用於利用免疫螢光的酶免疫測定的組合物及其用途的製作方法

2023-08-08 20:10:46

本發明涉及用於利用免疫螢光的酶免疫測定的組合物，包含這樣的組合物的用於免疫分析的試劑盒和自動化裝置，還有通過利用免疫螢光的酶免疫測定體外檢測和/或定量所關注的分析物的相關方法。利用免疫測定的檢測方法廣泛用於診斷領域。這些方法使得可以檢測測試樣品中的分析物，特別是蛋白質(抗原/抗體)、肽和半抗原的形式，例如類固醇或維生素。免疫測定是本領域技術人員公知的方法，包括待檢測的分析物與這種分析物的一種或多種結合配對物之間的免疫反應。然後免疫測定的結果由實驗室提供給醫生，所述醫生會解釋它們以便例如診斷病理狀況或不期望的微生物的存在，然後採取必要措施，例如向患者給予適當治療或淨化包含這些不期望的微生物的工業環境。因此對於這些測定，高度靈敏(在這個意義上，它們不給出假陰性)和高度特異性(在這個意義上，它們不給出假陽性)特別重要。酶免疫測定或eia是在可能包含所關注的分析物的樣品分析領域中廣泛使用的一種類型的免疫測定。這些測定與酶催化的反應相關，使用酶促底物。根據所選的酶促底物，可以有比色信號(elisa技術，酶聯免疫吸附測定)(rassasie,m.j.,etal.,1992)、螢光信號(elfa技術，酶聯螢光測定)或化學發光信號(clia，化學發光免疫測定)(stablert.v.,etal.,1991)。這些方法是基於使得可以在測試樣品分析期間將發出的信號定量的測量。檢測的信號量一般與待測量的分析物量成比例(例如夾心測定期間)或與待測量的分析物量成反比(例如競爭性測定)。使得可以定量螢光信號並獲得更靈敏的結果的「elfa」技術使用將螢光生成酶促底物轉化為螢光反應產物以及任選地轉化為一種或多種其他反應產物的酶，根據本領域技術人員公知的一般方程(1)：e+s→es→e+s*(1)其中「e」為酶，「s」為螢光生成酶促底物，「es」對應於酶-底物複合物，並且「s*」對應於螢光生成酶促底物所致的螢光反應產物。反應介質中包含的反應產物s*在通過特定波長的光激發時變成螢光。實際上，應用螢光的原理，暴露於對應於第一波長的光源或通過對應於第一波長的光源激發的反應產物將轉而發射第二波長的光線或螢光信號。第一激發波長一般在250-450nm的範圍中變化。就其本身而言，第二發射波長位於300-600nm的發射範圍中。因此，螢光信號的檢測(以相對螢光單位計)與源自反應介質的這些螢光信號的信號處理相組合(其本身源自待檢測的樣品且包含反應產物)使得可以確定例如樣品內尋求的所關注的分析物的存在或濃度。儘管如此，即使elfa技術比elisa比色測定更靈敏，本領域技術人員仍然尋求使得可以進一步改進信號檢測的解決方案。這是因為螢光測量存在非特異性地減少或增加信號輸出的問題。因此，螢光的檢測可以作為參數的函數變化，所述參數如ph、溫度、離子濃度、乾燥度、與測試樣品或固體基質相關的幹擾的存在。這些參數特別影響光散射和背景噪聲，其影響測定的靈敏度，特別是使用螢光(「selectingthedetectionsystem–colorimetric,fluorescent,luminescentmethods」(gibbsetal.,elisatechnicalbulletin–no.5,2001)。鑑於上述情況，目前需要尋找新的方式或其他方式使得可以增加elfa技術的特異性和靈敏度。因此，本發明旨在解決的技術問題是使利用免疫螢光的酶免疫測定更有效和更快速，特別是增加靈敏度，即當驗證了假設時，特別是當分析物少量存在於測試樣品中時，增加給出陽性結果的能力。本發明提出的對這個問題的解決方案的第一主題是用於利用免疫螢光的酶免疫測定的組合物，其包含(i)螢光生成(fluorogenic)酶促底物和(ii)在螢光生成酶促底物(i)水解之後形成螢光化合物(fluorescentcompound)的猝滅的螢光生成化合物(fluorogeniccompound)。更特別地，本發明的這種組合物包含或由以下組成：-在一方面，螢光生成酶促底物，其使得能夠在酶促水解之後形成螢光產物和優選為陰離子的第二反應產物；以及-在另一方面，猝滅的螢光生成化合物，其使得能夠在所述螢光生成酶促底物的酶促水解之後和通過釋放的第二反應產物形成所述猝滅的螢光生成化合物所致的螢光化合物。實際上，如上文所示，在酶促反應期間，酶將螢光生成酶促底物轉化為螢光反應產物，但是還導致第二反應產物的形成，一般認為沒有特別的好處。這樣的酶促反應的一般方程(2)可以如下書寫：e+s→es→e+s*+b(2)其中「e」為酶，「s」為螢光生成酶促底物，並且「es」對應於酶-底物複合物，「s*」對應於螢光反應產物，而「b」對應於第二反應產物，兩種化合物「s*」和「b」存在於反應介質中。令人驚訝的是，申請人能夠證實可以使用來自酶促反應的所述第二、非螢光產物「b」，使其與猝滅的螢光生成化合物「a」反應。反應之後，所述產物「b」直接或間接與所述猝滅的螢光生成化合物「a」反應，使得能夠產生螢光產物「a*」或「a*-b」。產物「b」與所述猝滅的螢光生成化合物「a」的直接反應旨在表示：-根據以下方程(3.i)，所述產物「b」與所述猝滅的螢光生成化合物「a」反應以在一方面釋放螢光化合物「a*」，以及在另一方面釋放反應產物「b』」：a+b→a*+b』(3.i)-或者根據以下方程(3.ii)，所述產物「b」特異性地結合至所述猝滅的螢光生成化合物「a」以形成螢光化合物「a*-b」，其關聯所述猝滅的螢光生成化合物「a」與所述產物「b」：a+b→a*-b(3.ii)所述猝滅的螢光生成化合物優選包含會發出螢光「a」的部分和可釋放的陽離子「cat」，然後其讀作「a-cat"，並且直接化學反應的一般方程可以書寫如下：b+a-cat→cat-b+a*(4)其中「b」對應於上文的一般方程(2)中詳細描述的所述第二反應產物，「a-cat」是包含能夠在釋放其陽離子「cat」之後發出螢光「a*」的部分的所述猝滅的螢光生成化合物，其中陽離子「cat」會與所述產物「b」關聯以形成產物「cat-b」。所述產物「b」與所述猝滅的螢光生成化合物的間接反應旨在表示所述產物「b」用於一組反應，使得可以將所述猝滅的螢光生成化合物轉化為螢光化合物，所述產物「b」沒有結合至所述猝滅的螢光生成化合物「a」。然後所述產物「b」結合至所述一組反應中存在的另一化合物，然後其將會被用於使得可以使所述猝滅的螢光生成化合物發螢光的步驟。因此，以創新的方式，申請人使用通常被認為沒有好處，由上文方程(2)中詳細描述的酶促反應所致的所述產物「b」，以便通過在反應介質中使所述反應產物「b」與猝滅的螢光生成化合物反應來增加螢光信號。