生物分子表面展示及其用途的製作方法

2023-07-17 21:56:36

專利名稱：生物分子表面展示及其用途的製作方法
技術領域：
本發明通常涉及生物分子表面展示系統，以及展示作為疫苗的膜糖蛋白的特定應用。具體而言，本發明涉及治療和/或預防禽流感的方法、疫苗、免疫組合物和試劑盒，以及涉及調節對禽流感病毒的免疫應答的相關方法。更具體而言，本發明涉及用於治療和/或預防毒株H5m禽流感病毒的方法、疫苗、免疫組合物和試劑盒，以及涉及用於調節對毒株 H5N1禽流感病毒的免疫應答的方法。
背景技術：
禽流感病毒是重大的世界性的鳥類傳染病，其是由流感病毒的A型毒株引起的。 所有鳥類被認為容易感染該疾病，這可產生從輕微發病到高度接觸傳染範圍內的症狀以及迅速致命的發病機理，導致嚴重的流行病。已知15種流感病毒亞型傳染鳥類，因此在鳥群內提供了廣泛的流感病毒貯存宿主。具體而言，因為候鳥對傳染具有天生抵抗力，因此它們對傳染其他鳥群，諸如特別容易感染迅速致命流感流行病的家禽，提供了有力的載體。高致病形式的所有爆發都是由亞型 H5和H7的流感A病毒引起。受染地區的檢疫以及受染或暴露群體的毀滅是針對防止禽流感病毒傳播的標準程序。然而，此類措施不僅受阻於高接觸傳染性、易於傳播性以及病毒在其天然宿主體外的長期穩定性，而且就實施此類措施以及對鳥類的毀滅而言，它們還導致巨大的經濟代價。1997年在香港，禽流感病毒的H5W毒株從鳥類直接轉移到人，在18個人身上引發嚴重的呼吸系統疾病，其中6人死亡。此次傳染與由相同毒株引起的禽流感病毒的香港家禽種群流行病同時爆發。2003年的另一次爆發引發2例並且1人死亡。人類感染禽流感病毒的進一步病例已經在幾個國家觀察到，包括荷蘭、越南和中國。另外，鳥類感染H5W毒株的最近爆發已經在東歐特別是土耳其進行了報導。H5N1受到特別關注，原因在於其迅速突變並擅長從感染其他動物種類的病毒捕獲基因。另外，來自H5W的分離株具有高致病性並且能夠在人身上引發嚴重的疾病。從感染中倖存的鳥類經口以及通過糞便排洩病毒至少10天，從而促進了活家禽市場上以及通過候鳥的進一步傳播。有關人感染H5m禽流感病毒的臨床進展的數據非常有限，並且抗病毒藥一其中僅有一些可以被用於治療和預防一也具有局限性。本發明基於生物分子表面展示系統的開發，以及此類系統展示作為疫苗的膜糖蛋白的特定應用。具體而言，本發明涉及治療和/或預防禽流感的方法、疫苗、免疫組合物和試劑盒，以及涉及用於調節對禽流感病毒的免疫應答的相關方法。

發明內容
根據本發明的第一方面，提供用於呈遞或展示多肽的方法，其中所述方法包括(a)將編碼所述多肽的核酸插入杆狀病毒表達載體中，其中所述杆狀病毒表達載體包括來自白斑綜合症病毒的iel啟動子；(b)用所述表達載體轉染至少一種宿主細胞；和(c)從所述表達載體中表達所述多肽，其中所述多肽被呈遞或展示在杆狀病毒的表面膜上。根據本發明的第二方面，提供用於呈遞或展示多肽的系統，其中所述系統包括(a)編碼所述多肽的核酸，其被插入杆狀病毒表達載體中，其中所述杆狀病毒表達載體包括來自白斑綜合症病毒的iel啟動子；(b)用於用所述表達載體轉染至少一種宿主細胞的裝置；和(c)用於從所述表達載體表達所述多肽的裝置，其中所述多肽被呈遞或展示在杆狀病毒的表面膜上。根據本發明的第三方面，提供用於治療或預防受治療者疾病的疫苗，其中所述疾病與禽流感病毒有關，並且其中所述疫苗包括含有編碼血凝素肽的核酸的表達載體，使得在使用時所述血凝素肽通過所述表達載體在所述受治療者中表達。受治療者可以是人、禽或豬。禽流感病毒可以是禽流感病毒的H5M亞型。表達載體可以包括杆狀病毒表達載體。所述杆狀病毒表達載體可以是含有水泡性口膜炎病毒糖蛋白的假性病毒載體。表達載體可以進一步包括啟動子。所述啟動子可以包括來自白斑綜合症病毒的 iel啟動子。該啟動子可以可操作連接至編碼抗原肽的核酸。血凝素肽可以包括來源於禽流感病毒的H5W亞型的胺基酸序列。根據本發明的第四方面，提供用於治療或預防受治療者疾病的疫苗，其中所述疾病與禽流感病毒相關，並且其中所述疫苗包括表達載體，其包含(a)編碼血凝素肽的核酸；和(b)來自白斑綜合症病毒的iel啟動子，其與編碼血凝素肽的所述核酸可操作連接，使得在使用時，所述血凝素肽通過所述受治療者中的所述表達載體表達。根據本發明的第五方面，提供表達載體，其中所述表達載體包括(a)編碼抗原肽的核酸；和(b)與編碼抗原肽可操作連接的、來自白斑綜合症病毒的iel啟動子，其中所述抗原肽包括血凝素肽，其包含來源於禽流感病毒的H5W亞型的胺基酸序列。根據本發明的第六方面，提供第五方面所述的用於治療或預防受治療者疾病中的表達載體，其中所述疾病與禽流感病毒相關，使得在應用時，所述抗原肽通過所述受治療者中的所述表達載體表達。根據本發明的第七方面，提供宿主細胞，其包含第五或第六方面所述的表達載體。根據本發明的第八方面，提供組合物，其包括選自第三或第四方面所述的疫苗、第五或第六方面所述的表達載體或者第七方面所述的宿主細胞的免疫增強劑，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。所述組合物可以任選包括佐劑。根據本發明的第九方面，提供用於治療或預防受治療者疾病的疫苗，其包括第五或第六方面所述的表達載體、第七方面所述的宿主細胞或者第八方面所述的組合物，其中所述疾病與禽流感病毒有關。根據本發明的第十方面，提供用於調節免疫應答的方法，其中所述方法包括向受治療者施用有效量的免疫增強劑，所述免疫增強劑選自第三、第四或第九方面所述的疫苗、 第五或第六方面所述的表達載體、第七方面所述的宿主細胞或者第八方面所述的組合物。根據本發明的第十一方面，提供用於治療或預防與禽流感病毒有關的疾病的方法，其中所述方法包括向受治療者施用有效量的免疫增強劑，所述免疫增強劑選自第三、第四或第九方面所述的疫苗、第五或第六方面所述的表達載體、第七方面所述的宿主細胞或者第八方面所述的組合物。根據本發明的第十二方面，提供第三、第四或第九方面所述的疫苗、第五或第六方面所述的表達載體、第七方面所述的宿主細胞或者第八方面所述的組合物在調節免疫應答方面的用途。根據本發明的第十三方面，提供第三、第四或第九方面所述的疫苗、第五或第六方面所述的表達載體、第七方面所述的宿主細胞或者第八方面所述的組合物，在製造用於治療與禽流感病毒有關的疾病的藥物方面的用途。根據本發明的第十四方面，提供用於治療或預防受治療者疾病的試劑盒，其中所述疾病與禽流感病毒有關，其中所述試劑盒包括第三、第四或第九方面所述的疫苗、第五或第六方面所述的表達載體、第七方面所述的宿主細胞或者第八方面所述的組合物。


