降香黃檀籽提取物製備及其抗凝活性快速篩選的方法
2023-08-08 17:36:06 1
專利名稱：降香黃檀籽提取物製備及其抗凝活性快速篩選的方法
技術領域：
本發明涉及降香黃檀籽提取物的製備方法以及利用纖維蛋白原和凝血酶模型，建立一種體外快速篩選降香黃檀籽抗凝提取物的方法，屬於保健食品、生物和醫藥領域。
背景技術：
心腦血管疾病死亡目前佔我國城市居民死亡總數的44%以上，居1-2位，嚴重危害人類的健康，血栓形成是其中一種常見病因。血栓是指血流在心血管系統血管內面剝落處或修補處的表面所形成的小塊。在可變的流體依賴型中，血栓由不溶性纖維蛋白、沉積的血小板、積聚的白細胞和陷入的紅細胞組成。在生理狀態下，血液在血管中循環流動，既不溢出血管之外導致出血，也不會在血管中凝固成血栓，這主要是由於體內存在著複雜的凝血系統和抗凝系統，而且二者維持動態平衡，一旦這種平衡遭到破壞，則可能發生出血性或者血栓性疾患。纖維蛋白原是一種血漿蛋白質，主要分布在血漿中參與血液凝固、纖溶、抗纖溶過程，纖維蛋白作為凝血反應的最終產物，也是血栓的主要成分。纖維蛋白溶解系統簡稱為纖溶系統，其主要作用是將沉積在血管內外的纖維蛋白原溶解，起到修復、去除和防止血管內由於纖維蛋白沉著引起的阻塞作用。血液中存在無活性的纖溶酶原，當它被纖溶酶原激活物激活後變成誘惑性的纖溶酶，纖溶酶將纖維蛋白原、纖維蛋白分解為纖維蛋白降解產物 (FDP)。除以上促纖溶物質外，血液中還存在對抗激活纖溶的物質，如纖溶酶原激活物抑制劑、抗纖溶酶等。在正常情況下，機體內二者處於動態平衡。血栓的發病率高，形成機理複雜，與血管內皮細胞、血小板活性、系統內凝血因子等有關，是目前國內外醫藥學家研究的熱點。目前抗血栓藥物的研究主要集中在抑制血小板聚集、抗凝血、溶解纖維蛋白原等功能。從天然植物中提取生物活性成分是天然藥物學和保健食品學的研究熱點，它既是尋找天然無毒副作用藥物的有效途徑，也是保健食品功能因子的研究目的之一。降香黃檀屬豆科、蝶形花亞科、黃檀屬植物，別名黃花梨、花梨母、降香檀等，是我國特有的珍貴紅木樹種之一，天然僅分布於海南省的中部和南部，近年來廣東、廣西及福建亦有引種。降香黃檀不僅具有很高的木材價值，還具有廣泛的藥用價值。在海南民間，降香黃檀的樹幹和根部的乾燥心材及種子普遍用於鎮痛、止血、殺菌、活絡和降壓等方面。降香，為降香黃檀樹幹和根的乾燥心材，性溫味辛，可入藥。《中國藥典》(2005版) 中記載其具有行氣止痛、活血止血的功效；用於心悸胸悶、肝鬱脅痛、脘腹疼痛和胸痺刺痛等，外用跌扑損傷，外傷出血等。降香作為多種中藥製劑的主要成分，常與其他活血化瘀藥配伍用於心血管疾病的治療，如冠心二號煎劑，香丹注射劑等。現代藥理學的研究表明，其成分具有抗炎、抗凝血、血管舒張、抗高血脂、抑制白細胞三烯生物合成、中樞神經系統抑制以及抗腫瘤等作用。這說明降香黃檀具有進一步研究和開發利用的價值。降香黃檀易成活，但是生長速度慢，成材周期長，從種植到有可用心材出現需要多年時間(大約20年以上)，野生的降香黃檀數量稀少，近年來因用量急劇增大已遭到嚴重破壞，現為我國特有瀕危藥用植物。目前對降香黃檀的研究主要集中在心材。由於現有資源少，降香黃檀心材藥用價值的開發利用受到一定局限。而其種子產量多，來源穩定，其藥用價值的研究尚屬空白。本發明開發了對降香黃檀籽的提取物和藥效的研究。如果能夠很好地開發利用降香黃檀籽這一資源，將對拓寬降香黃檀的應用範圍大有裨益。
發明內容
本發明目的是製備降香黃檀籽提取物並且採用體外模型快速篩選抗凝血或抗血栓效果較好的提取物，為降香黃檀籽生物活性研究以及進一步開發利用奠定基礎。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為