通過重複使用之前沒有興趣的反應產物，申請人從而大幅增加螢光信號。非螢光反應產物的這種重複使用特別具有以下優點：-其限制添加額外的物質，所述物質的合成是複雜的且難以複製的，例如用來放大信號的樹狀聚合物，從而使得可以增加靈敏度、原料的製備和測試的快速性；-不改變反應時間實現獲得的靈敏度的增加的；-非螢光反應產物和所述猝滅的螢光生成化合物之間的額外反應，特別是在所述反應產物「b」和所述猝滅的螢光生成化合物之間的直接反應的情況下是簡單、快速的，並且不需要許多步驟；-其不需要檢測信號的儀器的任何改動，因此一般是相對便宜的；-其使得可以檢測測試樣品中以低濃度存在的分析物；-其使得可以將所述猝滅的螢光生成化合物(「a-cat」)的濃度調整至僅增加弱信號的螢光；-所述螢光反應產物(「s*」)以及通過產物「b」發出螢光的所述猝滅的螢光生成化合物「a」或「a-cat」(「a*」或「a*-b」)的螢光信號在位於相同區間內的波長範圍內被檢測。本發明的第二主題是用於利用螢光的酶免疫測定的試劑盒，其包含根據本發明的組合物。其第三主題是用於免疫分析的自動化裝置，其包含根據本發明的組合物。其第四主題是根據本發明的組合物、試劑盒或自動化裝置在利用免疫螢光的酶免疫測定中的用途。其第五主題是在可能包含分析物的液體測試樣品中通過夾心類型的利用免疫螢光的酶免疫測定在體外檢測和/或定量所述分析物的方法，其包括或由以下步驟組成：-使預先連接至或未連接至固體表面的捕獲配對物與所述液體樣品在一起以使分析物結合至所述捕獲配對物；-添加檢測配對物以結合至所述捕獲配對物-分析物複合物，其直接或間接偶聯至能夠裂解本發明的組合物的所述螢光生成酶促底物的酶；-使本發明的組合物和所述捕獲配對物-分析物-檢測配對物複合物在一起以形成反應介質；以及-通過免疫螢光通過測量反應介質中發出的螢光檢測分析物的存在和/或量。其第六主題是在可能包含分析物的液體測試樣品中通過利用免疫螢光的酶免疫測定在體外檢測和/或定量所述分析物的方法，其包括或由以下步驟組成：-使預先連接或未連接至固體表面的捕獲配對物、偶聯至能夠裂解本發明的組合物的所述螢光生成酶促底物的酶的分析物類似物以及所述液體樣品在一起，其競爭結合至所述捕獲配對物；-使本發明的組合物以及所述捕獲配對物-分析物和捕獲配對物-分析物類似物複合物在一起以形成反應介質；以及-通過免疫螢光通過測量反應介質中發出的螢光檢測分析物的存在和/或量。最後，其最後的主題是提高通過利用免疫螢光的酶免疫測定在體外檢測和/或定量測試樣品中所關注的分析物的方法的靈敏度的方法，其特徵在於其包括在進行測定時使用根據本發明的組合物。閱讀根據附圖給出的以下非限制性描述會更好地理解本發明，其中：-圖1示意性地示出通過酶鹼性磷酸酶(alp)激活螢光生成酶促底物4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)以給出4-甲基傘形酮(4–mu)和磷酸氫根離子hpo42-(pi代表其所有形式的無機磷酸鹽)的已知反應；-圖2示意性地示出激活螢光生成酶促底物的反應，在該實例下是4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)，通過猝滅的螢光生成化合物(猝滅的化學傳感器-陽離子複合物(a-cat))優化；通過酶鹼性磷酸酶(alp)轉化底物4-mup以給出4-甲基傘形酮(4–mu)和磷酸氫根離子hpo42-(pi代表其所有形式的無機磷酸鹽)，所述所得的磷酸氫根離子hpo42-特異性地結合至所述猝滅的化學傳感器-陽離子複合物a-cat以在一方面形成關聯陽離子與磷酸鹽離子的非螢光產物(pi-cat)，以及在另一方面形成螢光化合物(a*)；-圖3示意性地示出激活螢光生成酶促底物4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)的特異性反應，通過關聯鈣黃綠素藍與鈷離子的猝滅的化學傳感器-陽離子複合物(「cb-co」)優化；通過酶鹼性磷酸酶(alp)轉化底物4-mup以給出4-甲基傘形酮(4–mu)和磷酸氫根離子hpo42-(pi代表其所有形式的無機磷酸鹽)，所述所得的磷酸氫根離子hpo42-特異性地結合至關聯鈣黃綠素藍和鈷離子的猝滅的化學傳感器-陽離子產物(「cb-co」)的陽離子，以便在一方面形成關聯陽離子與磷酸鹽離子的非螢光產物(pi-co)，以及在另一方面釋放螢光化合物鈣黃綠素藍(cb*)介質；-圖4說明猝滅的螢光生成化合物(關聯鈣黃綠素藍和鈷離子的猝滅的化學傳感器-陽離子複合物(「cb-co」))是通過增加無機磷酸鹽pi濃度激活的，並且使得可以形成螢光化合物鈣黃綠素藍(cb*)作為所述無機磷酸鹽pi濃度的函數[以nm計的波長λ/以任意單位(a.u.)計的發射強度]；-圖5說明利用螢光分光光度計測量的以下兩種溶液的發射譜基本上相似：·包含6410nm的鈣黃綠素藍、0.6mm的二乙醇胺(dea)；0.3mm的乙二胺四乙酸(edta)和0.5mm的mgcl2的ph9.4的溶液；以及·包含6410nm的螢光生成酶促底物4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)的opt溶液[以nm計的波長λ/以任意單位(a.u.)計的發射強度]-圖6說明鈣黃綠素藍的螢光在添加鈷離子(co2+)之後猝滅的事實。[以nm計的波長λ/以任意單位(a.u.)計的發射強度]。-圖7示意性地示出激活螢光生成酶促底物4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)的特異性反應，通過關聯苯並咪唑衍生物與銅離子(cu2+)的式(ii)的猝滅的化學傳感器-陽離子複合物優化：通過酶鹼性磷酸酶(alp)轉化底物4-mup以給出4-甲基傘形酮(4–mu)和磷酸氫根離子hpo42-(pi代表其所有形式的無機磷酸鹽)，所述所得的磷酸氫根離子hpo42-與猝滅的化學傳感器-陽離子複合物(關聯苯並咪唑衍生物與銅離子(cu2+))的陽離子cu2+關聯，以便在一方面形成關聯陽離子cu2+與磷酸鹽離子的非螢光產物(pi-cu)，以及在另一方面釋放以下式(i)的螢光苯並咪唑衍生物n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺：-圖8示意性地示出實施例3中詳細描述的測試中的不同步驟，特別使得可以確定本發明的螢光化合物產生的額外的螢光；-圖9示意性地示出pipertm[pipertm磷酸鹽測定試劑盒(invitrogentm)]的原理，其中在無機磷酸鹽的存在下，麥芽糖磷酸化酶將麥芽糖轉化為葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸。