一種TDGGly199Ser基因多態性的檢測方法及試劑盒的製作方法

2023-08-08 16:36:11

專利名稱：一種TDG Gly199Ser基因多態性的檢測方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及胸腺嘧啶DNA糖苷酶(TDG) G(y/5^Ser基因多態性檢測方 法及該方法的試劑盒。
背景技術：
幾乎所有的疾病都與遺傳因素有關，了解遺傳因素在疾病中的作用將有 利於疾病的診斷、治療和預防，也有助於了解環境因素在疾病發生中的作用。 一些常見的疾病如心血管疾病、腫瘤、糖尿病、肥胖和精神疾病是由於多種 遺傳和環境因素共同作用的結果。發現這些遺傳因素將對於人類疾病的發病 機制、診斷和治療具有重要意義。
人類基因組計劃研究結果證明，不同個體的基因99.9%是一樣的，但在 序列上有極小(0.1%)的遺傳差異即單核苷酸多態性(SNP)，單核苷酸多態 性是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，在人群 中的發生頻率大於1%。 SNP存在於整個基因組中，約每l kb就有l個SNP。個 體間基因組0.1%的差異是相當重要的，它決定個體間的各種差別，在環境反 應基因中這種多態性就決定了個體對環境有害因素的易感性。
SNPs有單鹼基的轉換、顛換、插入缺失等形式。在遺傳學分析中，SNPs 作為一類遺傳標記得以廣泛應用。按SNPs在基因組中的位置可以作以下分類: 胺基酸編碼區SNP和非胺基酸編碼區SNP。胺基酸編碼區SNP包括引起胺基酸 殘基改變的SNPs(又分為保守區的非同義突變和非保守區的非同義突變)和 不引起胺基酸殘基改變的SNPs(即編碼區的同義突變)。某些SNPs有可能直 接影響蛋白質結構或表達水平，因此它們可能代表疾病遺傳機理中的某些作 用因素。
許多外源性化學物可與胞嘧啶發生烷化反應生成3-氮-4-乙烯(脫氧)胞 嘧啶，導致染色體損傷。人類基因與其它物種的基因的功能均是編碼信息從 而保護自己的完整性。DNA修復酶始終監視染色體並修復癌基因和細胞毒性 的化學物所致的核苷酸殘基的破壞，若沒有DNA修復，那麼由多種多樣的 DNA損傷因素所引起的染色體不穩定性將對細胞和生物體產生致命的影響。
TDG則是DNA損傷鹼基切除修復途徑的關鍵酶，可水解與鳥嘌呤錯配的T鹼基和脫氧核糖間的糖苷鍵，從而切除胸腺嘧啶，也可切除與鳥嘌呤錯 配的尿嘧啶和5-溴尿嘧啶。雖然TDG、甲基化CpG結合性結構域蛋白和單 鏈單功能尿嘧啶-DNA糖苷酶均可修復損傷，但後兩者的修復效率較TDG低， TDG可能在修復的過程中起到主要作用。己經發現TDG基因的編碼區有7 個非同義SNP位點，導致胺基酸替換的G(y/^^w多態位點可能改變修復酶 的活性進而改變個體DNA損傷修復的能力。TDG G/_WP9Ser多態位點不同的 等位基因可產生不同胺基酸序列的蛋白質，即199位胺基酸為G(W卯G7y、 C (W卯Ser和&W卯Ser三種類型，對應不同的DNA損傷修復能力，因此有 必要對TDG(7(y/9ASfer多態位點(rs4135113)進行檢測和分型。
TDG基因序列參見美國國家醫學圖書館下屬的國家生物技術信息中心 開發的PubMed資料庫(網址http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/), GENE ID: 6996,MIM:601423， SNP位點102，卯0,823。
目前檢測TDGG^"^Sw基因多態性的方法主要有以下幾種技術，聚合 酶鏈反應-限制性片段長度多態性方法(PCR-RFLP)出現於上世紀70年代中 期，它是在分子生物學技術發展和完善的基礎上形成的一種分子標記，作為 第一代的分子遺傳標記最早用於人基因組的研究。隨著PCR技術和電泳技術 的不斷完善，PCR-RFLP在許多領域得到了廣泛的應用。但其主要缺點在於 酶切位點的選擇，並不是所有的多態位點都可以使用該方法來鑑別，而且部 分內切酶價格昂貴，難以接受。聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性
