一種小分子肽及其應用的製作方法

2023-08-08 00:05:06

專利名稱：：一種小分子肽及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及有機化學領域，具體涉及一種肽，特別是含5-ll個胺基酸的肽。
背景技術：
：肺癌在我國城市噁心腫瘤的發病中已居於首位，且其發病率仍呈明顯上升趨勢。由於肺癌常常發生胸膜轉移引起胸水，因此胸水脫落細胞檢查是一種常用的診斷方法，具體方法如下①臨床新鮮抽取的不同原發病患者的胸水50ml，離心1000轉/分鐘X5分鐘，留取離心細胞lml;②用吸管吸取約滴在玻璃片上，用另一個玻璃片進行刮片；③涼幹後，75%酒精+甲醛固定10分鐘；④蘇木素染色1分鐘；⑤伊紅染色1分鐘；⑥樹膠封片。但是該方法不敏感，在大量胸水中查找癌細胞，猶如大海撈針，而且胸水中細胞成分雜，有間皮細胞、巨噬細胞等，加上癌細胞不典型，影響了該方法的確診率。本發明人長期致力於肺癌的治療和診斷工作，曾利用"一個珠子一個化合物"的組合化學肽庫篩選得到一個可特異性識別非小細胞肺癌細胞(A549)的小分子肽cNGQGEQc，並發現該肽中，對特異性粘附A549作出主要貢獻的結構是-NGXG-以及六肽長度。但是A549僅是肺癌細胞中的一種，該小分子肽能否與肺癌患者胸水中癌細胞發生特異性結合，尚不清楚。
發明內容本發明要解決的技術問題是提高胸水脫落細胞檢査法診斷肺癌的確診率。本發明解決上述技術問題的技術方案是一種小分子肽，該小分子肽的胺基酸序列為cdGIGPQc(SEQNO.l);其中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，I表示L型異亮氨酸，P表示L型脯氨酸，Q表示L型穀氨酸。本發明小分子肽可用常規的固相合成法(LamKS，SalmonSE，HershEM，HrubyVJ，KazmierskiWM，KnappRJ.A^w"1991，15《82)製備，具體方法如下取表面具有NH2活性基團的樹脂珠子，先用二甲基醯胺洗滌，然後浸泡在二甲基醯胺中使所述珠子充分腫脹，接著按照所述小分子肽的胺基酸序列依次將相應的胺基酸偶聯到所述珠子上並形成肽鏈，最後將珠子上連接的肽洗脫即可。本發明小分子肽能與肺癌細胞特異性結合，將其連接在固相中可用於分離胸水中的肺癌細胞，有助於提高胸水脫落細胞檢查法診斷非小細胞肺癌的確診率。本發明小分子肽用於分離胸水中的非小細胞肺癌細胞的方法是將本發明小分子肽固定在載體上，然後與胸水脫落細胞在DMEM培養液中共培養12小時後收集所述的載體，再用3DMEM培養液洗滌後用胰蛋白酶分離粘附在所述小分子肽上的細胞，即可。所述的載體應是易於分離且性質穩定的固體物質，如樹脂珠子。樹脂珠子具有性質穩定和表面可修飾的特點，是一種非常合適的小分子肽載體；此外，樹脂珠子還具有可磁化的特點，很容易利用其磁性將非小細胞肺癌細胞從胸水脫落細胞中分離出來。為了更好地實施上述方法，本發明還提供一種用於分離非小細胞肺癌細胞的樹脂珠子，該樹脂珠子由表面具有NH2活性基團的樹脂珠子與本發明小分了肽通過-CO-NH-連接構成。本發明所述樹脂珠子可採用固相合成法，按照本發明小分子肽的序列依次將相應胺基酸偶聯到樹脂珠子上即可。用本發明所述樹脂珠子分離胸水中非小細胞肺癌細胞的方法是將本發明所述樹脂珠子與胸水脫落細胞在函EM培養液中共培養12小時，然後收集所述的樹脂珠子，先用DMEM培養液洗滌，再用胰蛋白酶消化分離得到非小細胞肺癌細胞。本發明磁性樹脂珠子上具有對非小細胞肺癌細胞具有很高特異性的小分子肽，用於輔助胸水脫落細胞檢査法診斷非小細胞肺癌，可將確診率提高至13.51%。圖1是SSCP-PCR擴增產物的電泳圖，其中泳道M是marker,1是AGT突變的肺癌細胞株的PCR產物，2是GGT突變的肺癌細胞株的PCR產物，3是AGT和GGT突變的肺癌細胞株的PCR產物，4是A549標準細胞株的PCR產物，5是受檢細胞的PCR產物。