然後葡萄糖氧化酶將葡萄糖轉化為葡糖酸內酯和h2o2。最後，用辣根過氧化物酶(hrp)，h2o2與非螢光試劑amplexred反應以產生高螢光分子試滷靈；-圖10比較一方面利用包含僅一種螢光生成酶促底物(4-mup)的免疫螢光的酶免疫測定的組合物以及另一方面根據本發明的利用包含螢光生成酶促底物(4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup))和猝滅的化學傳感器-陽離子複合物(關聯鈣黃綠素藍和鈷離子)(「cb-co」)的免疫螢光的酶免疫測定的組合物之間的平均螢光；以及-圖11示出關聯n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]-胺與銅離子(cu2+)的猝滅的化學傳感器-陽離子複合物實際上不發出螢光，並且螢光是在將無機磷酸鹽pi引入介質之後獲得的[以nm計的波長λ/以任意單位(a.u.)計的發射強度]。因此本發明涉及用於利用免疫螢光的酶免疫測定的組合物，其包含(i)螢光生成酶促底物以及(ii)在底物(i)的酶促水解之後形成螢光化合物的猝滅的螢光生成化合物。更特別地，根據本發明的這種組合物包含：-在一方面(i)，螢光生成酶促底物，其使得能夠在酶促水解之後形成螢光產物(稱作第一螢光產物)和優選為陰離子的第二反應產物；以及-在另一方面(ii)，猝滅的螢光生成化合物，其使得能夠特別通過第二反應產物的釋放形成螢光化合物(稱作第二螢光產物)，所述第二反應產物優選是底物(i)的酶促水解所致的陰離子。可以用於本發明的目的的所述螢光生成酶促底物(可以在本發明的上下文內被稱作初級底物)是本領域技術人員已知的在酶促水解之後給出螢光產物和第二反應產物(優選陰離子)的所有底物。根據本發明的一個特定實施方案，初級螢光生成酶促底物選自4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)、4-甲基傘形酮基半乳糖苷(4-mug)、4-甲基傘形酮基硫酸酯(4-mus)、螢光素二磷酸酯(fdp)、6,8-二氟-4-甲基傘形酮基磷酸酯(difmup)、9h-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(ddao磷酸酯)、2'-[2-苯丙噻唑]-6'-羥基苯丙噻唑磷酸酯、2-萘基磷酸酯和2-傘形酮基磷酸酯。在這個特定實施方案中，形成的所述第一螢光產物「s*」是4-甲基傘形酮(4-mu)，並且所述第二反應產物「b」是陰離子或糖。所述初級螢光生成酶促底物優選選自4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)、4-甲基傘形酮基硫酸酯(4-mus)和4-甲基傘形酮基半乳糖苷(4-mug)。因此，優選地，所述第二反應產物是選自磷酸氫根離子hpo42-(或無機磷酸鹽，表示pi)和硫酸根離子so42-的陰離子，或者是糖(半乳糖苷)。所述初級螢光生成酶促底物更優選仍選自4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)和4-甲基傘形酮基硫酸酯(4-mus)。因此，優選地，所述第二反應產物是磷酸氫根離子hpo42-(或無機磷酸鹽，表示pi)或硫酸根離子so42-。更優選地，所述初級螢光生成酶促底物是4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)，並且所述第二反應產物是磷酸氫根陰離子hpo42-。使得能夠形成這樣的第一螢光產物和第二反應產物的酶也是本領域技術人員已知的。在可用於利用免疫螢光的酶免疫測定的酶中，特別可以提到硫酸酯酶、鹼性磷酸酶(alp)、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶(gox)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(g6pd)和β-半乳糖苷酶(β-gal)。使得能形成螢光產物和第二反應產物(陰離子)的酶優選選自硫酸酯酶、酸性磷酸酶和鹼性磷酸酶(alp)。根據一個特定實施方案，所述初級螢光生成酶促底物是4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)，其使得能夠在酶alp的存在下形成4-甲基傘形酮(4–mu)和磷酸氫根離子hpo42-。酶促反應所致的所述第一螢光產物優選在250-450nm的波長激發，並且在300-600nm的波長發射。有利地，所述第一螢光產物在300-400nm的波長激發，並且在400-500nm的波長發射。更有利地，所述第一螢光產物在350-380nm的波長激發，並且在420-480nm的波長發射。在本發明的上下文內可以被稱作第二底物的「猝滅的螢光生成化合物」旨在表示包含基團的化合物，當其包含結合的這個基團時，不能發出螢光(「螢光猝滅」)，但是當所述基團從所述化合物分離時，所述化合物發出螢光信號。這可以被稱作「猝滅」基團。作為這類猝滅的螢光生成化合物的實例，可以提到本領域技術人員習慣的螢光化合物的衍生物，如香豆素或試滷靈衍生物，其包含防止螢光發射的基團。通過這類基團的實例的方式，可以提到基團–c(o)-ch3，其如果結合至試滷靈，猝滅試滷靈的螢光。包含這樣的基團的試滷靈衍生物是試劑red，其在無機磷酸鹽的存在下產生螢光試滷靈(間接反應)的基團丟失機制描述於pipertm磷酸鹽測定試劑盒(invitrogentm)說明書，並且在圖9中示意性地示出。「猝滅」基團的丟失一般是通過酶的作用產生的，在前面的實例中這種酶是辣根過氧化物酶。螢光化合物的這些衍生物一般可以是螢光生成酶促底物，不同於所述初級螢光生成酶促底物，只要它們在通過所述初級底物的酶促水解釋放的所述第二反應產物的存在下形成螢光化合物(據說它們被激活)。可以用於本發明的目的的猝滅的螢光生成化合物的其他實例包含與陽離子關聯的選擇性化學傳感器，其在這種關聯形式下是猝滅的。它們被稱作猝滅的化學傳感器-陽離子複合物。