降香黃檀籽提取物，其為降香黃檀籽的水、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯提取物。所述的降香黃檀籽水或有機溶劑提取物的具體製備過程為
1)將降香黃檀籽去果莢，中藥粉碎機粉碎後過M目篩，以降香黃檀籽粗粉以mL/g計 10倍量的水或有機溶劑(體積分數在30%-95%的乙醇、正丁醇或乙酸乙酯)回流提取兩次， 水浴溫度為75°C，每次回流提取時間為1. 5-2小時。提取液4000r/min離心20min，收集上清液。2)將上清液旋轉蒸發至幹，用少量0. 05mol/mL pH7. 2的Tris-HCl緩衝液復溶，經過抽濾和硅藻土過濾，得到澄清的提取物濃溶液。3)將提取物濃溶液分別定容，取一定量置於玻璃稱量瓶中烘箱烘乾，測定各提取液中乾物質的含量，平行測定三次，取平均值即為提取物母液濃度。4 )標定濃度後的提取物母液，分別稀釋相應倍數，配製成1. 0-12. Omg/mL的降香黃檀籽提取物溶液。降香黃檀籽抗凝提取物篩選模型，建立篩選模型使用酶標儀測定降香黃檀籽提取物溶液的吸光度，吸光度與纖維蛋白的生成量成正比，通過吸光度的差值計算降香黃檀籽提取物溶液的抑制率，比較不同溶劑的提取物的抑制效果；模型建立的過程如下
1)測定波長的確定
以質量濃度0. 1%的纖維蛋白原為底物，分別加入2-12U/mL凝血酶，37°C保溫lOmin，用酶標儀在波長390-600nm範圍內進行掃描，記錄吸光度，以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標繪製曲線。2)底物濃度的確定
固定酶的濃度為2U/mL，在96孔板小孔中分別加入濃度為0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. O、 2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. Omg/mL的纖維蛋白原，37°C下用酶標儀測定O-IOmin內的吸光度，以吸光度對時間作圖，求出各自的反應初始速率V，重複三次，計算平均值。以底物濃度[S]為橫坐標，[S]/V為縱坐標作出酶的Hanes-woolf圖，求出米氏常數之值。根據夂選擇適合的纖維蛋白原濃度。3)酶濃度和反應時間的確定
配製8. 00,6. 00,4. 00,2. 00、1. 00,0. 50,0. 25U/mL酶溶液。根據纖維蛋白原標準曲線， 選擇8mg/mL的纖維蛋白原作為反應底物，根據上述操作步驟，用酶標儀測定405nm處不同濃度的酶在0-30min內的吸光度，以吸光度為縱坐標，反應時間為橫坐標，做出酶反應程度隨時間變化的曲線。根據曲線特點，並控制吸光值在0. SAbs以下，選擇適合的酶濃度和反應時間。4)受試樣品濃度範圍確定
濃度分別為l、2、4、6、8、10、iaiig/mL的提取物溶液作為測試樣。按照上述操作步驟，測定不同濃度樣品對纖維蛋白生成的抑制率，以抑制率為縱坐標，樣品濃度為橫坐標做曲線。 選擇抑制率與濃度呈線性的樣品濃度範圍。所述的降香黃檀籽提取物的抗凝活性篩選的方法，建立篩選模型
1)測定波長的確定酶標儀測定波長為405nm；
2)底物濃度的確定選擇8mg/mL的纖維蛋白原作為反應底物；
3)酶濃度和反應時間的確定選擇2U/mL凝血酶溶液，反應時間15min；
4)受試樣品濃度範圍確定降香黃檀籽提取物濃度l-8mg/mL。所述篩選模型篩選出用50%乙醇提取的降香黃檀籽提取物抗凝效果最佳，8mg/mL 濃度的抑制率達64. 72%。5)模型的方法評價 a.精密度
分別配製不同濃度的提取物溶液作為測試樣品，測定纖維蛋白生成抑制率。各濃度樣品分別重複測定10次，通過平均值、標準偏差(5 )和變異係數(CT)考察批內重複性。b.分析靈敏度
