一種量子點生物探針檢測多肽電荷數的方法

2023-08-08 05:39:46 2

一種量子點生物探針檢測多肽電荷數的方法
【專利摘要】本發明公開了一種量子點生物探針檢測多肽電荷數的方法，屬於納米生物【技術領域】。該方法是設計一系列帶不同電荷數的多肽，這些多肽序列中包括一個組氨酸標籤序列（HHHHHH），與量子點自組裝成量子點生物探針，繪出標準曲線；將包括一個組氨酸標籤序列的待測樣品與量子點自組裝成量子點生物探針，測定其在螢光毛細管電泳中的遷移時間，上述得到的標準曲線確定出待測樣品的電荷數。通過螢光毛細管電泳來檢測多肽中所帶的電荷數。該方法快速準確、操作簡單，拓寬了毛細管電泳在生物分析中的應用，並為量子點生物探針的進一步應用提供了參考。
【專利說明】一種量子點生物探針檢測多肽電荷數的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及納米生物【技術領域】，具體涉及一種量子點生物探針檢測多肽電荷數的方法。
【背景技術】
[0002]量子點(QDs)是一種新型的納米螢光材料，它所具有的螢光可調、寬吸收、窄發射和抗光漂白等獨特的光學性質，引起了多個領域研究者的廣泛關注，並在細胞成像、螢光免疫分析、核酸研究等方面得到了廣泛應用。水溶性量子點可與抗體、蛋白、多肽、DNA和酶等生物分子偶聯，組成量子點螢光探針。作為一種新型的螢光探針，量子點具有有機螢光染料和螢光蛋白無法比擬的光學性質，近年來基於量子點的螢光分析法己在生物分析領域得到了廣泛應用。
[0003]目前，在生物標記中應用最廣泛的是金屬有機溶劑法合成的脂溶性CdSe/ZnS量子點。因此，必須將脂溶性的QDs轉化成水溶性的QDs才能進行生物標記。而將脂溶性的QDs轉化成水溶性的QDs最常用的方法是先用巰基小分子(如巰基乙酸、巰基丙酸、穀胱甘肽、巰基丁二酸等)取代脂溶性QDs表面的配體，然後通過偶聯劑與生物分子偶聯；另一種常用的QDs標記生物分子的方法是與含有組氨酸標籤的多肽或蛋白結合。QDs表面的Zn原子和多組氨酸殘基的金屬親和協調作用，含有組氨酸殘基的蛋白質和多肽能夠直接與QDs表面的Zn原子結合，這種方法具有很好的穩定性，已逐漸成為生物標記中一種常用的方法。Sapsford 等(Sapsford K.E., Pons T., Medintz 1.L., et al.J.Phys.Chem.C2007, 111，11528-11538)系統地研究了含組氨酸多肽與QDs之間的相互作用及結合常數等，組氨酸標籤序列與QDs的結合速率是約100秒，KtT1約為InM。因此，量子點與含有組氨酸標籤序列的多肽之間的結合是非常穩定和迅速的。
[0004]另一方面，作為一種高分辨、高靈敏、高速度、高通量及低樣品消耗的微分離技術，毛細管電泳在生物分析領域也具有廣闊的應用前景。
[0005]量子點經過巰基配體轉換後，表面帶有負電荷，因此，不同電荷的多肽與量子點相互作用後，可根據荷質比的不同進行分離。
[0006]因此，我們設計了一系列帶不同電荷的含組氨酸標籤序列多肽，使組氨酸標籤序列與量子點結合，形成不同電荷數的量子點生物探針，通過螢光毛細管電泳的分析檢測，得出不同電荷的多肽與量子點結合後，遷移時間不同，繪製標準曲線，從而可利用該性質檢測多肽的電荷數。

【發明內容】

[0007]本發明要解決的技術問題是:提出一種檢測多肽電荷數的新方法，提高其在生物領域中的應用。為解決上述技術問題，本發明提供一種根據毛細管電泳遷移時間檢測多肽電荷數的方法，該方法穩定性好，重複性高，可以方便的觀察出待檢測多肽的電荷數。
