -HEX-CTTCTTATAGTCACTGCACTAAACTGGAT-TAMRA-3'。實施例1表1 試劑盒組成
權利要求
1.一種解脲脲原體PCR檢測試劑盒，包括PCR反應液，其特徵在於，所述PCR反應液包括引物和螢光探針A，所述引物分為上遊引物A和下遊引物A ；所述上遊引物A的核苷酸序列為5』 -GCTAAATCAACAGACGGT-3』 ；所述下遊引物A的核苷酸序列為5，-GCTGCACTTACATCAGCTG-3』 ；所述螢光探針A的核苷酸序列為5』 -TGCGGTTTACGAAATTGAAAACT-3』。
2.按權利要求1所述的解脲脲原體PCR檢測試劑盒，其特徵在於，還包括DNA提取液， dNTPs、tap酶、UNG酶、陽性對照、陰性對照、定量參比品。
3.按權利要求2所述的解脲脲原體PCR檢測試劑盒，其特徵在於，所述dNIPs包括 dATP、dCTP、dGTP、dCTP。
4.按權利要求1所述的解脲脲原體PCR檢測試劑盒，其特徵在於，引入了一個人工構建的內參照系統用於避免檢測結果假陰性的內參照系統包括內參探針、引物和內參DNA，所述內參照系統為擬南芥內參照系統，所述內參照系統包括上遊引物B :SEQ ID NO. 5、下遊引物 B =SEQ ID NO. 6、螢光探針=SEQ ID NO. 7，具體如下上遊引物 B 5 『 -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3 『下遊引物 B 5 『 -CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3 『螢光探針B 5 『 -HEX-CTTCTTATAGTCACTGCACTAAACTGGAT-TAMRA-3『。
5.按權利要求1所述的解脲脲原體PCR檢測試劑盒，其特徵在於，所述螢光探針的5』 端標記FAM螢光基團，3，端標記BHQ淬滅基團。
6.一種解脲脲原體PCR檢測方法，其特徵在於，其中PCR擴增的靶序列為SEQ ID NO. 4， PCR擴增所用引物為上遊引物A序列如=SEQ ID NO. 1，下遊引物A序列如=SEQ ID NO. 2， 螢光探針A序列如SEQ ID NO. 3。
7.按權利要求6所述的解脲脲原體PCR檢測方法，其特徵在於，所述螢光探針A的5』 端標記FAM螢光基團，3，端標記TAMRA淬滅基團。
全文摘要
本發明涉及微生物檢測領域，具體涉及一種解脲脲原體PCR檢測試劑盒。本發明目的是提供一種解脲脲原體PCR檢測試劑盒及其檢測方法，檢測臨床樣品中解脲脲原體特有的核酸序列，從而達到快速判斷解脲脲原體存在的目的。為實現上述目的，本發明的技術方案為提供一種解脲脲原體PCR檢測試劑盒，包括DNA提取液、PCR反應液、dNTPs、tap酶、UNG酶、陽性對照、陰性對照、定量參比品，所述PCR反應液包括引物A和螢光探針A，所述引物分為上遊引物A和下遊引物A。本試劑盒具有靈敏度和特異性高、穩定、及時、操作方便等優點。
文檔編號C12Q1/04GK102409098SQ20111038012
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月25日 優先權日2011年11月25日
發明者何華東, 姚雪 申請人:泰普生物科學(中國)有限公司