根據精密度實驗(n=10)，將抑制劑濃度作為橫坐標，反應前後吸光度差值的平均值作為縱坐標，繪製標準曲線，得到回歸方程。同時測定10個樣品空白的吸光度差值，求出 χ-2SD值，代入回歸方程，求出分析靈敏度。c. Z因子理論驗證有效性
具體過程通過對波長、底物濃度，酶濃度，反應時間等的考察建立了較為規範的篩選模型，在該模型下，測定 0. 0002mg/mL, 0. 001 mg/mL, 0. 005mg/mL, 0. 025mg/mL 的陽性藥物肝素鈉對凝血酶的抑制效果，重複三次，每組取平均值，以肝素鈉的濃度為橫坐標，以抑制率為縱坐標，做出陽性對照的抑制活性曲線，檢驗篩選模型的有效性。本發明具有如下優點
(1) 96孔酶標板最多可同時測定96個樣本的數據，大大節省了工作時間。( 2)微量法測定節省實驗材料和試劑的用量。( 3)同時操作，實驗的重複性和重現性高。( 4)用酶標儀自動讀取吸光度值，減少了人為讀數的誤差。
圖1纖維蛋白掃描曲線，注曲線B"G加入的凝血酶濃度依次為2、4、6、8、10、12U/mL。圖 2 Hanes-Woo If■作圖
圖3不同濃度的凝血酶動力學曲線圖4抑制劑濃度對凝血酶活性抑制率的影響圖5抑制劑濃度和吸光度差值曲線圖6陽性對照藥物濃度對凝血酶活性抑制率的影響。
具體實施例方式本發明結合附圖和實例進一步地說明 實施例1 降香黃檀籽提取物的製備
將降香黃檀籽去果莢，中藥粉碎機粉碎後過M目篩，取降香黃檀籽粗粉40g，分別用 400mL水、30%、50%、70%、85%、95%的乙醇、正丁醇或乙酸乙酯作為溶劑，回流提取兩次，水浴溫度為75°C，每次回流提取時間為1. 5-2小時。提取液4000r/min離心20min，收集上清液。將上清液旋轉蒸發至幹，用少量0. 05mol/mL pH7. 2的Tris-HCl緩衝液復溶，經過抽濾和硅藻土過濾，得到澄清的提取物濃溶液。將提取物濃溶液分別定容，取一定量置於玻璃稱量瓶中烘箱烘乾，測定各提取液中乾物質的含量，平行測定三次，取平均值即為提取物母液濃度。標定濃度後的提取物母液，分別稀釋相應倍數，配製成1. 0,2. 0,4. 0,6. 0,8. 0、 10.0,12. Omg/mL 的待測液。實施例2 篩選模型建立 (1)溶液配製
凝血酶1.6mg凝血酶(59U/mg)凍乾粉溶於4mL Tris-HCl緩衝溶液中(輕輕顛倒，溶解)，得到MU/mL凝血酶母液，置於-20°C冰箱冷凍保存。使用時根據需要依次進行稀釋。纖維蛋白原0. 08g纖維蛋白原凍乾粉，於37°C水浴條件下溶於IOmL生理鹽水，配成8mg/mL纖維蛋白原溶液，依次稀釋成從高到低不同濃度的溶液。肝素鈉以生理鹽水配製肝素鈉溶液，濃度分別為0.0002、0.0010、0.0050、 0. 0250mg/mL。降香黃檀籽提取物樣品溶液降香黃檀籽提取物ET50，以生理鹽水配製成濃度分別為 1. 0,2. 0,4. 0,6. 0,8. O、10. O、12. Omg/mL 的待測液。(2)操作方法
a.在96孔細胞培養板小孔中加入140 μ L纖維蛋白原溶液，40 μ L樣品溶液，混勻，讀數(似)。b.再加入20 μ L凝血酶溶液，開始反應，37°C保溫一定時間後讀數Us)。c.取40 μ L Tris-Hcl緩衝液代替樣品液，其它同上，測得吸光值Uch Ac)。d.使用肝素鈉作為陽性對照。e.依照下列公式計算各樣品溶液抑制率
抑制率=
Ac 一 Aci
式中Jc——緩衝液替代樣品的系統，加入凝血酶反應後的吸光度
Acb——緩衝液替代樣品的系統的吸光度
As——加入樣品溶液的系統，加入凝血酶反應後的吸光度
Asb——加入樣品溶液的系統的吸光度
(3)模型建立