現在將參考下列附圖描述本發明，其僅為實例的方式。圖1.重組杆狀病毒的構建和產生。(A) vAc-杆粒、vAc-HA和vAc-G_HA的基因組的示意表示。利用Bac-to-Bac系統，期望的VSV G或HA表達盒經過位點專一轉座被插入多角體蛋白基因座中。(B)在感染vAc-G-HA的Sf9細胞中形成合胞體，如通過白色箭頭所示。圖像在轉導後72小時時捕獲。(C) 一步生長曲線。每個數據點表示三個單獨的感染的平均值。Sf9細胞通過單個病毒來感染，其中MOI為0.5。圖2.展示在杆狀病毒載體表面上的HA的表徵。(A)在純化vAc_HA和vAc-G-HA 顆粒中的HA的膜締合。純化H5W毒粒用作陽性對照。泳道1，純化vAc-杆粒毒粒作為陰性對照；泳道2，純化核衣殼，來自用TritonX-IOO處理的vAc-G-HA毒粒；泳道3，完整的vAc-G-HA毒粒；泳道4，來自用vAc-G-HA感染的Sf9細胞的總細胞提取物；泳道5，來自用vAc-G-HA感染的Sf9細胞的總細胞提取物；泳道6，完整的vAc-HA毒粒；泳道7，純化核衣殼，來自用iTriton X-100處理的vAc-HA毒粒。(B)在純化vAc-G-HA顆粒中VSV G的膜締合。泳道1-4是與(A)相同的樣品。(C)展示HA的杆狀病毒的血凝活性。利用連續兩倍稀釋的純化vAc-G-HA顆粒和每測試孔0. 5%雞紅細胞懸浮液確定血凝滴度，起始稀釋為 1 2。圖3. (A)和(B)HA基因通過vAc-G-HA的轉導。MDCK或Df-I細胞用MOI為100的
6vAc-G-HA轉導。IMi後，固定細胞進行IFA試驗，或者收穫細胞進行蛋白質印跡分析。(A) 在用HAl特異性單克隆抗體的IFA試驗中，轉導哺乳動物細胞的螢光顯微照片。箭頭指向陽性螢光細胞。利用倒置螢光顯微鏡術檢測螢光信號，並通過數字圖像系統捕獲圖像。(B) 利用抗HAl血清，通過蛋白質印跡分析檢測兩種轉導細胞中的HA。泳道1，MDCK細胞提取物；泳道2，Df-I細胞提取物；泳道3，純化的H5W毒粒，作為陽性對照。(C)通過抗原捕獲 ELISA，量化展示在vAc-G-HA毒粒上的HA分子。在試驗中，來自豚鼠的純化IgG和單克隆抗體分別被用作檢測物和捕捉抗體。10倍連續稀釋的HAl蛋白質被用於建立如所示的標準定量曲線。圖4. (A) vAc-G-HA的抗原分析。一組5隻小鼠(M1-M5)被肌內注射vAc-G-HA顆粒。兩隻對照小鼠(Cl和C2)被注射等量的純化vAc-杆粒毒粒。通過ELISA監測誘導抗體，其中HAl蛋白質被包被作為捕捉抗原。結果以1 10稀釋血清的平均吸光度表達。(B) 用vAc-G-HA免疫處理的小鼠的血清HI滴度。HI滴度被表達為兩倍血清稀釋的終點。圖5. (A)展示HA的杆狀病毒的抗原分析。三組5隻小鼠各自被肌內注射 vAc-G-HA、vAc-HA、滅活H5m/PR8和vAc-杆粒。通過ELISA用包被的純HAI蛋白作為捕捉抗原來測試來自各組的收集血清樣品。結果表示為1 10稀釋血清的平均吸光度。(B) 對來自免疫小鼠的收集血清的HI試驗和中和試驗。HI滴度被表達為兩倍血清稀釋中的終點。在中和試驗中，從10至640的2倍系列稀釋液與含有2X 103TCID5(1/ml的流感病毒的等體積病毒稀釋液混合。通過IFA試驗利用多克隆抗HAl抗體監測病毒蛋白質的存在。中和滴度以系列稀釋中的終點表達。定義如本文所用，術語「包括(comprising) 」是指「主要但未必僅僅包括。」此外，詞語 「包括」的變體，諸如「包括(comprise) 」和「包括(comprises) 」具有相應變化的含義。如本文所用，術語「治療(treating) 」和「治療(treatment) 」是指任何和所有用途，其治療病症或症狀，預防病症或症狀的產生，或者另外以其他任何方式預防、阻礙、延遲、改善或逆轉病症或疾病或其他不良的症狀。如本文所用，術語「有效量(effective amount) 」在其含義內包括無毒但是可提供期望效果的足夠量的藥物或化合物。所需的確切數量將在受治療者間有所變化，這取決於諸如被治療的物種、受治療者的年齡和綜合狀態、被治療的病症的嚴重度、被施用的特定藥物以及施用方式之類的因素。因此，規定確切的「有效量」是不可能的。然而，對於任何給定的情況，適當的「有效量」可以由本領域技術人員僅僅利用常規試驗則可以確定。如本文所用，術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」可互換使用來指胺基酸殘基的聚合物以及指它們的片段、變體、類似物、直向同源物(orthologues)或同源物。因此，這些術語適用胺基酸聚合物——其中一個或多個胺基酸殘基是合成的、非天然的胺基酸，諸如相應的天然胺基酸的化學類似物，以及適用天然的胺基酸聚合物。如本文所用，術語「多核苷酸，，或「核酸」可被互換施用並且表示包含一個或多個核苷酸或寡核苷酸或其片段的分子，包括但不限於RNA或DNA核苷酸或其組合。在術語的範圍內，如本文所用的「蛋白質」、「多肽」、「肽」、「多核苷酸」和「核酸」是它們的片段和變體，包括但不限於多核苷酸和核酸的反向互補(reverse compliment)和反義形式。
術語「片段」是指編碼全長蛋白質或基因或者是全長蛋白質或基因的組成部分的多核苷酸或多肽序列。就多肽而言，片段可以具有與全長蛋白質相同的定性生物活性。如本文所用術語「變體」是指基本類似的序列。通常地，核酸序列變體可以編碼具有相同的定性生物活性的多肽。通常地，多肽序列變體也可以具有相同的定性生物活性。此外，這些多肽序列變體可以共享至少50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%, 95%、96%、97%、98%或99%的序列同同一性。此外，變體多肽可以包括類似物，其中術語「類似物」是指為所公開多肽的衍生物的多肽，該衍生物包括一個或多個胺基酸的添加、缺失或取代，使得多肽基本保留與其所衍生的天然多肽相同的功能。如本文所用，術語「表達載體」是指核酸，其具有提供其可操作連接的核酸片段在細胞或無細胞表達系統中進行表達的能力。在本發明的上下文中，應當理解，包括如本文所定義的啟動子的表達載體可以是質粒、噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒亞基因組或基因組片段， 或者其他能夠保持和/或複製可表達形式的異源DNA的核酸，如果其被引入細胞中的話。如本文所用，術語「可操作連接」是指轉錄和翻譯調節的多核苷酸，其相對於編碼多肽的多核苷酸以使得多核苷酸被轉錄以及多肽被翻譯的方式進行定位。如本文所用，術語「啟動子」包括基因組基因的轉錄調節序列，其包括TATA框或起始子元件，其可以是精確轉錄起始必需的，具有或不具有另外的調控元件，所述調控元件響應發育和/或外刺激或者以組織特異性方式改變基因表達。在本發明的上下文中，術語「啟動子」也被用於描述重組、合成或融合分子，或者衍生物，其賦予、激活或增強其可操作連接的核酸以及編碼肽的核酸的表達。如本文所用，短語「禽流感病毒」包括引發或懷疑引發受治療者疾病的任何病毒， 其包括但不限於禽、豬或人類受治療者。具體而言，「禽流感病毒」包括所有類型的禽流感病毒，包括但不限於A型，以及禽流感病毒的所有亞型，包括但不限於亞型H5 (特別是H5W 和H5N2)和H7 (特別是H7N1)。如本文所用，短語「與禽流感病毒有關的疾病」是指由禽流感病毒引起或與其有關的任何疾病、疾病狀態或病症。如本文所用，術語「調節(modulating)，，當涉及免疫應答使用時，是指直接或間接增加或減小對抗原的免疫應答。