(PCR-SSCP)，幾乎可以檢測所有的點突變，SSCP分析所用的各種條件各 不相同，且存在較大分歧，特別是在電泳溫度及甘油使用方面；同時，對 進口的電泳裝置和同位素或銀染標記的依賴，限制其普遍應用。基因晶片技 術則能檢測多種基因多態性，但是其費用十分高昂，因此不可能廣泛地在實 驗室應用。
而本次採用的創造酶切位點法PCR (CRS-PCR)。其原理是根據單鹼基突 變位點的鹼基替代情況設計PCR引物，其中一條引物根據突變位點鄰近序列 設計，人為引入錯配鹼基，使得引物3'端和單鹼基突變的一種突變型在PCR 擴增後形成一個酶切位點。由於這種方法應用了引物3'端錯配技術，PCR產 物進行酶切電泳後即可進行基因型的鑑定工作，因此在實際運用中具有很人 的靈活性，可以廣泛地適用於多態性檢測，並且可選擇相對較廉價的酶，且 檢測方法簡單易行，整個試驗費用偏低，是…種進行單鹼基突變位點基因型 鑑定的較好方法。

發明內容
本發明所要解決的技術問題的第一方面在於提出一種TDG G^^^S&基 因多態性的檢測方法。
—種TDG G/;;^9SeA"基因多態性的檢測方法，包括以下步驟
a) 以待檢測人基因組DNA為模板，進行特異性PCR擴增；
b) 使用限制性內切酶進行酶切；
c) 進行瓊脂糖凝膠電泳，確定TDGG(y/卯&r基因多態性； 所述步驟a)中使用鹼基序列如下的正向引物和反向引物進行特異性PCR
擴增；所述步驟b)中使用限制性內切酶M^I進行酶切； 正向引物鹼基序列
5'-GGAAGTGTTTGTTTATGTCAGGGCTCCGGGAG-3，
反向引物鹼基序列
5'畫CACCAGCATA CTCAAGGTTC-3'。
本發明根據TDGG(W^^er多態位點(rs4135113)的鹼基替代情況設計 基因序列正、反向引物，正向引物根據突變位點鄰近序列設計，人為引入兩 個錯配鹼基，使得引物3'端和單鹼基突變位點形成酶切位點，所述的正向引 物為
5'-GGAAGTGTTTGTTTATGTCAGGGCTCC*GG*GAG-3'(*前的鹼基為 引入的錯配鹼基以創造酶切位點)
本發明檢測方法屬於創造酶切位點法PCR檢測技術(CRS-PCR)。根據單 鹼基突變位點的鹼基替代情況設計PCR引物，其中一條引物根據突變位點鄰 近序列設計，人為引入錯配鹼基，使得引物3'端和單鹼基突變的一種突變型 在PCR擴增後形成一個酶切位點。本發明解決了目前使用的內切酶價格的過 於昂貴的問題。由於這種方法應用了引物3'端錯配技術，PCR產物進行酶切 電泳後即可進行基因型的鑑定工作，因此在實際運用中具有很大的靈活性， 可以廣泛地適用於多態性檢測，並且可選擇相對較廉價的酶，且檢測方法簡 單易行，整個試驗費用偏低，是一種進行單鹼基突變位點基因型鑑定的較好 方法。
本發明的一個優選方案為，步驟a)中所述的PCR擴增為在25M1反應體 系下，94'C預變性5min後，進行30個如—K循環擴增94'C變性40s， 57°C 退火10s， 72。C延伸30s，最後72'C延伸5min。進一步，所述的25^1反應體 系包括1UT叫DNA聚合酶，10xBuffer2.5pl， 25mmol/L MgCl2 ljxl， 2.5mmo/LdNTPs 2.5^， 50ng待檢測人基因組DNA， lOpmol/L正反向引物 各0.5一，由滅菌超純水補足25iil。步驟b)在20jilMs^1酶切體系中進行，所述的20pl 酶切體系包括 10^1的步驟a)中的PCR擴增產物，10U/pl的Ms/ I限制性內切酶l|il， 10x 緩衝液2[d和7jxl滅菌超純水。
本發明的目的的另一 方面在於提出一種檢測TDGG(W^^w基因多態性
的試劑盒。
一種檢測TDG G(W卯5^基因多態性的試劑盒，該試劑盒包括
鹼基序列如下的正向引物和反向引物；
TaqDNA聚合酶；
10xBuffer;
Mg2+溶液；
dNTPs;
限制性內切酶Mj/7l;
酶切緩衝液；
正向引物鹼基序列
5'-GGAAGTGTTTGTTTATGTCAGGGCTCCGGGAG-3'
反向引物鹼基序列
5'-CACCAGCATA CTCAAGGTTC-3'。
進一步，檢測TDG G/y"P&r基因多態性的試劑盒中單份試劑包括
10pmol/L正向引物和反向引物各lpl。
1UTaqDNA聚合酶；