通過390-600nm波長掃描，在凝血酶濃度2_12U/mL的範圍內，405nm處均有最大吸收峰。因此，根據最大吸收，確定測定波長為405nm。圖1為纖維蛋白掃描曲線，注曲線B-G加入的凝血酶濃度依次為2、4、6、8、10、12U/mL。根據米氏方程，當底物濃度([S])遠遠小於米氏常數Gfm)時，反應符合一級動力學，此時酶沒有全部被底物飽和，不能正確測得酶活；當[S]遠大於^時，反應已達到最大速率，符合零級動力學，只有在此條件下才能正確測得酶活。圖2是酶濃度固定為條件下，底物濃度範圍從0. l-7mg/mL時所作的 Hanes-Woolf圖，由回歸方程為y=489. 87x+394. 52可以計算出Λ；值為0. 8mg/mL。—般認為酶測定時底物濃度最好為^的20倍乃至100倍。在實際工作考慮到底物溶解度的限制，價格的昂貴，可將底物濃度降為之的10倍左右。因此在本實驗中，為保證反應體系中底物過量，且從纖維蛋白原的溶解度考慮，選擇8mg/mL作為底物濃度，以準確地測定抑制劑的抑制能力。根據底物濃度的選擇，我們把纖維蛋白原濃度固定為8mg/mL，然後記錄了不同的酶濃度下反應的進程。圖3所示的曲線表現的是不同凝血酶濃度及反應時間對反應速率的影響。圖3是不同濃度的凝血酶動力學曲線，由圖3可見，酶濃度為lU/mL，反應速率過慢，不便於測定酶活；酶濃度為6-8U/mL時，反應初期速率過快，反應在400s內趨於完全，也不便於測量；酶濃度為2U/mL和4U/mL時，IOmin內反應程度與時間呈較好的線性關係，且初期反應速率適中，較易測量，而相比4U/mL的酶，2U/mL反應吸光度不超過1. 0兒使測量更加精確，因此選擇2U/mL作為反應的酶濃度。由圖3還可以看出，400 s之後，2U/mL的酶反應速率逐漸變慢，900s左右反應程度趨近於完全，因此反應時間可選擇7min到15min之間。 本實驗選擇的測定時間為15min。圖4是濃度為1-lOmg/mL的受試樣品抑制率曲線，由圖可見，ET50濃度在8mg/mL 以下時，濃度與抑制率呈較好的線性關係，回歸方程為y=28. 934x+20. 131 (R2=O. 9529).因此，確定受試樣品的濃度範圍為l-8mg/mL。3.模型評價
1)精密度(批內重複性)
模型採用批內重複性實驗進行考察。批內精密度是同一次測定的精密度，通常採用不同濃度的同一樣品7-10份，每種濃度樣品按照既定方法操作，一次開機後一一測定。計算每種濃度樣品的標準差(5 )或相對標準差(MSD),也稱為變異係數(67)。所得CT應爭取達到5%以內，但不能超過10%。根據樣品濃度的線性範圍，選擇濃度為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mg/mL的ET50溶液，測定凝血酶活性抑制率。表1所示，10次平行，各濃度提取物溶液的抑制率變異係數均 <10%，因此批內重複性達到標準，模型具有可靠性。抑制劑濃度為6mg/mL時，標準差和變異係數均為最小值，分別是士 1. 09和3. 35%。表1精密度(批內重複性)實驗(Ii=IO)
權利要求
1.降香黃檀籽提取物，其為降香黃檀籽的水、乙醇、正丁醇、或乙酸乙酯提取物。
2.根據權利要求1所述的降香黃檀籽提取物的製備方法，其特徵在於製備過程為1)將降香黃檀籽去果莢，中藥粉碎機粉碎後過M目篩，以降香黃檀籽粗粉以mL/g計 10倍量的水或有機溶劑回流提取兩次，水浴溫度為75°C，每次回流提取時間為1. 5-2小時， 提取液4000r/min離心20min，收集上清液；所述回流提取的有機溶劑為體積分數在30%-95%的乙醇、30%-95%的正丁醇或30%_95% 的乙酸乙酯；2)將上清液旋轉蒸發至幹，用少量0.05mol/mL pH 7. 2的Tris-HCl緩衝液復溶，經過抽濾和硅藻土過濾，得到澄清的提取物濃溶液；3)將提取物濃溶液分別定容，取一定量置於玻璃稱量瓶中烘箱烘乾，測定各提取液中乾物質的含量，平行測定三次，取平均值即為提取物母液濃度；4)標定濃度後的提取物母液，用蒸餾水分別稀釋相應倍數，配製成1.0-12. Omg/mL的降香黃檀籽提取物溶液。