具體實施例方式本發明人已經開發了生物分子表面展示系統，以及其展示作為疫苗的膜糖蛋白的特定應用。具體而言，本發明人已經通過協同表面展示以及病毒血凝集素(HA)蛋白質的基因轉導展示了杆狀病毒表達系統作為對抗流感病毒的免疫試劑的應用。免疫顯性病毒膜HA 蛋白質以及VSV G蛋白在重組杆狀病毒表面上的有效展示在對抗流感病毒的接種疫苗策略上提供很大的優勢。除這種杆狀病毒表達系統作為接種疫苗載體的應用之外，病毒膜展示系統也可以被用於表徵很多種病毒膜糖蛋白的結構和功能。在來自白斑綜合症病毒的iel啟動子的控制下，利用杆狀病毒載體，H5N1流感病毒的HA基因被有效表達在昆蟲和哺乳動物細胞中。HA與水泡性口膜炎病毒糖蛋白的同時展示不會降低在杆狀病毒表面上HA展示的效力。部分裂解的HA蛋白質被展示在杆狀病毒表面上，從而賦予病毒顆粒血凝活性。將展示HA的純化杆狀病毒肌內注射進入小鼠中刺激了具有血凝抑制活性的抗體的產生。這種杆狀病毒表達系統因此包含抗原HA肽作為結構蛋白並且維持通過體內轉導表達肽的能力。呈遞或展示生物分子的方法、試劑盒和系統本發明公開了生物分子表面展示系統，以及此類系統展示作為疫苗的膜糖蛋白的特定應用。如對於本領域技術人員顯而易見的是，這些生物分子表面展示系統不限於在此所公開的特定應用，而是在期望呈遞生物分子特別是膜糖蛋白的任何情況下找到廣泛應用。因此，在一個實施方式中，本發明公開了涉及膜糖蛋白表面展示的疫苗生產的方法、試劑盒和系統。這些方法、試劑盒和系統可以利用在此所示例的基於杆狀病毒的表面展示系統，其與抗毒株H5m禽流感病毒的疫苗生產相關。然而，本領域技術人員將意識到並且理解，涉及膜糖蛋白表面展示的疫苗生產的方法、試劑盒和系統並不限於本文所公開的疫苗的生產。因此，本發明提供用於呈遞或展示多肽的方法，其中所述方法包括(a)將編碼所述多肽的核酸插入杆狀病毒表達載體中，其中所述杆狀病毒表達載體包括來自白斑綜合症病毒的iel啟動子；(b)用所述表達載體轉染至少一種宿主細胞；和(c)從所述表達載體中表達所述多肽，其中所述多肽被呈遞或展示在杆狀病毒的表面膜上。本發明進一步提供用於呈遞或展示多肽的系統，其中所述系統包括(a)編碼所述多肽的核酸，其被插入杆狀病毒表達載體中，其中所述杆狀病毒表達載體包括來自白斑綜合症病毒的iel啟動子；(b)用所述表達載體轉染至少一種宿主細胞的方法；和(c)用於從所述表達載體表達所述多肽的方法，其中所述多肽被呈遞或展示在杆狀病毒的表面膜上。疫苗本發明也提供用於治療或預防受治療者疾病的疫苗，其中所述疾病與禽流感病毒有關，並且其中所述疫苗包括含有編碼血凝素肽的核酸的表達載體，使得在使用時所述血凝素肽通過所述表達載體在所述受治療者中表達。受治療者可以是人、禽或豬。禽流感病毒可以是禽流感病毒的H5M亞型。表達載體可以包括杆狀病毒表達載體。所述杆狀病毒表達載體可以是具有水泡性口膜炎病毒糖蛋白的假性病毒載體。表達載體可以包括啟動子。所述啟動子可以包括來自白斑綜合症病毒的iel啟動子。該啟動子可以可操作連接至編碼抗原肽的核酸。血凝素肽可以包括來源於禽流感病毒的H5W亞型的胺基酸序列。本發明也包括用於治療或預防受治療者疾病的疫苗，所述疫苗包括如本文所述的表達載體、宿主細胞或組合物，其中所述疾病與禽流感病毒有關。表達載體和宿主細胞
本發明也提供包含編碼抗原肽的核酸的表達載體，其中所述抗原肽包括血凝素肽，該血凝素肽包括來源於禽流感病毒的H5m亞型的胺基酸序列。本發明進一步提供包含編碼抗原肽的核酸的表達載體，用於治療或預防受治療者疾病，其中所述疾病與禽流感病毒相關，使得在應用時，所述抗原肽通過所述受治療者中的所述表達載體表達。本發明也提供包含如本文所述的表達載體的宿主細胞。組合物和免疫增強劑本發明包括組合物，所述組合物包括免疫增強劑以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，所述免疫增強劑選自如本文所述的疫苗、表達載體或宿主細胞。免疫增強劑可以被配製成作為中性或鹽形式的組合物。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(利用肽的自由氨基基團形成)，並且其利用無機酸形成，例如，諸如鹽酸或磷酸，或利用此類有機酸形成，諸如乙酸、草酸、酒石酸、馬來酸等。利用自由羧基形成的鹽也可以衍生自無機鹼，例如，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及衍生自此類有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。一般而言，合適的組合物可以根據本領域技術人員已知的方法製備，並且可以包括藥學上可接受的稀釋劑、佐劑和/或賦形劑。就與該組合物的其他成分相容而言，稀釋劑、佐劑和賦形劑必須是「可接受的」並且對其受體無毒。藥學上可接受的稀釋劑的實例是去礦質水或蒸餾水；鹽水溶液；植物基油，諸如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油，諸如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；矽油，包括聚矽氧烷，諸如甲基聚矽氧烷、苯基聚矽氧烷和甲基苯基聚矽氧烷(polysolpoxane)；揮發性矽酮；礦物油，諸如液體石蠟、軟石蠟或角鯊烷；纖維素衍生物，諸如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素鈉；低碳烷醇，例如乙醇或異丙醇；低碳芳烷醇(aralkanols)；低碳聚烷撐二醇或低碳烷撐二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3_ 丁二醇或甘油；脂肪酸酯，諸如棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；瓊脂；角叉菜聚糖； 黃蓍膠或阿拉伯膠和石油凝膠。通常，載體或多種載體將是組合物重量的至99. 9%。最優選地，稀釋劑是鹽水。