[0008]本發明解決其技術問題所採用的技術方案是:一種量子點生物探針檢測多肽電荷數的方法，包括以下步驟:(1)設計一系列帶不同電荷數的多肽，並在多肽序列上加入一個組氨酸標籤序列，與量子點自組裝成量子點生物探針，分別測定它們在在螢光毛細管電泳中的遷移時間，繪製遷移時間-電荷數的標準曲線；(2)在待測樣品上加入一個組氨酸標籤序列，與量子點自組裝成量子點生物探針，測定其在螢光毛細管電泳中的遷移時間，根據步驟(I)得到的標準曲線確定出待測樣品的電荷數
[0009]步驟⑴中所述的一系列帶不同電荷數的多肽是指0-6個帶負電荷胺基酸的多肽。所述的多肽共12個胺基酸，由6個組氨酸(H)，不帶電荷的丙氨酸(A)及帶負電荷的天冬氨酸(D)或穀氨酸(E)的任意組合構成。
[0010]優選地，所述的多肽與量子點之間的摩爾比為64:1。
[0011]本發明所述的量子點為含有Zn的量子點，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。
[0012]採用上述的技術方案後，本發明取得的有益效果是，本發明提供的可用於識別多肽所帶電荷數的方法，操作簡單，可重複性高，進一步拓展了量子點一多肽複合物作為納米螢光探針在生物領域中的應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
[0014]圖1是一組不同電荷數的含組氨酸標籤多肽序列圖。(圖中H為組氨酸Histidine的縮寫，A為丙氨酸Alanine的縮寫、E為穀氨酸Glutamic acid的縮寫)
[0015]圖2是量子點與多肽自組裝的生物探針示意圖。
[0016]圖3A是不同多肽與量子點自組裝的電泳圖譜:a，QDs ；b, QDs-HHHHHHAAAAAA ；c,QDs-HHHHHHAAAAEE ；d, QDs-HHHHHHAAEEEE ；e, QDs-HHHHHHEEEEEE 電泳圖譜(多肽與量子點摩爾比64) ；B是多肽帶負電荷數量與電泳峰時間的關係。
[0017]圖4是待檢測多肽HHHHHHAAAEEE的電泳圖譜。
[0018]圖5是待檢測多肽HHHHHHAEEEEE的電泳圖譜。
【具體實施方式】
[0019]實施例
[0020]本發明將就以下實施例作進一步說明，但應了解的是，這些實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施的限制。
[0021]實施例1
[0022]螢光毛細管電泳檢測多肽HHHHHHAAAEEE帶電荷數量
[0023]1、多肽合成
[0024]一系列不同電荷數多肽(圖1)採用常規的固相Fmoc法合成，即固相樹脂上被Fmoc保護的單體胺基酸去保護後露出氨基，通過縮合反應與溶液中胺基酸的羧基形成肽鍵，從而將胺基酸連接到樹脂上，使肽鏈從C端向N端延伸。
[0025](I)、基本材料:
[0026]①樹脂與連接分子:固相Fmoc法選擇的樹脂為Rink Amide-MBHA樹脂。這種樹脂具有非常好的溶脹性，可以使肽鏈之間更好地進行縮合反應，且有足夠的空間滿足不斷增長的肽鏈。採用HBTU和HOBt作為偶聯劑，將多肽分子固定到樹脂上。
[0027]②胺基酸:合成所用胺基酸為經化學修飾的α -胺基酸。
[0028](2)、反應步驟:
[0029]第一步，將第一個胺基酸共價連接到樹脂上
[0030]加入偶聯劑HBTU和HOBt，使被保護胺基酸羧基端與樹脂的氨基偶聯，以完成胺基酸的固定；
[0031]第二步，去保護
[0032]採用鹼性溶劑20%哌啶去除氨基上的Fmoc保護集團，暴露出氨基。
[0033]第三步，激活和交聯