具體實施例方式1、利用固相合成方法製備本發明所述的樹脂珠子(1)稱取lg表面具有NH2活性基團的樹脂珠子，用二甲基醯胺洗滌3次，然後在二甲基醯胺浸泡至珠子充分腫脹；(2)加入半胱氨酸和N，N'-二異丙基碳二亞胺，室溫下反應2小時後，用DMF洗滌珠子5次，接著加入20%的哌啶，在室溫下反應5min，再加入20%的DMF,反應15min，完全脫去Fmoc保護基；(3)按步驟(2)方法依次偶聯天冬氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸、穀氨醯胺和半胱氨酸；(4)將連接完最後一個胺基酸的珠子經25%的三氟乙酸洗滌一次，蒸餾水洗滌3次，即得本發明所述的樹脂珠子。2、本發明小分子肽的獲得將上述方法獲得的本發明所述的樹脂珠子用蒸餾水洗滌，即可獲得本發明小分子肽。3、用肺癌細胞A549驗證珠子上小分子肽的生物活性4①抽取正常健康人血3ml，加入約1000個肺癌細胞A549，充分混合；②吸取100^1(約7500個)本發明珠子，PBS液洗滌1次，75%酒精洗滌2次，培養液DMEM洗滌1次，分別加入盛有2mlDMEM培養液的6孔培養板內；同時設無小分子肽的珠子作為對照。③吸取①中準備的細胞300pl(約100個肺癌細胞)，加入②中6孔培養板，培養箱(37GC,5%C02)中培養12h;將上述6孔培養板中珠子，集中到25ml的離心管中，收集珠子，胰蛋白酶分離粘附珠子上細胞，HE染色細胞，顯微鏡下顯示細胞核大，染色深，符合肺癌細胞A549形態。單鏈構像多態性-多聚酶鏈反應(SSCP-PCR)技術分析珠子上粘附細胞k-ras基因突變A.採用以下兩對引物擴增K-ras基因第12外顯子首次PCR的引物為Pl:5'-GGCCTGCTGAAAATGACTGA-3、，P2:5'-GCACCAGTAATATGCATA-3';PCR反應體系反應液體積50nl，其中4XdNTP2pl，Taq酶l.OU，10Xbuffer2^1，引物各5Opmol/L，模板DNA(珠子上粘附細胞中提取的DNA)2^1;PCR反應條件95。Clmin55。Clmin>30個循環，72°Clmin72。C延伸10min。第二次PCR的引物P3:5'-GACTGAATATAAACTTGTGGT-3'，P3:5、-TGTTGGATCAT-ATTCGTC-3、；PCR反應體系取首次PCR反應產物lpl作為模板，其餘試劑和反應液體積同上；PCR反應條件95°Clmin、55°Clmin、30個循環，72°Clmin72°C延伸10min。用2°/。的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。B.根據瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，取lnl第二次PCR反應產物，加適當的蒸餾水與等體積的加樣緩衝液(100%甲醯胺，0.05°/。二甲苯青，0.05%溴酚蘭)混合，以已知AGT和GGT突變的肺癌細胞株及正常肺組織的擴增產物作為對照。90'C變性5min，立即置冰浴。聚丙烯醯胺凝膠電泳，電壓200V，常溫下3h。採用銀染試劑盒銀染10。/。乙醇+冰乙酸+FEC固定20min，銀染色10-20min，10。/。乙酸終止固定10min，衝水晾乾封膜。結果如圖l所示，待測標本珠子上粘附細胞出現k-ms基因突變，與對照A549細胞和標準對照一致，提示珠子上粘附的細胞為A549細胞，表明載有小分子肽的樹脂珠子有粘附肺癌細胞的生物活性。4、樹脂珠子上小分子肽的特異性粘附非小細胞肺癌細胞的驗證(1)實驗材料A549(肺腺癌)、Calu-l(肺鱗癌)、H178(肺腺鱗癌)、DMS53(小細胞肺癌)、HBE(永生化支氣管上皮細胞)、MCF-7(乳腺癌)、PC3(前列腺癌)、SKOV-3(卵巢癌)、HT-29(結腸癌)、HepG2(肝癌)、HL-60(白血病)、Jurkat(淋巴瘤)、Raji(淋巴瘤)和Hs68(纖維母細胞)。