對於作為可注射溶液或懸浮液的施用，無毒的腸胃外接受的稀釋劑或載體可以包括林格氏溶液、中鏈甘油三酯(MCT)、等滲鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、乙醇和1，2丙二醇。用於經口應用的一些合適載體、稀釋劑、賦形劑和佐劑的實例包括花生油、液體石蠟、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、藻酸鈉、阿拉伯膠、黃蓍膠、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明膠和卵磷脂。另外，這些口服製劑可以含有合適的增香劑和著色劑。當以膠囊形式使用時，膠囊用化合物包衣，諸如延遲崩解的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。佐劑通常包括軟化劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、殺菌劑和緩衝劑。口服給藥的固體形式可以含有在人和獸醫製藥實踐中可接受的粘合劑、增甜劑、 崩解劑、稀釋劑、調味料、包衣劑、防腐劑、潤滑劑和/或時間延遲劑。合適的粘合劑包括阿拉伯膠、明膠、玉米澱粉、黃蓍膠、藻酸鈉、羧甲基纖維素或聚乙二醇。合適的增甜劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿司帕坦或糖精。合適的崩解劑包括玉米澱粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜爾膠、黃原膠、膨潤土、藻酸或瓊脂。合適的稀釋劑包括乳糖、山梨醇、甘露醇、葡萄
10糖、高嶺土、纖維素、碳酸鈣、矽酸鈣或磷酸二鈣。合適的增香劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃、 橙子或樹莓調味料。合適的包衣劑包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它們的酯的聚合物或共聚物、蠟、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、蟲膠或谷蛋白。合適的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素Ε、α-生育酚、抗壞血酸、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。合適的潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石。除上述物質之外，口服給藥的液體形式可以含有液體載體。合適的液體載體包括水；油，諸如橄欖油、花生油、芝麻油、葵花籽油、紅花油、花生油、椰子油、液體石蠟、乙二醇、 丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、異丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或它們的混合物。用於口服給藥的懸浮液可以進一步包含分散劑和/或懸浮劑。合適的懸浮劑包括羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸鈉或乙醯醇 (acetyl alcohol)。合適的分散劑包括卵磷脂、脂肪酸如硬脂酸的聚氧乙烯酯、聚氧乙烯山梨糖醇的單油酸酯或二油酸酯或硬脂酸酯或月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐的單油酸酯或二油酸酯或硬脂酸酯或月桂酸酯等。用於口服給藥的乳劑可以進一步包含一種或多種乳化劑。合適的乳化劑包括上面所示例的分散劑或天然膠，諸如瓜爾膠、阿拉伯膠、或黃蓍膠。製備可腸胃外施用的組合物的方法對本領域技術人員而言是顯而易見的，並且更詳細地描述在例如 Remington 的 Pharmaceutical Science, 15th ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pa.中，其因此通過參考併入本文。所述組合物可以引入任何合適的表面活性劑，諸如陰離子、陽離子或非離子表面活性劑，如脫水山梨醇酯或它們的聚氧乙烯衍生物。也可以包括懸浮劑諸如天然膠、纖維素衍生物或無機材料諸如矽酸鹽質二氧化矽(silicaceous silicas)，以及其他成分如羊毛脂。一種或多種免疫增強劑可以被用作免疫增強組合物製備中的活性物。此類製備利用本領域技術人員已知的常規方法。典型地，此類組合物被製備作為以液體溶液或懸浮液的注射劑，；也可以製備固體形式，其適合在注射之前溶解或懸浮在液體中。製劑也可以是乳化的。活性免疫增強成分經常與賦形劑混合，該賦形劑是藥學上可接受的並且與活性成分相容。給藥途徑根據本發明的方法，疫苗和組合物可以通過任何合適的途徑施用，或者全身、區域性或局部施用。在任何給定環境中所使用的任何特定給藥途徑將取決於多種因素，其包括被治療的疾病的性質、疾病的嚴重度和程度、被輸送的具體化合物所需的劑量以及期望疫苗或組合物的潛在副作用。例如，在要求適當濃度的期望疫苗或組合物被直接輸送至被治療部位的情況下， 給藥可以是局部的而非全身性的。局部給藥提供向所需部位輸送非常高濃度的期望疫苗或組合物的能力，並因此適合實現期望的治療或預防效果，同時避免身體的其他器官暴露於疫苗或組合物並因此潛在降低副作用。舉例來說，根據本發明實施方式的給藥可以通過任何標準途徑來實現，其包括腔內、膀胱內、肌內、動脈內、靜脈內、皮下、局部或經口。腔內給藥可以是腹膜內的或胸膜內的。
如果期望，含有免疫增強劑的適於持續釋放或間歇釋放的器件或組合物實際上可以被植入體內或者被局部施用於身體，以將此類物質緩慢釋放到身體中。表達載體或宿主細胞的施用可以包括通過直接口服、全身注射的輸送，或者輸送至選擇的組織(一種或多種)或細胞，或者間接通過輸送至從受治療者或相容供體分離的細胞而進行的輸送。關於基於核酸的組合物，此類組合物所有的輸送方式被本發明考慮在內。這些組合物向動物細胞或組織的輸送可以通過例如微粒轟擊、脂質體介導的轉染(例如，脂質轉染試劑或脂質轉染胺)、電穿孔術、磷酸鈣或DEAE-葡聚糖-介導的轉染來促進。在可選的實施方式中，合成構建物可以以「裸露DNA」組合物的形式被用作治療或預防組合物，這在本領域是已知的。合適的輸送方法的討論可以發現於⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLE⑶LAR BIOLOGY (Eds. Ausubel 等 John Wiley & Sons Inc.