[0034]採用HBTU和HOBt活化下一個氨基上的羧基，與樹脂上的氨基偶聯，形成肽鍵。
[0035]第四步，重複第二步和第三步，反覆循環添加胺基酸，直到合成完成。
[0036](3)、合成後處理:
[0037]①洗脫和脫保護:用三氟乙酸(TFA)將肽鏈從樹枝上洗脫下來，並脫除保護基。
[0038]②HPLC純化，凍幹保存。
[0039]2、量子點與多肽偶聯
[0040]將多肽與量子點按64:1的比例混合，即得到量子點一多肽螢光探針(圖2)。
[0041]3、突光毛細管電泳分析檢測
[0042]經過螢光毛細管電泳分析發現隨著多肽配體所帶負電荷增多，遷移時間越大，出峰時間分別為280s、396s、443s、466s (圖3A)。將多肽所帶電荷數與電泳峰遷移時間的關係給出標準曲線，如圖3B所示。
[0043]4、檢測多肽帶電荷數量
[0044]將待檢測多肽HHHHHHAAAEEE與量子點按64:1的比例混合，通過毛細管電泳檢測，其遷移時間為401s (圖4)，與標準曲線對照，其所帶負電荷數為3。
[0045]實施例2
[0046]螢光毛細管電泳檢測多肽HHHHHHAEEEEE
[0047]1-3步驟同實施例1。
[0048]4、檢測多肽帶電荷數量
[0049]將待檢測多肽HHHHHHAEEEEE與量子點按64:1的比例混合，通過毛細管電泳檢測，其遷移時間為457s (圖5)，與標準曲線對照，其所帶負電荷數為5。
[0050]以上述依據本發明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內容，相關工作人員完全可以在不偏離本項發明技術思想的範圍內，進行多樣的變更以及修改。本項發明的技術性範圍並不局限於說明書上的內容，必須要根據權利要求範圍來確定其技術性範圍。
【權利要求】
1.一種量子點生物探針檢測多肽電荷數的方法，其特徵在於，包括以下步驟:(1)設計一系列帶不同電荷數的多肽，所述多肽序列中包括一個組氨酸標籤序列，與量子點自組裝成量子點生物探針，分別測定它們在螢光毛細管電泳中的遷移時間，繪製遷移時間-電荷數的標準曲線；(2)在待測樣品中包括一個組氨酸標籤序列，與量子點自組裝成量子點生物探針，測定其在螢光毛細管電泳中的遷移時間，根據步驟(I)得到的標準曲線確定出待測樣品的電荷數。
2.根據權利要求1所述的一種量子點生物探針檢測多肽電荷數的方法，其特徵在於步驟(I)中所述的一系列帶不同電荷數的多肽是指0-6個帶負電荷胺基酸的多肽。
3.根據權利要求2所述的一種量子點生物探針檢測多肽電荷數的方法，其特徵在於所述的多肽由6個組氨酸，不帶電荷的丙氨酸及帶負電荷的天冬氨酸或穀氨酸組成，共12個胺基酸。
4.根據權利要求1所述的一種量子點生物探針檢測多肽電荷數的方法，其特徵在於所述的量子點為含有Zn的量子點。
5.根據權利要求1所述的一種量子點生物探針檢測多肽電荷數的方法，其特徵在於所述含有 Zn 的量子點是 CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe 或者 CdTe/ZnSe。
6.根據權利要求1所述的一種量子點生物探針檢測多肽電荷數的方法，其特徵在於所述的多肽與量子點之間的摩爾比為64:1。
【文檔編號】G01N21/64GK103994988SQ201410217443
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月21日 優先權日:2014年5月21日
【發明者】王建浩, 李靜燕, 滕一萬, 蔣鵬舉, 邱琳, 王車禮, 柴宏, 秦玉琴, 李進晨 申請人:常州大學