10xBuffer2.5jil;
25mmol/L MgCl2 1^1;
2.5mmol/L dNTPs 2.5jil;
10單位限制性內切酶A/j/ I
2nL的10x酶切緩衝液。


圖1是採用本發明的的檢測方法檢測TDG G7;^99Sw基因多態性的電泳圖。
具體實施例方式
k面結合實施例進一步說明本發明的技術方案。 種TDG G7y/99Ser基因多態性的檢測方法，該檢測方法包括以下歩驟a、 以待檢測人基因組DNA為模板，根據TDGG/y799Ser多態位點 (rs4135113)的鹼基替代情況設計基因序列正、反向引物，正向引物根據突
變位點鄰近序列設計，人為引入兩個錯配鹼基，使得引物3'端和單鹼基突變 位點形成酶切位點，正向引物的鹼基序、反向引物的鹼基序列如下所示。用 這對引物對模板基因組DNA進行特異性PCR擴增；PCR擴增後產物序列為 chr 12:102，卯0，707國102，卯0，893 。 正向引物鹼基序列
5'-GGAAGTGTTTGTTTATGTCAGGGCTCCGGGAG-3'
反向引物鹼基序列
5'-CACCAGCATA CTCAAGGTTC國3'。
b、 使用限制性內切酶J^; I對其進行酶切；
c、 根據瓊脂糖凝膠電泳對上述TDG基因進行片段大小分離，確定其基 因多態性；
本發明中進行上述檢測使用如下試劑盒，本試劑盒包括該試劑盒包括擴 增用的一對引物、PCRmix、限制性內切酶Af^I和相應的緩衝液。具體包括 正向引物，正向引物鹼基序列如下所示； 反向引物，反向引物鹼基序列如下所示； 1UTaqDNA聚合酶； 10xBuffer 2.5jxl; 25mmoI/L MgCl2 2.5mmol/L dNTPs 2.5jil; 1Ojimol/L上下遊引物各lpl。 10單位限制性內切酶JWfepI酶； 2jxL的酶切緩衝液； 正向引物鹼基序列
5'-GGAAGTGTTTGTTTATGTCAGGGCTCCGGGAG-3' 反向引物鹼基序列
5'-CACCAGCATA CTCAAGGTTC-3'。
實施例1
隨機選擇試驗對象，並抽取血樣，提取血淋巴細胞基因組DNA為待檢 測人基因組DNA， TDGG(v"95^多態位點(rs4135113)的鹼基替代情況設 計基因序列正、反向引物。
it:向引物鹼基序列
5'-GGAAGTGTTTGTTTATGTCAGGGCTCCGGGAG-3';反向引物鹼基序歹i: 5'畫CACCAGCATA CTCAAGGTTC-3'。
對模板基因組DNA進行特異性PCR擴增。PCR擴增的反應體系和條件 如下25nl反應體系，包括lUTaqDNA聚合酶，10xBuffer 2.5^1, 25mmol/L MgCl2 lnl， 2.5mmol/L dNTPs 2.5jil, 50ng待檢測人基因組DNA， 10jimol/L上 下遊引物各lpl，由滅菌超純水補足25nl。 94'C預變性5min後，進行30個 如下循環擴增941C變性40s， 57'C退火10s, 72'C延伸30s，最後72'C延伸 5min。上述PCR擴增產物在20pl Mspl酶切體系中進行酶切，20jxl Mspl酶 切體系包括1(^1的PCR擴增產物，10U/nl的MspI限制性內切酶lpl， 10x 酶切緩衝液(美國New England BioLabs公司提供)2ji1和7^1滅菌超純水。
37'C水浴過夜消化後在2%瓊脂糖凝膠電泳30min，於紫外燈下拍照鑑 定。其中野生純合型(GG)為72bp、 89bp和26bp三個片段(兩個等位基因 均有兩個酶切位點， 一個為本發明方法獨自創造的酶切位點，位於 chrl2:102，卯0,732和102,900,733之間，創造的酶切序列為CCGG，另一個酶 切位點為兩個等位基因本身所攜帶，位於chrl2:102,卯0,821和102,卯0，822 之間)；突變純合型(AA)為161bp和26bp兩個片段(有一個酶切位點，酶 切的位點為本方法獨自創造的酶切位點，位於chrl2:102,900，732和 102，卯0，733之間，創造的酶切序列為CCGG，兩個等位基因本身無酶切位 點)；雜合型(AG)為161bp、 72bp、 89bp和26bp四個片段(一個等位基 因有本方法創造的酶切位點，另一個等位基因有本方法創造的酶切位點和本 身所攜帶的酶切位點，位置同前)。請參見圖1，圖1中，M:50bpDNA marker, Lane 1 and 3: GG.; Lane 4: AA; Lane 2: AG。