，1997 版本)的第 9 章以及國際網際網路站點DNAvaccine.com上。組合物可以通過皮內(例如，使用pan jet 輸送)或肌內途徑施用。將合成多核苷酸引入靶細胞的步驟取決於意圖應用和物種將是不同的，並且可以包括一種或多種非病毒和病毒載體、陽離子脂質體、逆轉錄病毒和杆狀病毒，諸如，如在 Mulligan,R. C. , (1993 Science 260 926-932)中所述，其因此通過參考併入。這些方法可以包括例如A.通過注射(Wolff等，1990，Science 247 1465-1468，其因此通過參考併入)、 外科植入、滴注法或任何其他方法，局部施用合成多核苷酸。該方法也可以與通過注射、外科植入、滴注法或任何其他方法來局部施用應答合成多核苷酸編碼的蛋白質的細胞結合使用，以便增加該治療的效力。該方法也可以與通過注射、外科植入、滴注法或任何其他方法來局部施用所述蛋白質活性所需的另一因子或多個因子結合使用。B. —般的全身輸送，其通過 DNA(Calabretta 等，1993，Cancer Treat. Rev. 19 169-179，其因此通過參考併入)或RNA的單獨注射，或與脂質體(Zhu等，1993，Science 261 209-212，其因此通過參考併入)、病毒衣殼或納米顆粒(Bertling等，1991，Biotech. Appl.Biochem. 13 390-405，其因此通過參考併入)或其他任何輸送介質一起注射進行。改善的靶向作用可以通過下述方式實現通過連接合成的多核苷酸與靶向分子(所謂的「魔彈(magic bullet)」方法，其利用例如抗體)，或者通過注射、外科植入、或任何其他方法來局部施用所述合成多核苷酸編碼的蛋白質的活性所需的另一種因子或多種因子或應答所述蛋白質的細胞。C.通過任何方法注射或植入或輸送細胞，所述細胞已經通過轉染(例如，在磷酸鈣存在下=Chen等，1987，Mole. Cell Biochem. 7 2745-2752，或者在陽離子脂質和多胺存在下Rose等，1991，BioTech. 10 520-525，該文章通過參考併入本文)、感染、注射、電穿孔(Siigekawa等，1988，BioTech. 6 742-751，其通過參考併入本文)或任何其他方式進行體外修飾，以便增強所述合成多核苷酸在這些細胞中的表達。該修飾可以通過下述各項介導質粒、噬菌體、粘粒、病毒(諸如腺病毒或逆轉錄病毒；Mulligan，1993，Science 260 926-932 ；Miller,1992, Nature 357 455-460 ；Salmons 等，1993，Hum. Gen. Ther. 4 129-141，該文章通過參考併入本文)或其他載體，或者其他修飾劑，諸如脂質體(Zhu等， 1993，Science 261 209-212，其通過參考併入本文)，病毒核殼或納米粒子(Bertling等，1991，Biotech. Appl. Biochem. 13 390-405,其通過參考併入本文)，或者任何其他修飾介體。細胞作為基因或基因產物的輸送載體的應用已經由Barr等，1991，Science 2541507-1512 和 Dhawan 等，1991，Science 254 1509-1512 予以描述，這些文章通過參考併入本文。所處理的細胞可以與任何養分、生長因子、基質或者將會促進它們在治療受治療者中存活的其他物質結合輸送。組合物也可以以脂質體的形式輸送。脂質體通常來源於磷脂類或其他脂質物質， 並且通過分散在水介質中的單層或多層水合液晶形成。可以使用任何無毒的、生理學上可接受以及可代謝的、能夠形成脂質體的脂質。脂質體形式的組合物可以含有穩定劑、防腐劑、賦形劑等。優選的脂質是天然及合成的磷脂類以及磷脂醯膽鹼(卵磷脂)。形成脂質體的方法在本領域是已知的，關於這方面，具體參考Prescott，Ed.，Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N. Y. (1976)，p. 33，其內容通過參考併入本文。齊[J量對於任何具體受治療者，所施用化合物的有效劑量水平將取決於很多因素，包括 被治療疾病的類型以及疾病的階段；所使用的化合物的活性；所使用的組合物；受治療者的年齡、體重、一般健康、性別和飲食；給藥時間；給藥途徑；化合物的螯合速率；治療的持續時間；與治療結合或同時使用的藥物，以及本領域已知的其他相關因素。本領域技術人員將通過常規試驗確定治療適用病症所需的有效的無毒的劑量。這些最通常將在個案基礎上確定。就重量而言，對患者施用的治療有效的組合物劑量預期在大約0. Olmg至約 150mg/kg體重Ι Α小時的範圍內；典型為大約0. Img至約150mg/kg體重IlA小時的範圍內；大約0. Img至約100mg/kg體重IlA小時的範圍內；大約0. 5mg至約100mg/kg體重IlA 小時的範圍內；或者大約l.Omg至約100mg/kg體重Λ4小時的範圍內；更典型地，有效劑量預期在大約5mg至約50mg/kg體重/24小時的範圍內。可選地，有效劑量可以達到大約5000mg/m2。一般而言，有效劑量預期在大約10至約5000mg/m2的範圍內，典型在大約10至約2500mg/m2、大約25至約2000mg/m2、大約50至約1500mg/m2、大約50至約1000mg/m2、或大約75至約600mg/m2的範圍內。此外，對於本領域技術人員將顯而易見的是，最佳的單劑量的數量以及間隔將由被治療的病症的性質和程度、給藥的形式、途徑和位點以及被治療的具體個體的性質確定。 此外，這些最佳條件可以通過常規技術來確定。對本領域技術人員同樣顯而易見的是，最佳療程，諸如每單位時間所給予的組合物劑量的次數可以由本領域技術人員利用常規治療測定試驗過程來確定。治療方法同樣被本發明考慮在內的是調節免疫應答的方法，其中所述方法包括向受治療者施用有效量的免疫增強劑，所述免疫增強劑選自如在本文所述的疫苗、表達載體和宿主細胞。另外，本發明提供用於治療或預防與禽流感病毒有關的疾病的方法，其中所述方法包括向受治療者施用有效量的免疫增強劑，所述免疫增強劑選自如在本文所述的疫苗、 表達載體和宿主細胞。