如圖2中說明的，與陽離子關聯的選擇性化學傳感器類型的這種第二底物「a-cat」能夠被隨後通過所述螢光生成酶促底物的酶促水解之後產生的所述第二反應產物直接激活，在圖2中陰離子「pi」的情況下，其使得能夠直接產生額外的信號。使用這些化合物作為猝滅的螢光生成化合物具有這樣的優勢，圖2中的反應產物「b」或「pi」與猝滅的化學傳感器-陽離子複合物的陽離子反應，並且使得能夠：-在一方面形成關聯反應產物與陽離子的複合物(圖2中的「pi-cat」)，以及-形成螢光化合物(「a*」)，其使得可以產生第二螢光信號。所述第二螢光信號不需要添加額外的化合物以進行形成螢光形式的化合物所需要的一組反應，如在螢光化合物的常規衍生物的情況下，其構成本發明的一個特定實施方案。通過可以使用的化學傳感器的非限制性實例的方式，可以提到以下螢光化合物：(i)親水性香豆素，如jungh.s.etal.,2009,thomasf.andserratriceg.,1999和yaoj.etal.,2009所述，例如：-7-(二乙基氨基)-2-氧代-n-((吡啶-2-基)-甲基)-2h-色烯-3-羧醯胺：-n-(1,3-二羥基-2-(羥基甲基)丙烷-2-基)-2-氧代-2h-色烯-3-羧醯胺：-鈣黃綠素：和-鈣黃綠素藍：(ii)聚(9-氨基芴)，如zhangg.etal.,2012所述；(iii)苯並咪唑衍生物，如alvarom.etal.,2001,henarym.m.etal.,2004和salujap.etal.,2012所述，例如：-以下式(i)的n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)-苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺：-雙-苯並咪唑衍生物的n,s,-大環；-{4-[2-(1h-苯並咪唑-2-基)苯基-氨磺醯]-苯氧基}乙酸：-{4-{2-{4-[(二乙基氨基)甲基]-1h-苯並咪唑-2-基}苯基-氨磺醯}苯氧基}乙酸：-{4-{2-{4-[(甲基吡啶-2-基甲基氨基)-甲基]-1h-苯並咪唑-2-基}苯基氨磺醯}苯氧基}乙酸：和-{4-{2-{4-[(雙吡啶-2-基甲基氨基)甲基]-1h-苯並咪唑-2-基}苯基氨磺醯}苯氧基}乙酸：根據本發明的組合物中使用的所述化學傳感器優選選自親水性香豆素和苯並咪唑衍生物。更優選地，根據本發明的組合物中使用的所述化學傳感器是鈣黃綠素藍或n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺。更優選地，根據本發明的組合物中使用的所述化學傳感器是鈣黃綠素藍。所述選擇性化學傳感器與陽離子關聯以形成猝滅的化學傳感器-陽離子複合物。所述陽離子優選是過渡金屬，優選選自co2+、cr3+、cu2+、fe2+、fe3+、mn2+、ni2+、hg2+和pb2+。更優選地，根據本發明的組合物中使用的所述陽離子是co2+或cu2+。所述猝滅的化學傳感器-陽離子複合物優選選自：(i)通過金屬離子猝滅的親水性香豆素，如以下複合物：-7-(二乙基氨基)-2-氧代-n-((吡啶-2-基)-甲基)-2h-色烯-3-羧醯胺-銅離子(cu2+)；-n-(1,3-二羥基-2-(羥基甲基)丙烷-2-基)-2-氧代-2h-色烯-3-羧醯胺-鐵離子(fe3+)；-鈣黃綠素-鐵離子(fe3+)；-鈣黃綠素藍-鈷離子(co2+)；(ii)通過金屬離子猝滅的水溶性苯並咪唑衍生物，如以下複合物：-n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)-苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺-銅離子(cu2+)，具有以下式(ii)：-雙-苯並咪唑衍生物的n,s,-大環，通過選自cu2+、fe2+、ni2+、co2+和mn2+的離子猝滅；-{4-[2-(1h-苯並咪唑-2-基)-苯基-氨磺醯]苯氧基}乙酸，通過選自cu2+、fe2+、ni2+、co2+和mn2+的離子猝滅；-{4-{2-{4-[(二乙基氨基)甲基]-1h-苯並咪唑-2-基}苯基氨磺醯}苯氧基}乙酸，通過選自cu2+、fe2+、ni2+、co2+和mn2+的離子猝滅；-{4-{2-{4-[(甲基吡啶-2-基甲基氨基)甲基]-1h-苯並咪唑-2-基}苯基氨磺醯}苯氧基}乙酸，通過選自cu2+、fe2+、ni2+、co2+和mn2+的離子猝滅；以及-{4-{2-{4-[(雙吡啶-2-基甲基氨基)甲基]-1h-苯並咪唑-2-基}苯基氨磺醯}苯氧基}乙酸，通過選自cu2+、fe2+、ni2+、co2+和mn2+的離子猝滅。更優選地，猝滅的化學傳感器-陽離子複合物選自：-鈣黃綠素藍-鈷離子(co2+)和-n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)-苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺-銅離子(cu2+)。所述猝滅的化學傳感器-陽離子複合物使得能夠在酶促反應之後形成第二螢光產物「a*」，這由所述陽離子從所述螢光化學傳感器分離所致，所述陽離子通過離子鍵合結合至所述陰離子。如方程(2)中詳述的酶促反應所致的螢光產物「s*」，這種第二螢光產物優選在250-450nm的波長激發，並且在300-600nm的波長發射。有利地，所述第二螢光產物也在300-400nm的波長激發，並且在400-500nm的波長發射。更優選地，所述第一螢光產物和所述第二螢光產物在基本上相同的波長激發和發射。salujap.etal.,2012公開了以下式(i)的化合物n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺：這種化合物(i)默認是螢光的。但是，當所述化合物(i)與陽離子如cu2+關聯時，其形成式(ii)的猝滅的化學傳感器-陽離子複合物：最後，介質中陰離子如無機磷酸鹽的存在會引起所述陽離子cu2+結合至磷酸鹽離子，再次釋放螢光化合物(i)。特別有利地，根據本發明的所述組合物關聯螢光生成酶促底物(4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup))和猝滅的化學傳感器-離子複合物(鈣黃綠素藍-鈷離子(co2+))。本發明的所述組合物還可以包含可以在生物學測定的背景下使用的其他化合物，例如緩衝液。