使用現有技術驗證，得到的結果完全相同。
本技術領域中的普通技術人員應當認識到，以上的實施例僅是用來說明 本發明，而並非用作為對本發明的限定，只要在本發明的實質精神範圍內， 對以上所述實施例的變化、變型都將落在本發明的權利要求書範圍內。
權利要求
1、一種TDG Gly199Ser基因多態性的檢測方法，包括以下步驟a)以待檢測人基因組DNA為模板，進行特異性PCR擴增；b)使用限制性內切酶進行酶切；c)進行瓊脂糖凝膠電泳，確定TDG Gly199Ser基因多態性；其特徵在於所述步驟a)中使用鹼基序列如下的正向引物和反向引物進行特異性PCR擴增；所述步驟b)中使用限制性內切酶MspI進行酶切；正向引物鹼基序列5′-GGAAGTGTTTGTTTATGTCAGGGCTCCGGGAG-3′反向引物鹼基序列5′-CACCAGCATA CTCAAGGTTC-3′。
2、 根據權利要求1所述的一種TDG G/;/WAS&基因多態性的檢測方法， 其特徵在於步驟a)中所述的PCR擴增為在25W反應體系下，94匸預變性 5min後，進行30個如下循環擴增94'C變性40s， 57'C退火10s， 72^C延伸 30s，最後72"C延伸5min。
3、 根據權利要求2所述的一種TDG G(yWP5^基因多態性的檢測方法， 其特徵在於，所述的25pl反應體系包括lUTaqDNA聚合酶，10xBuffer 2.5^1， 25mmol/LMgCl2 1mJ， 2.5mmol/L dNTPs 2.5pl， 50ng待檢測人基因組 DNA， 10Mmol/L正反引物各0.5Ml，由滅菌超純水補足25pJ。
4、 根據權利要求1所述的一種TDGGi[yW9Ser基因多態性的檢測方法， 其特徵在於歩驟b)在20nlAfr/7l酶切體系中進行，所述的20/11 Afe; I酶切 體系包括10pl的步驟a)中的PCR擴增產物，10U&1的JWi/7l限制性內切 酶lpl， 10x緩衝液2pl和7jjl滅菌超純水。
5、 一種檢測TDGG/少/99&r基因多態性的試劑盒，其特徵在於，該試 劑盒包括鹼基序列如下的正向引物和反向引物；T叫DNA聚合酶；10xBuffer;dNTPs;限制性內切酶Ms/ I;酶切緩衝液；正向引物鹼基序列5'國GGAAGTGTTTGTTTATGTCAGGGCTCCGGGAG-3'反向引物鹼基序列5'畫CACCAGCATA CTCAAGGTTC-3'。
6、根據權利要求5所述的一種檢測TDG G/少"5Wer基因多態性的試劑 盒，其特徵在於，該試劑盒中反應所需單份試劑包括 10pmol/L正向引物和反向引物各1^1; 1UTaqDNA聚合酶； 10xBuffer2.5pl; 25mmol/LMgCl2 2.5mmol/L dNTPs 2.5pl; 10單位限制性內切酶A^pl 1^1; 2nL的10x酶切緩衝液。
全文摘要
本發明公開了一種TDG Gly199Ser基因多態性的檢測方法，屬於創造酶切位點法PCR(CRS-PCR)，該方法使用鹼基序列如下的正向引物和鹼基序列如下的反向引物進行特異性PCR擴增，使用限制性內切酶MspI進行酶切。正向引物鹼基序列5′-GGAAGTGTTTGTTTATGTCAGGGCTCCGGGAG-3′；反向引物鹼基序列5′-CACCAGCATACTCAAGGTTC-3′。本發明還公開了一種檢測TDG Gly199Ser基因多態性的試劑盒，該試劑盒包括正向引物和反向引物；限制性內切酶MspI。本發明選用相對較廉價的酶，且檢測方法簡單易行，整個試驗費用偏低。
文檔編號C12Q1/68GK101538610SQ20091004700
公開日2009年9月23日 申請日期2009年3月4日 優先權日2009年3月4日
發明者夏昭林, 姚麗芳, 張忠彬, 張曉蓉, 朱洪坤, 蔚 李, 威 王, 王海婷, 繆文彬, 偉 蔣, 相 陳 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局