免疫接種功效評估可以利用任何合適的技術來評估按照本發明方法進行的免疫接種的效力。例如， 可以利用受激脾細胞或外周血單核細胞(PBMC)對肽包被的或重組病毒感染的細胞用51Cr 標記的靶細胞進行CTL裂解試驗。此類試驗可以利用例如靈長類動物、小鼠或人細胞來進行(Allen 等，2000，J. Immunol. 164(9) :4968-4978 以及下文的 Woodberry 等)。可選地，免疫接種的功效可以利用一種或多種技術來監測，所述技術包括但不限於新鮮和受激PBMCs 的HLA I類四聚體染色(例如參見前述Allen等)、增殖試驗(前述Allen等)、ElispotTM 試驗以及胞內INF-Y染色(前述Allen等)、線性B細胞應答的ELISA試驗，以及表達如本文所述的抗原肽的細胞樣品的蛋白質印跡。試劑盒本發明提供用於治療或預防受治療者疾病的試劑盒，其中所述疾病與禽流感病毒有關，並且其中所述試劑盒包括如本文所述的疫苗、表達載體、宿主細胞或組合物。典型地，用於實施本發明方法的試劑盒含有實施該方法的所有必需試劑。典型地， 本發明的試劑盒將包含一種或多種容器，其含有例如洗滌試劑和/或能夠將結合組分從多肽或其片段中釋放的其他試劑。在本發明的上下文中，具有隔室的試劑盒包括試劑被包含在單獨容器中的任何試劑盒，並且可以包括小的玻璃容器、塑料容器或者塑料條或紙條。此類容器可以允許試劑從一個隔室有效轉移至另一隔室，同時避免樣品和試劑的交叉感染，以及允許每個容器的物質或溶液從一個隔室以定量的方式加至另一隔室。此類試劑盒也可以包括容納測試樣品的容器、含有試驗中所用的聚合物的容器以及含有洗滌試劑的容器(諸如磷酸鹽緩衝鹽水、 三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩衝液等)。典型地，本發明的試劑盒也將包括使用該試劑盒組分以實施適當方法的說明書。本發明現在將通過參考下面的實施例進行描述，所述實施例不應當以任何方式解釋為限定本發明的範圍。實施例實施例1 重組杆狀病毒HA-表達盒的構建H5W流感病毒的血凝素(HA)是負責產生中和抗體的兩種主要膜病毒糖蛋白之一(Bosch 等，1979，Kawaoka and Webster 1988)。為確定產生對抗 H5m (A/Goose/ Guangdong/3/97/H5Nl)病毒的杆狀病毒基疫苗的潛力，本發明人構建了兩種重組杆狀病毒表達載體，每種含有HA-表達盒。第一種杆狀病毒表達載體用在白斑綜合症病毒(WSSV) iel 啟動子的控制下與HA-表達盒一起產生，被稱為vAc-HA (圖1A)。第二種杆狀病毒表達載體用在杆狀病毒多角體蛋白啟動子的控制下與HA-表達盒和附加的水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV G)-表達盒一起產生，被稱為vAc-G-HA(圖1A)。為了產生重組杆狀病毒載體，根據Bac-To-Bac系統的方案(Invitrogen)，AcMNPV 多角體蛋白啟動子控制的VSV G表達盒或WSSV iel啟動子控制的HA表達盒被插入穿梭載體pFastBacl中，並被整合到DH IOB AC 內的杆狀病毒基因組中。對照病毒vAc-杆粒也通過將空pFastBacl載體整合到杆粒基因組中而被構建(圖1A)。期望的VSV G或HA表達盒利用Bac-To-Bac系統通過位點專一轉座被插入多角體蛋白基因座中。帶有β-球蛋白終止子的VSV G CDNA然後利用引物5' -CGCGGATCCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAG-3『 (SEQ ID NO 1)和 5 『 -CCCAAGCTTCCAACACACTATTGCAATGAA-B' (S EQ ID NO 2)從pVSV-G進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。VSV G cDNA被放置在多角體蛋白啟動子的下遊，多角體蛋白啟動子利用引物5' -TCCCCCGGGGGATGGTTGGCTACGTATACTCCG-3' (SEQ ID NO :3)和5『 -CGCGGATC CGGTTTCGGACCGAGATCCGC-3 『 (SEQ ID NO 4)從杆粒基因組進行 PCR 擴增。HAcDNA 利用引物組5' -ATAAGAATGCGGCCGCTATGGAGAAAACAGTGCTTCTTCTTG-3' (SEQ ID NO 5)禾口5 『 -CCGCTCGAGCGGTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAACGATC-3 『 (SEQID NO 6)通過 RT-PCR從H5m病毒的基因組擴增。HA cDNA然後被放置在pFastBacl載體中的SV40終止子的上遊以及iel啟動子的下遊，iel啟動子利用引物組5' -TCCCTACGTATCAATTTTATGTGG CTAATGGAGA-3 『 (SEQ ID NO 7)禾口 5'-ACGCGTCGACCTTGAGTGGAGAGAGAGCTAGTTATAA-3' (SEQ ID NO :8)從 WSSV 基因組 (Lu等，200 擴增。利用vAc-G-HA感染昆蟲Sf9細胞產生大量的細胞-細胞融合(圖1B)。表型是通過多角體蛋白啟動子引起的具有膜融合活性的VSV G蛋白質的非常高的表達水平導致的。通過產生感染病毒生產的一步生長曲線也檢驗了 Sf9細胞中的毒粒生產的動力學(圖1C)。這些病毒生長曲線的時間動力學(Lu等，2003)是類似的，儘管VAc-G-HA的峰值毒粒生產落在vAc-HA和對照vAc-杆粒之後。vAc-G-HA的滴度在120h p. i.增加至 109PFU(噬斑形成單位)/ml，而vAc-HA和vAc-杆粒在96h p. i.產生同樣的滴度(圖1C)。 傳染vAc-G-HA的Sf9細胞中大量合胞體形成可能會延遲後期感染中毒粒的釋放。實施例2 血凝素的膜展示本發明人通過超離心從受染昆蟲細胞的上清液中純化了 vAc-HA、vAc-G-HA和 vAc-杆粒。為研究HA是否被展示在vAc-HA和vAc-G-HA的膜上，將純化的毒粒用1 % Triton X-100處理15分鐘，以破裂病毒膜結構，然後通過超離心收集病毒核衣殼。為產生抗HA蛋白質的抗體，從杆狀病毒感染的SF9細胞中表達並純化His6-標記Hal，其中在利用His6-標記Hal作為抗原的豚鼠中出現抗HA蛋白質的多克隆抗體。蛋白質印跡分析顯示，在用Triton X-100處理之前在純化的毒粒中檢測到HA，在已收集的僅由病毒核衣殼組成的沉澱中未檢測到(圖2A)。發現，在受染SF9細胞以及在純化的vAc-G-HA顆粒中，HA被部分切割為Hal和 HA2，其類似於純化H5W毒粒的情況(圖2A)。這些數據表明，杆狀病毒載體可以展示類似 HA的病毒糖蛋白，並對其天然產物具有類似的翻譯後修飾。利用抗-VSV G單克隆抗體的蛋白質印跡試驗也顯示，VSVG在純化的vAc-G-HA毒粒中是膜締合的結構成分(圖2B)。為確定杆狀病毒表面展示的HA蛋白質是否維持真正的生物性質，測試vAc-HA和 vAc-G-HA的純化毒粒的血凝活性(圖2C)。利用標準血凝試驗(Wood等，1985)，各25 μ 1 的101QPFU/ml滴度的vAc-HA或vAc-G-HA產生大約28的血凝滴度。