本發明的所述組合物中存在的所述螢光生成酶促底物(初級底物)和所述猝滅的螢光生成化合物(第二底物)可以被包含在固體介質中，例如固體粉末，或者被包含在液體介質中。「固體或液體介質」旨在表示與待測試的樣品相容的固體或液體形式的介質，所述樣品可能包含至少一種待檢測的代表性分析物。本發明的所述組合物中存在的所述螢光生成酶促底物和所述猝滅的螢光生成化合物優選被包含在用於酶免疫測定的液體介質中。待確定的分析物可以是蛋白質、肽或半抗原，即包含抗原和/或抗體、分析物的受體等作為結合配對物的反應。本發明的上下文內待測試的樣品可以具有各種來源，例如食品、環境、生物、獸醫、臨床、藥物或化妝品來源。在食品來源的樣品中，可以以非詳盡的方式提到乳製品(酸奶、奶酪等)、肉、魚、蛋、水果、蔬菜、水或飲料(牛奶、果汁、汽水等)的樣品。當然，食品來源的這些樣品還可以源自調味汁或更精緻的菜餚或者非轉化或部分轉化的起始材料。食品樣品可以源自用於動物的食品，如油餅(oilcake)或動物餐。如果它們不是液體，將所有這些樣品預先處理為液體形式。如上文所示，所述樣品可以是環境來源的，並且可以例如由表面或水取樣等組成。所述樣品還可以由人或動物來源的生物樣品組成，其可以對應於生物流體(尿、全血或衍生物如血清或血漿、唾液、膿液、腦脊液等)的取樣，糞便(例如霍亂樣腹瀉)的取樣，鼻、咽喉、皮膚、傷口、器官、組織或分離的細胞取樣，或者拭子樣品。這個列表當然是不詳盡的。一般來說，術語「樣品」是指一部分或一定量，更特別是一小部分或少量，為了分析的目的採自一個或多個實體。這種樣品可以任選地已經過預處理，包括例如混合、稀釋或研磨的步驟，特別是如果起始實體為固體狀態。分析的所述樣品一般可能包含-或疑似包含-代表待分析、表徵或監測的微生物或疾病的存在的至少一種分析物。本發明的另一主題是用於利用可能被包含在測試樣品中的分析物的免疫螢光的酶免疫測定的試劑盒，其包含如上文定義的組合物。當然，「免疫測定」中的術語「免疫」，例如，在本申請中並不認為嚴格表示結合配對物是免疫學配對物如抗體。實際上，本領域技術人員在結合配對物(也稱作配體)不是免疫學配對物而是例如期望測定的分析物的受體時也廣泛使用這個術語。因此，已知對使用非免疫學結合配對物的測定提到elisa測定(「酶聯免疫吸附測定」)，更常稱作「配體結合測定」，而術語「免疫」包括在首字母縮寫詞elisa中。為了清楚的目的，申請人在整個申請中對使用結合配對物的任何測定均將會使用術語「免疫」，即使在其不是免疫學配對物時。本發明的另一主題是包含這樣的組合物的用於免疫分析的自動化裝置。用於免疫分析的自動化裝置是用於生物學分析的自動化裝置，其使得可以在有限時間內進行一定數量的生物學分析。根據本發明的用於免疫分析的自動化裝置使得能夠例如心臟標記的測定、甲狀腺面板(thyroidpanel)、貧血評價、腫瘤標記的測定、生育評價、病毒反應、細菌或細菌蛋白質的存在。通過自動化裝置的非限制性實例的方式，可以提到以下自動化裝置：·2、uniceltmdxi600和uniceltmdxi800，由beckmancoulter銷售；·adviacentaurtm和immulitetm，由siemens銷售；·vitrostm，由ortho-clinical-diagnostics銷售·由申請人銷售；·architecttm，由abbottdiagnostics銷售；以及·elecsystm，由rochediagnostics銷售。自動化裝置優選3或由申請人銷售。本發明還涉及如上文所述的組合物、試劑盒或自動化裝置在利用所關注的分析物的免疫螢光的酶免疫測定中的用途。通過酶免疫測定分析樣品採用所關注的分析物與所述分析物特異性的一種或多種結合配對物之間的反應。這些結合配對物可以用作捕獲配對物、檢測配對物或者捕獲和檢測配對物，取決於使用的測定。作為分析物的結合配對物，可以提到抗體、抗體的片段、nanofitin、這種分析物的受體或已知與待研究的分析物相互作用的其他分子受體。結合配對物抗體是例如多克隆抗體或單克隆抗體。多克隆抗體可以通過這樣獲得，用分析物或分析物的免疫原性部分免疫動物，然後回收純化形式的期望抗體，通過採集所述動物的血清，並且從其他血清組分分離所述抗體，特別是通過在抗體特異性識別的抗原的柱上親和層析至，特別是所述分析物結合至柱。所述單克隆抗體可以通過雜交瘤技術獲得，其一般原理回顧如下。首先，將動物(一般是小鼠)用所關注的所述分析物或所述分析物的免疫原性部分免疫，然後所述小鼠的b淋巴細胞能夠產生抗這種抗原的抗體。然後將這些產生抗體的淋巴細胞與「永生的」骨髓瘤細胞(實例中是小鼠的)融合以產生雜交瘤。然後從這樣獲得的細胞的異質混合物選擇能夠產生特定抗體並無限增殖的細胞。將每個雜交瘤以克隆形式擴增，每個導致產生單克隆抗體，其中可以例如通過elisa、一維或二維蛋白質印跡、免疫螢光或者使用生物傳感器測試關於所述靶分析物的識別特性。隨後純化這樣選擇的單克隆抗體，特別是根據上文描述的親和層析技術。所述單克隆抗體還可以是使用本領域技術人員公知的技術，通過遺傳工程獲得的重組抗體。通過抗體片段的實例的方式，可以提到fab、fab'、f(ab')2片段，還有scfv(單鏈可變片段)和dsfv(雙鏈可變片段)鏈。這些功能性片段可以特別地通過遺傳工程獲得。nanofitin(商品名)是小蛋白，像抗體一樣，其能夠結合至生物學的靶標，因此使得可以檢測它，捕獲它或者在生物體內非常簡單地靶向它。結合配對物可以是待檢測的分析物特異性的或非特異性的。當它們能夠專門地或幾乎專門地結合至這些分析物時，則說它們是特異性的。當這些分析物的結合選擇性低時以及當它們因此能夠結合至其他配體如其他蛋白質或抗體時，則說它們是非特異性的。根據一個優選實施方案，使用特異性結合配對物。通過測量使分析物和結合配對物之間形成的複合物與根據本發明的組合物在一起之後產生的信號檢測分析物。檢測通過使螢光可見的方法進行，通過直接或間接標記檢測配對物(夾心方法)或者標記分析物本身或其一個或多個片段(競爭方法)。標記旨在表示連接能夠在合適的螢光生成酶促底物如4-mup的水解之後在反應介質中產生通過螢光檢測的信號的酶，例如，鹼性磷酸酶。本發明還涉及一種在可能包含所述分析物的液體測試樣品中通過夾心類型的利用免疫螢光的酶免疫測定體外檢測和/或定量所述分析物的方法，其包括以下步驟：-使預先連接至或未連接至固體表面的捕獲配對物與所述液體樣品在一起以使所述分析物結合至所述捕獲配對物；-添加檢測配對物以結合至捕獲配對物-分析物複合物，其直接或間接偶聯至能夠裂解本發明的組合物的所述螢光生成酶促底物的酶；-使本發明的組合物和所述捕獲配對物-分析物-檢測配對物複合物在一起以形成反應介質；以及-通過免疫螢光通過測量反應介質(即包含如上文所述的第一和第二螢光產物的介質)中發出的螢光檢測分析物的存在和/或量。