(2)實驗方法將上述不同種類的細胞株分別與小分子肽cdGIGPQc珠子混合，置於37'C和5%C02的培養箱中培養48小時，顯微鏡下隨機計數100個珠子，計算每種細胞與小分子肽的結合百分率，以此評價小分子肽與細胞粘附結合的特異性。(3)結果如表1所示，本發明小分子肽與非小細胞肺癌細胞的陽性結合率明顯高於其他癌細胞，尤其是與A549和Calu-l的結合率更高達95%以上，可見，本發明小分子肽可特異性結合非小細胞肺癌細胞。6表1tableseeoriginaldocumentpage75、本發明小分子肽在分離患者胸水中非小細胞肺癌細胞的應用(1)實驗方法對臨床已確診的肺癌病例、間皮瘤、胃癌、結腸癌、乳腺癌、肺炎和胸膜結核患者的胸水進行常規細胞學診斷和用本發明樹脂珠子聯合常規細胞學診斷，同時設常規細胞學診斷對照。其中，常規細胞學診斷和用本發明樹脂珠子聯合常規細胞學診斷方法如下①臨床新鮮抽取的不同原發病患者的胸水50ml，1000轉/分鐘離心5分鐘，在細胞培養室操淨臺中棄取上清液，留取離心細胞lml;②吸取200^1本發明樹脂珠子，PBS液洗滌1次，75%酒精洗滌2次，培養液DMEM洗滌1次，加入600pl培養液DMEM，分別加入6孔培養板內，每孔再加入2mlDMEM;(D在6孔培養板內，每孔加入100pl步驟①中準備的細胞，輕輕搖動6孔板，使細胞和珠子混合，然後將培養板放入37t，5e/。C02的培養箱中培養12h;④將上述6孔培養板中珠子，集中到25ml的離心管中，收集樹脂珠子，胰蛋白酶分離粘附樹脂珠子上細胞，取5pl細胞進行塗片，蘇木素染色lmin，伊紅染色lmin，顯微鏡下觀察細胞形態，並通過免疫組織化學染色(抗人CEA單克隆抗體)觀察。(2)實驗結果結果如表1所示，對37例肺癌病例的胸水進行了常規細胞學診斷和用本發明樹脂珠子聯合常規細胞學診斷，常規細胞學方法僅診斷出一例陽性，陽性檢出率為2.70%，而用本發明樹脂珠子聯合常規細胞學方法檢出了5例陽性，陽性檢出率達到13.51%,陽性率提高了10.81%,可見用本發明樹脂珠子輔助常規細胞學方法診斷可明顯提高肺癌的確診率。另外，從對其他疾病引起的胸水的檢測結果來看，用本發明樹脂珠子聯合常規細胞學方法均沒有出現假陽性的結果，可見本發明樹脂珠子對肺癌細胞的特異性粘附能力很高。表2臨床診斷例數常規細胞學+-陽性率珠子++細胞學診斷陽性率肺癌37362.70%53213.51%間皮瘤3120371607結腸癌21102乳腺癌31203肺炎30303胸膜結核908098序列表南方醫科大學—種小分子肽及其應用<160〉5PatentInversion3.318<212〉PRT人工序列1CysAspGlylieGlyProGinCys15<210〉220<212〉DNAformulaseeoriginaldocumentpage10formulaseeoriginaldocumentpage11權利要求1、一種小分子肽，該小分子肽的胺基酸序列為cdGIGPQc；其中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，I表示L型異亮氨酸，P表示L型脯氨酸，Q表示L型穀氨酸。2、權利要求1所述的小分子肽在分離非小細胞肺癌細胞中的應用。3、一種用於分離非小細胞肺癌細胞的樹脂珠子，該樹脂珠子由表面具有NH2活性基團的樹脂珠子與權利要求1所述的小分子肽通過-CO-NH-連接構成。全文摘要本發明提供了一種小分子肽，其胺基酸序列為cdGIGPQc(SEQNO.1)，可採用固相合成法製備得到。該小分子肽對非小細胞肺癌細胞具有特異性粘附作用，可用於分離非小細胞肺癌細胞。本發明還提供一種樹脂珠子，該樹脂珠子由表面具有NH2活性基團的樹脂珠子與本發明小分子肽通過-CO-NH-連接構成，對非小細胞肺癌細胞具有很高的特異性，用於輔助胸水脫落細胞檢查法診斷非小細胞肺癌，可將確診率提高至13.51％。文檔編號C07K7/06GK101486754SQ200910037239公開日2009年7月22日申請日期2009年2月18日優先權日2009年2月18日發明者帆張,蔡穎謙,穎郭,郭琳琅申請人:南方醫科大學