3.權利要求1所述降香黃檀籽提取物的抗凝活性篩選的方法，其特徵在於建立篩選模型使用酶標儀測定降香黃檀籽提取物溶液的吸光度，吸光度與纖維蛋白的生成量成正比， 通過吸光度的差值計算降香黃檀籽提取物溶液的抑制率，比較不同溶劑的提取物的抑制效果；模型建立的過程如下1)測定波長的確定以質量濃度0. 1%的纖維蛋白原為底物，分別加入2-12U/mL凝血酶，37°C保溫lOmin，用酶標儀在波長390-600nm範圍內進行掃描，記錄吸光度，以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標繪製曲線；2)底物濃度的確定固定凝血酶的濃度為2U/mL，在96孔板小孔中分別加入濃度為0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、 0. 8,1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. Omg/mL的底物纖維蛋白原，37 °C下用酶標儀測定 O-IOmin內的吸光度，以吸光度對時間作圖，求出各自的反應初始速率V，重複三次，計算平均值，以底物濃度[S]為橫坐標，[S]/V為縱坐標作出酶的Hanes-woolf圖，求出米氏常數 &值，根據之選擇適合的纖維蛋白原濃度；3)酶濃度和反應時間的確定配製8. 00,6. 00,4. 00,2. 00、1. 00,0. 50,0. 25U/mL凝血酶溶液，根據纖維蛋白原標準曲線，選擇8mg/mL的纖維蛋白原作為反應底物，根據上述操作步驟，用酶標儀測定405nm處不同濃度的凝血酶在0-30min內的吸光度，以吸光度為縱坐標，反應時間為橫坐標，做出酶反應程度隨時間變化的曲線，根據曲線特點，並控制吸光值在0. SAbs以下，選擇適合的凝血酶濃度和反應時間；4)受試樣品濃度範圍確定濃度分別為l、2、4、6、8、10、iaiig/mL的提取物溶液作為測試樣，按照上述操作步驟，測定不同濃度樣品對纖維蛋白生成的抑制率，以抑制率為縱坐標，樣品濃度為橫坐標做曲線， 選擇抑制率與濃度呈線性的樣品濃度範圍；5)模型的方法評價批內重複性良好，變異係數CV<10，Z因子檢驗模型有效。
4.根據權利要求3所述的降香黃檀籽提取物的抗凝活性篩選的方法，其特徵在於建立篩選模型1)測定波長的確定酶標儀測定波長為405nm；2)底物濃度的確定選擇8mg/mL的纖維蛋白原作為反應底物；3)酶濃度和反應時間的確定選擇2U/mL凝血酶溶液，反應時間15min；4)受試樣品濃度範圍確定降香黃檀籽提取物濃度l-8mg/mL。
5.根據權利要求1所述的降香黃檀籽提取物，其特徵在於使用所述篩選模型篩選出用 50%乙醇提取的降香黃檀籽提取物抗凝效果最佳，8mg/mL濃度的抑制率達64. 72%。
全文摘要
降香黃檀籽提取物製備及其抗凝活性快速篩選的方法，屬於保健食品、生物和醫藥領域。本發明涉及降香黃檀籽提取物的製備方法以及利用纖維蛋白原和凝血酶模型，建立一種體外快速篩選降香黃檀籽抗凝提取物的方法，該篩選方法的特徵是操作簡便，快捷高效，重複性良好，可用於高通量篩選，可以評價植物天然粗提物的抗血栓、抗凝血藥效，以便進行初步篩選，還可以用於抗血栓體外效果的檢驗。
文檔編號A23L1/29GK102204949SQ201110117679
公開日2011年10月5日 申請日期2011年5月9日 優先權日2011年5月9日
發明者李曉瑄, 王莉, 鄭聯合, 郭璇, 陳正行 申請人:江南大學