所述酶直接或間接偶聯至所述檢測配對物旨在表示所述酶直接結合至識別所述分析物的所述檢測配對物(直接偶聯)，或者所述酶偶聯至識別所述檢測配對物的結合配對物，所述檢測配對物轉而識別所述分析物(間接偶聯)。因此，在直接偶聯的上下文內，在測定結束時形成的所述複合物將由以下組成：「捕獲配對物/分析物/偶聯至所述酶的檢測配對物」。在間接偶聯的上下文內，在測定結束時形成的所述複合物將由以下組成：「捕獲配對物/分析物/檢測配對物/偶聯至所述酶的結合配對物」。在後一實施方案的上下文內，所述結合配對物是本領域技術人員公知的，並且在所述檢測配對物是識別所關注的所述分析物的igg時可以是例如抗igg(免疫球蛋白)抗體。本發明還涉及在可能包含分析物的液體測試樣品中通過競爭類型的利用免疫螢光的酶免疫測定體外檢測和/或定量所述分析物的方法，所述方法包括以下步驟：-使預先連接至或未連接至固體表面的捕獲配對物、偶聯至能夠裂解本發明的組合物的螢光生成酶促底物的酶的分析物類似物以及所述液體樣品在一起，其競爭結合至所述捕獲配對物；-使本發明的組合物以及所述捕獲配對物-分析物和捕獲配對物-分析物類似物複合物在一起以形成反應介質；以及-通過免疫螢光檢測分析物的存在和/或量，通過測量反應介質中發出的螢光，即包含如上文所述的第一和第二螢光產物的介質。除了本發明的組合物的使用之外，這些方法的步驟是本領域技術人員公知的常規步驟。此外，本發明的方法還可以在每步之後包括一個或多個額外的漂洗步驟，例如：-在添加所述檢測配對物之前的漂洗步驟以便消除未結合至所述捕獲配對物-分析物複合物的所述分析物；以及-在添加所述檢測配對物之後的漂洗步驟以便消除所述未結合的檢測配對物，這構成本發明的另一個實施方案。所述漂洗步驟是本領域技術人員公知的步驟。它們用與反應介質和螢光讀取相容的緩衝液進行。最後，本發明涉及一種提高通過利用免疫螢光的酶免疫測定體外檢測和/或定量可能包含分析物的測試樣品中待檢測的分析物的方法的靈敏度的方法，所述方法的特徵在於其包括在進行測定時使用本發明的組合物或試劑盒。現在通過以下非限制性實施例說明本發明。實施例1：通過激活與無機磷酸鹽pi的選擇性檢測偶聯的螢光生成酶促底物4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)增加螢光。1.一般原理：1.1.標準反應：如圖1中示意性示出的，在(biomérieux)儀器中進行的通過免疫螢光檢測免疫測定中分析物的存在的當前步驟是基於帶的最後容器(孔10或xa)中包含的螢光生成酶促底物4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)的激活。在當前配置中，在儀器中進行的每個測定的最後混合期間，酶鹼性磷酸酶(alp或ap)產生的信號與待測定的分析物的量成比例(夾心方法)或與這樣的量成反比(競爭方法)。通過形成捕獲配對物/分析物/檢測配對物結合至alp的複合物或捕獲配對物/分析物類似物結合至alp的複合物，所述酶間接結合至固相容器的壁，這取決於所選的免疫測定類型，並且與螢光生成酶促底物4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)反應以產生兩種產物：-4-甲基傘形酮(4–mu)，其是高螢光分子，通過儀器的光學掃描儀測量其螢光；以及-磷酸氫根離子hpo42-(或者其所有形式的無機磷酸鹽pi)，其留在溶液中，沒有特定作用。圖1示意性地示出這個已知的反應。1.2.改進的反應：圖2示意性地示出通過根據本發明的免疫螢光檢測的改進的反應。這個反應在一方面由螢光生成酶促底物的常規激活組成，在這種情況下是4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)。此外，這個反應通過猝滅的化學傳感器-陽離子複合物(圖2中示意性示出的「a-cat」菱形)優化。關於圖1中示意性示出的反應，通過酶鹼性磷酸酶(alp)將初級螢光生成酶促底物4-mup轉化為4-甲基傘形酮(4–mu)和磷酸氫根離子hpo42-(pi，其所有形式的無機磷酸鹽)。這種所得的磷酸鹽離子(pi)與猝滅的化學傳感器-陽離子複合物(第二底物)反應以在一方面釋放螢光化合物「a*」至介質中，並且在另一方面形成關聯磷酸鹽離子(pi)與陽離子「cat」的產物。因此，這裡提出的方法由添加第二底物(猝滅的化學傳感器-陽離子複合物)至第一底物組成，在這個實施例中所述第一底物是螢光生成酶促底物4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)。這種第二底物能夠隨後通過陰離子激活，在這個實施例中所述陰離子是無機磷酸鹽pi，並且其使得可以產生額外的信號(參見圖2的圖示)。以這種方式形成的關聯選擇性化學傳感器與無機磷酸鹽的螢光複合物有助於加強4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)的初級反應產生的總信號。2.進行與螢光團「鈣黃綠素藍」的反應：如圖3中說明的，申請人使用關聯鈷陽離子(co2+)猝滅的化學傳感器「鈣黃綠素藍」(cb)的複合物作為第二底物進行上文1.2節中詳細描述的改進的反應。鈣黃綠素藍或4-甲基傘形酮-8-甲基亞氨基乙酸是一種化合物，其通式複製如下：鈣黃綠素藍是香豆素螢光團，其具有與以下通式的4-甲基傘形酮(4-mu)相似的特徵：這表示鈣黃綠素藍與系統相容。為了以下原因選擇關聯鈣黃綠素藍和鈷離子的猝滅的化學傳感器-陽離子複合物(「cb-co」)作為潛在候選物：-其對無機磷酸鹽pi是選擇性的；-如圖4中說明的，其通過增加無機磷酸鹽pi的濃度良好激活。實際上，圖4說明關聯鈣黃綠素藍和鈷離子的猝滅的化學傳感器-陽離子複合物(「cb-co」)通過增加無機磷酸鹽pi的濃度激活，並且使得能夠釋放螢光鈣黃綠素藍作為無機磷酸鹽pi的所述濃度的函數；-其是水溶性的；-其在370±5nm的波長被激發，並且在450±20nm的波長發射。-如圖5中說明的，其具有與4-甲基傘形酮(4–mu)可比的螢光強度。