結果表明，VSV G與HA 的聯合展示將不會顯著降低HA在杆狀病毒膜上的展示效率。實施例3 =VAc-G-HA轉導能力因為VSV G提供優於vAc-HA的vAc-G-HA轉導優勢，因此實施體內接種試驗，以評估vAc-G-HA的轉導能力。在細胞系(1)犬MDCK和(2)雞Df-I細胞中進行轉導試驗(Hsu等，2004)。圖3A顯示，vAc-G-HA有效地轉導這些細胞系，如通過陽性螢光細胞所示。該表達進一步通過用豚鼠中出現的抗HAl血清的蛋白質印跡分析總細胞提取物證實，如在圖:3B 中所示。為進一步監測在vAc-G-HA表面上展示的HA分子的數量，基於豚鼠抗-HAl多克隆抗血清和HAl單克隆抗體，開發了抗原捕獲ELISA，如先前所報告(He等，2005)。從杆狀病毒感染的SF9細胞表達和純化His6-標記的HAl。為了利用Bado-Bac 系統的pFast Hta載體構建表達HAl的杆狀病毒，HAl編碼序列利用引物組5' -CGCGGATCCGATGGAGAAAACAGTGCTTCTTCTTTG-3' (SEQ ID NO :9)和5『 -CGGGG TACCCTCTCTTTGAGGGGTATTTCT-3『 (SEQ ID NO 10)從上述HAcDNA擴增。對於蛋白質表達， Sf9細胞用MOI為5的重組病毒感染並在72h p. i.收穫。His6-標記HAl蛋白質從總細胞提取物的純化利用載有Ni2+的樹脂漿(resin slurry)進行。通過用來自豚鼠的純化IgG塗敷微量滴定板來設計抗原捕獲ELISA。結合抗原然後用含有HAl-特異性單克隆抗體的雜交瘤上清液來檢測。使用10-倍連續稀釋的HAl蛋白質來建立標準量化曲線。vAc-G-HA樣品中的HAl的量以標準曲線中的點值來確定，其表示在490nm下具有相同的吸光度(圖3C)。根據該曲線，發現101QPFU/ml滴度下各25 μ 1 vAc-G-HA含有大約50ng HAl0這些發現表明，HA蛋白質維持真正的血凝活性並且被有效地展示在杆狀病毒的表面上。實施例4 =VAc-G-HA的免疫原性然後通過用純化的vAc-G-HA毒粒肌內免疫接種6_8周BALB/c小鼠，研究 vAc-G-HA的免疫原性。在用5X IO9PFU的vAc-G-HA顆粒接種之後4周時，用相同數量的毒粒加強免疫小鼠。一周後，經眼後血管叢(retroorbital plexus)對小鼠採血，並通過 ELISA和血凝抑制反應(HI)試驗(Wood等，198 單獨測試來自各動物的血清中抗HA的抗體。通過用每孔60ng純化的His6-標記HAl蛋白質塗敷96孔微量培養板建立ELISA 測試，以監測HA-特異性抗體水平。如在圖4A中所示，所有5個免疫處理的小鼠產生了顯著的抗體應答，如通過ELISA所檢測到的，在ELISA中，純化HAl蛋白質被塗敷作為抗原。用 vAc-杆粒免疫處理的兩個對照小鼠僅展示背景血清滴度。vAc-G-HA在所有5隻免疫處理小鼠中誘導了血清HI抗體應答，其滴度在23至25 範圍內(圖4B)。HI抗體應答與用活H5流感病毒鼻內接種的那些小鼠相當，其顯示24至 27範圍內的滴度，如由Takada等(1999)所報告。來自接種vAc-G-HA的小鼠的專一的及顯著的抗體應答表明，展示在病毒表面上或者通過病毒轉導表達的HA分子維持其抗原性。為進一步表徵vAc-G-HA和vAc-HA的免疫原性，7周BALB/c小鼠(每組5隻小鼠)利用純化毒粒進行肌內免疫處理。使用從MDCK細胞擴增的滅活H5m/PR8疫苗株作為陽性對照，vAc-杆粒接種的小鼠作為陰性對照。在用256HA單位的純化杆狀病毒顆粒或滅活H5m/PR8病毒肌內接種之後4周時，用相同數量的毒粒對小鼠加強免疫。一周後，經眼後血管叢(retro-orbital plexus)對小鼠採血，並通過He等，2005所述的ELISA以及通過 Wood等，1985所述的血凝抑制反應(HI)試驗，單獨測試來自每組5隻小鼠的混合血清中的抗HA抗體。通過用每孔60ng純化His6-標記HAl蛋白質塗敷96孔微量培養板建立ELISA 測試，以監測HA-特異性抗體水平。
如在圖5A中所示，用vAc-HA或vAc-G-HA免疫處理的小鼠發展了顯著的抗體應答，其通過ELISA檢測，在ELISA中，純化的HAl蛋白質被塗敷作為抗原。用vAc-杆粒免疫處理的小鼠僅展示背景血清滴度。vAc-G-HA和vAc-HA在免疫處理小鼠中都誘導了血清HI 抗體應答，其滴度為26(圖5B)。杆狀病毒載體的HI滴度與用疫苗株H5m/PR8接種的那些小鼠具有的28的平均滴度相當(圖5B)。在ELISA試驗中，由vAc-G-HA誘導的抗體應答比vAc_HA誘導的抗體應答高大約 18%。令人驚訝的是，H5m/PR8疫苗株誘導更高水平的抗體應答，如通過ELISA所示。因此，誘導的抗血清顯示比展示HA的杆狀病毒高四倍的HI活性(圖5A和5B)。來自杆狀病毒接種小鼠的專一性及顯著的抗體應答表明，展示在病毒表面上或者通過病毒轉導表達的 HA分子維持其真正的抗原性。然後通過展示HA的杆狀病毒測試誘導抗體的體外中和能力。如先前由Rowe等， 1999所報告的，進行基於H5m/PR8和MDCK細胞系統的標準微量中和試驗。由兩種展示HA 的杆狀病毒誘導的血清顯示80的重大中和滴度，而H5m/PR8誘導血清給出160的更高滴度(圖5B)。參考文獻Bosch, F. X.，M. Orlinch, H. D. Klenk, and R. Rott. 1979. The structure of the hemagglutinin, a determinant for the pathogenicity of influenza viruses. Virology. 95 :197-207.He, Q. , Q. Du, S. Lau, I. Manopo, L. Lu, S. W. Chan, BJ. Fenner, and J. kwang. 2005. Characterization of monoclonal antibody against SARS coronavirus nucleocapsid antigen and development of an antigen capture ELISA. J. Virol. Methods. 127 :46-53.Hsu, C, Y. Ho, K. Wang,and Y. Hu. 2004. Investigation of optimal transduction conditions for baculo virus-mediated gene delivery into mammalian cells. Biotechnol. Bioeng. 