圖5比較以下兩種溶液的發射譜，所述溶液在第一種情況下包含鈣黃綠素藍(cb)，在第二種情況下包含4-甲基傘形酮(4-mu)：·ph9.4的溶液，其包含6410nm的鈣黃綠素藍、0.6mm的二乙醇胺(dea)；0.3mm的乙二胺四乙酸(edta-na2)和0.5mm的mgcl2；以及·opt溶液，其包含6410nm(6.4μm)的螢光生成酶促底物4-甲基-傘形酮基磷酸酯(4-mup)；-鈣黃綠素藍和鈷離子(co2+)之間的鍵在不同ph下是穩定的，包括在ph9.2下，對應於vidasxa的ph；-如圖6中說明的，關聯鈣黃綠素藍和鈷離子的化學傳感器-陽離子複合物(「cb-co」)是猝滅的，即在鈷離子(co2+)分離之前不是螢光的。此外，申請人能夠證實在鈷離子(co2+)分離之後，螢光強度保持恆定至少20分鐘的時間。實施例2：利用本發明的組合物提高螢光發射1.待測試的溶液的製備用以下化合物製備ph8.2緩衝液：·tris-鹼+hcl(8.2的最終ph)·0.7mm[mg2+]·0.03mm[edta-na2]·0.03mm[co2+]添加螢光生成酶促底物4-甲基傘形酮基磷酸酯(4-mup)和/或關聯鈣黃綠素藍和鈷離子的猝滅的化學傳感器-陽離子複合物(「cb-co」)製備3種不同溶液。這些是以下溶液a、b和c：溶液a：0.64μm的4-mup(游離酸形式)溶液b：6.4μm的cb-co溶液c：0.64μm的4-mup+6.4μm的cb-co2.溶液a和b的穩定性的測試：通過隨著時間監測它們的螢光來測試溶液a和b的穩定性，以便驗證防止螢光生成酶促底物4-mup的自發水解和從鈣黃綠素藍cb置換鈷離子(co2+)。下文表1a.和1b.給出通過3儀器的掃描儀頭測量的以相對螢光單位(rfu)計的結果，通過將裝有溶液a的3條帶和裝有溶液b的3條帶置於儀器中獲得。利用運行控制儀器的掃描儀頭的vn測試套件sw軟體的外部可攜式計算機讀取結果。表1a.：對溶液a(0.64μm4-mup)獲得的結果：表1b.：對溶液b(0.64μmcb-co)獲得的結果：結果表明組合物的螢光保持恆定且低。因此，兩種溶液a和b隨時間穩定，這證明螢光生成酶促底物4-mup不自發水解且避免了鈷離子(co2+)的置換。3.溶液a和c的螢光的比較：在這個穩定測試之後，進行以下測試3次：步驟1：將3條帶(xa孔)裝300μl的溶液a，並且將3條帶裝300μl的溶液c。將帶裝入3儀器；步驟2：通過儀器的掃描儀頭在時間t0對每條帶測量背景值(bkg)；步驟3：將酶鹼性磷酸酶(alp)添加至每個比色杯中(500μg/ml的10μl)；步驟4：在15分鐘內的確定的時間點測量每個比色杯的螢光；步驟5：計算螢光的增加。通過從t＝15分鐘的最終讀數值減去背景值(bkg)確定相對螢光值(rfv)。選擇15分鐘以便確保溶液a中包含的螢光生成酶促底物4-mup完全激活以給出4-mu。此外，用溶液a在15分鐘之後獲得的螢光與通過在相同緩衝液中稀釋1/10的opt溶液(在6.41μm)獲得的0.6410μm的4-甲基傘形酮(4–mu)濃度的螢光是同質的。來自進行3次的測試的原始結果複製於下文表2a.和2b.中：表2a.：對溶液a(0.64μm4-mup)獲得的結果表2b.：對溶液c(6.4μmcb-co+0.64μm4-mup)獲得的結果最後，下文表2c.複製進行的所有測試的相對螢光值(rfv)和相應的螢光增加百分比。表2c.如上文表2c.中詳述的，在溶液a和溶液c之間平均螢光增加約70％，所述溶液c包含根據本發明的螢光生成酶促底物4-mup和猝滅的化學傳感器-陽離子複合物cb-co的關聯。因此，添加猝滅的化學傳感器-陽離子使得可以顯著增加螢光信號。實施例3：本發明的組合物中不同濃度的初級底物的用途：關聯鈣黃綠素藍和鈷離子的猝滅的化學傳感器-陽離子複合物(「cb-co」)的初步測試：申請人希望評價在相同條件下，與僅包含螢光生成酶促底物4-mup的溶液相比，通過將猝滅的化學傳感器-陽離子複合物cb-co添加至包含不同濃度的螢光生成酶促底物4-mup的溶液中螢光的增加。1.待測試的溶液的製備如上文實施例2中所述製備ph8.2緩衝液。考慮3種不同濃度的4-mup；這些是以下濃度：(1)0.64μm(2)0.43μm(3)0.32μm。對於每個濃度，製備3種不同溶液：(1)0.64μm濃度：-溶液a1：0.64μm的4-mup(游離酸形式)-溶液b1：6.4μm的cb-co-溶液c1：0.64μm的4-mup+6.4μm的cb-co(2)0.43μm濃度：-溶液a2：0.43μm的4-mup(游離酸形式)-溶液b2：6.4μm的cb-co-溶液c2：0.43μm的4-mup+6.4μm的cb-co(3)0.32μm濃度：-溶液a3：0.32μm的4-mup(游離酸形式)-溶液b3：6.4μm的cb-co-溶液c3：0.32μm的4-mup+6.4μm的cb-co。2.實驗部分：對測試的每個濃度的4-mup，每個實驗一式三份進行並重複3次。下文表3重現濃度0.64μm的4-mup的vidastm的裝載計劃：表3溶液b1、b2和b3構成猝滅的化學傳感器-陽離子複合物cb-co的穩定性的對照。它們使得可以確保觀察到的螢光的增加的確與磷酸鹽離子(pi)i對co陽離子的作用有關，並且不是與edta對猝滅的化學傳感器-陽離子複合物cb-co的螯合作用有關。對每個濃度的4-mup進行以下測試各3次(部分1、部分2、部分3)。圖8總結了進行的測試的主要步驟。圖8示意性地示出測試的不同步驟，使得可以確定根據本發明的螢光化合物產生的額外螢光。測試的各種步驟總結如下：(i)利用3儀器的掃描儀頭測量每個空帶的塑料；(ii)將帶填充(xa孔)如下：a.部分a→1個帶裝有300μl的溶液b(b1、b2或b3)；b.部分b→3個帶裝有300μl的溶液a(a1、a2或a3)；c.部分c→3個帶裝有300μl的溶液c(c1、c2或c3)；(iii)將帶裝入3epvn1015；(iv)在t0通過相同的掃描儀頭對每個帶採集背景讀數(bkg)；(v)將酶鹼性磷酸酶(alp)過量添加至每個比色杯中(500μg/ml的10μl)；(vi)每5分鐘測量每個比色杯的螢光，持續15分鐘；(vii)通過從t＝15分鐘的最終讀數值減去背景值(t0)確定相對螢光值(rfv)。在不同濃度的4-mup(0.64μm、0.43μm和0.32μm)下進行3次不同測試的結果在下文表中重現：i.部分1、2和3期間對0.64μm的4-mup濃度的測試：表4a.：對溶液a1(0.64μm4-mup)獲得的結果表4b.：對溶液b1(6.4μmcb-co)獲得的結果表4c.：對溶液c1(6.4μmcb-co+0.64μm4-mup)獲得的結果表4d：在0.64μm的4-mup濃度下進行的所有測試的相對螢光值(rfv)。ii.部分1、2和3期間對0.43μm的4-mup濃度的測試：表5a.：對溶液a2(0.43μm4-mup)獲得的結果表5b.：對溶液b2(6.4μmcb-co)獲得的結果表5c.：對溶液c2(6.4μmcb-co+0.43μm4-mup)獲得的結果表5d：在0.43μm的4-mup濃度下進行的所有測試的相對螢光值(rfv)。iii.部分1、2和3期間對0.32μm的4-mup濃度的測試：表5a.：對溶液a3(0.32μm4-mup)獲得的結果表5b.：對溶液b3(6.4μmcb-co)獲得的結果：表5c.：對溶液c3(6.4μmcb-co+0.32μm4-mup)獲得的結果：表5d：在0.32μm的4-mup濃度下進行的所有測試的相對螢光值(rfv)。這些不同實驗之後，對每個4-mup濃度，對每個溶液a1、a2、a3以及c1、c2和c3計算平均rfv值。這些平均值在圖10中的圖中重現。如圖10所示，溶液a(a1、a2、a3)和c(c1、c2、c3)之間平均螢光的增加為大約50％。螢光的這種增加是由於鈣黃綠素藍產生的信號。實施例5：初步穩定性測試：通過隨時間監測它們的螢光來評價複合物cb-co、螢光生成酶促底物4-mup和它們的混合物的穩定性。這是為了驗證螢光生成酶促底物4-mup的自發水解以及從鈣黃綠素藍(cb)置換陽離子co2+的避免。申請人獲得的結果使得可以證實沒有自發相互作用，並且螢光隨時間保持穩定(特別是在0和25分鐘之間)。實施例6：n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺-銅離子(cu2+)複合物作為猝滅的化學傳感器-陽離子複合物的用途以下式(ii)的n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)-苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺-銅離子(cu2+)複合物：是特異性地與無機磷酸鹽pi相互作用並且可以被用作第二底物的化學傳感器-陽離子複合物的另一實例。1.n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)-苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺的合成：根據以下反應獲得化合物n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)-苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺：使2-(2-氨基苯基)-1h-苯並咪唑(209mg,1.0mmol)的溶液與50ml無水甲醇中的吡咯-2-甲醛(142mg,1.5mmol)反應，並且在回流下加熱10小時。反應之後，將溶劑蒸發至25ml並保持在50℃下緩慢蒸發。然後將獲得的白色沉澱過濾並用冷甲醇洗滌3次。2.化學傳感器-陽離子複合物的合成：以下式(ii)的n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)-苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺-銅離子(cu2+)複合物：是通過使n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)-亞甲基]胺(286mg,1.0mmol)與cu(no3)2.6h2o(295mg,1.0mmol)在thf/h2o(30ml,1/1,v/v)中反應獲得的。將混合物在回流下加熱8小時。在反應結束時，通過二乙醚在反應混合物中的緩慢擴散分離產物。將獲得的固體在冷甲醇中洗滌並獲得深綠色產物。3.猝滅的化學傳感器-陽離子複合物的激活：如圖7中說明的，這種猝滅的化學傳感器-陽離子複合物通過無機磷酸鹽pi激活，並且使得可以在一方面形成關聯陽離子cu2+與磷酸氫根離子的非螢光產物(pi-cu)以及在另一方面釋放螢光化合物[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺。圖11比較了包含猝滅的化學傳感器-陽離子複合物(n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺-銅離子(cu2+))沒有無機磷酸鹽的組合物的發射譜與來自包含猝滅的化學傳感器-陽離子複合物(n-[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺-銅離子(cu2+))和無機磷酸鹽pi的組合物的發射譜。如圖11所示，無機磷酸鹽的存在使得能夠在一方面形成關聯陽離子cu2+與磷酸氫根離子的非螢光產物(pi-cu)以及在另一方面釋放螢光化合物[2-(1h-苯並[d]咪唑-2-基)苯基]-n-[(e)-1-(1h-吡咯-2-基)亞甲基]胺。以這種方式獲得的螢光化合物：通過波長大約370±5nm的光源暴露或激發，在大約425±20nm的第二波長發射光線或螢光信號。因此，螢光產物在與4-甲基傘形酮(4–mu)基本上相容的波長下被激發和發射。這種猝滅的化學傳感器-陽離子複合物還與大約ph9.2的vidasxa相容。參考文獻-alvarom.etal.,2001,chem.phys.lett.,350:240-246-henarym.m.etal.,2004,chem.eur.j.,10:3015-3025-jungh.s.etal.,2009,j.am.chem.soc.,131:2008-2012-leongw.l.andvittalj.j.,2007,cryst.growthdes,7(10):2112-2116-rassasiem.j.etal.,1992,steroids,57:112-salujap.etal.,2012,tetrahedronlett.,53:3292–3295-stablert.v.,etal.,1991,clin.chem.,37(11):1987-thomasf.etal.,1999,j.biol.chem.,274:13375-13383-yaoj.etal,2009,inorg.chemcommun.,12:116-118-zhangg.etal.,2012,sensoractuat.b-chem.,171–172:786–794當前第1頁12當前第1頁12