88 :42-51.Kawaoka, Y. and R. G. Webster. 1988. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. ProcNatl Acad Sci USA. 85 :324-328. Lu, L. , Q. Du, and N. Chejanovsky. 2003. Reduced expression of the immediate-early protein IEO enables efficient replication of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus in poorly permissive Spodoptera littoralis cells. J. Virol. 77 :535-545.Lu, L. , H. Wang, I. Manopo, L. Yu, and J. Kwang. 2005. Baculovirus-mediated promoter assay and transcriptional analysis of white spot syndrome virus orf427 gene. Virol. J. 2 :71.Takada, A. , N. Kuboki, K. Okazaki, A. Ninomiya, H. Tanaka, H. Ozaki, S. Itamura, H. Nishimura, M. Enami, M. Tashiro, K. F. Shortridge, and H. Kida. 1999. Avirulent Avian influenza virus as a vaccine strain against a potential human pandemic. J. Virol 73 :8303-8307.Wood, J. Μ. , Y. Kawaoka, L. A. Newberry, E. Bordwel 1, and R. G. Webster. 1985. Standarization of inactivated H5N2 influenza vaccine and efficacy against
17lethal A/chicken/Pennsylvania/1370/83 infection. Avian Dis. 29 :867-872.
Rowe Τ, Abernathy RA, Hu-Primmer J,Thompson WW,Lu X, Lim W, Fukuda K, Cox NJ,Katz JM. 1999 Detection of antibody to avian influenza A (H5N1)virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 1999 Apr ； 37(4) :937-43.
權利要求
1.用於治療或預防受治療者疾病的疫苗，其中所述疫苗包含表達載體，所述表達載體包含(a)編碼抗原肽的核酸；和(b)來自白斑綜合症病毒的iel啟動子，其與編碼抗原肽的所述核酸可操作連接，使得在使用時，所述抗原肽通過所述表達載體所述受治療者中表達。
2.根據權利要求1所述的疫苗，其中所述表達載體包括杆狀病毒表達載體。
3.根據權利要求1或2所述的疫苗，其中所述受治療者選自人、禽或豬。
4.根據權利要求1或2所述的疫苗，其中所述抗原肽是膜糖蛋白。
5.表達載體，其中所述表達載體包含(a)編碼抗原肽的核酸；和(b)與編碼抗原肽的核酸可操作連接的、來自白斑綜合症病毒的iel啟動子。
6.權利要求5所述的表達載體，用於治療或預防受治療者疾病，其中所述疾病與病毒相關，使得在應用時，所述抗原肽通過所述表達載體所述受治療者中表達。
7.根據權利要求5或6所述的表達載體，其中所述抗原肽是膜糖蛋白。
8.包含權利要求5、6或7任一項所述的表達載體的宿主細胞。
9.組合物，其包括選自由根據權利要求1至4任一項所述的疫苗、根據權利要求5、6或 7任一項所述的表達載體或者根據權利要求8所述的宿主細胞組成的組的免疫增強劑，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
10.根據權利要求9所述的組合物，其進一步包括佐劑。
11.用於治療或預防受治療者疾病的疫苗，其包括根據權利要求5、6或7任一項所述的表達載體、根據權利要求8所述的宿主細胞或根據權利要求9所述的組合物，其中所述疾病與病毒有關。
12.根據權利要求1至4或11任一項所述的疫苗、根據權利要求5、6或7任一項所述的表達載體、根據權利要求8所述的宿主細胞或根據權利要求9或10所述的組合物，在製造用於調節免疫應答的藥物中的用途。
13.根據權利要求1至4或11任一項所述的疫苗、根據權利要求5、6或7任一項所述的表達載體、根據權利要求8所述的宿主細胞或根據權利要求9或10所述的組合物，在製造用於治療與病毒有關的疾病的藥物中的用途。
14.用於治療或預防受治療者疾病的試劑盒，其中所述疾病與病毒有關，並且其中所述試劑盒包括根據權利要求1至4或11任一項所述的疫苗、根據權利要求5、6或7任一項所述的表達載體、根據權利要求8所述的宿主細胞或根據權利要求9或10所述的組合物。
15.用於呈遞或展示抗原多肽的方法，其中所述方法包括(a)將編碼所述多肽的核酸插入杆狀病毒表達載體中，其中所述杆狀病毒表達載體包括來自白斑綜合症病毒的iel啟動子；(b)用所述表達載體轉染至少一種宿主細胞；和(c)從所述表達載體表達所述多肽，其中所述多肽被呈遞或展示在杆狀病毒的表面膜上。
16.用於呈遞或展示抗原多肽的系統，其中所述系統包括(a)編碼所述多肽的核酸，其被插入杆狀病毒表達載體中，其中所述杆狀病毒表達載體包括來自白斑綜合症病毒的iel啟動子；(b)用於用所述表達載體轉染至少一種宿主細胞的裝置；和(c)用於從所述表達載體表達所述多肽的裝置， 其中所述多肽被呈遞或展示在杆狀病毒的表面膜上。
17.根據權利要求15的方法或根據權利要求16的系統，其中所述啟動子可操作連接至所述編碼抗原多肽的核酸。
全文摘要
用於治療或預防受治療者疾病的疫苗，其中所述疾病與禽流感病毒有關，並且其中所述疫苗包括含有編碼血凝素肽的核酸的表達載體，使得在使用時所述血凝素肽通過所述表達載體在所述受治療者中表達。
文檔編號C12N15/85GK102258778SQ20111014600
公開日2011年11月30日 申請日期2006年5月5日 優先權日2006年5月5日
發明者吉米·光, 魯麗群 申請人:淡馬錫生命科學研究院有限公司