一種豬源鏈球菌的高密度培養方法
2023-07-17 21:59:46 1
專利名稱：一種豬源鏈球菌的高密度培養方法
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域，具體涉及一種高密度培養豬源鏈球菌的方法。
背景技術：
鏈球菌病(str印tococosis)主要是由β溶血性鏈球菌引起的多種人獸共患病的總稱，臨床症狀多種多樣，可引起各種化膿創和敗血症及局部感染，曾多次在國內外出現爆發流行，不僅給世界畜牧業造成巨大損失，而且危及公共衛生安全。動物中以豬、馬、牛、羊、 雞較多見。鏈球菌的形態特徵為球狀細菌、呈鏈狀排列，菌鏈長短不一，G+。在血液、腹水、 組織塗片中可見有莢膜的鏈球菌，對培養要求較嚴格，需用血液培養基。在菌落周圍形成 β (完全溶血)或α型(草綠色溶血環)。根據蘭氏分類可分為20個群，使豬致病者，主要是C、D (R、S)、E、L群，常見分離種有C群的馬鏈球菌群獸疫亞種，R群的豬鏈球菌2型，S 群的豬鏈球菌1型，還有豬鏈球菌7、1/2、9、3型等。接種疫苗作為人類防治鏈球菌感染和大規模擴散的最強有力手段，已經在很多國家對鏈球菌的有效控制中發揮了重要作用。雖然不少國家的科研人員都在大力開發基因工程活載體疫苗和亞單位疫苗等第二代鏈球菌疫苗產品，但目前還沒有較成熟的此類產品面市，傳統的全菌體滅活疫苗和減毒活疫苗任佔領著全部的鏈球菌疫苗市場。在目前我國鏈球菌全菌體疫苗的關鍵生產技術中，菌體高密度培養技術的滯後， 嚴重阻礙了疫苗生產效率的提高、企業的發展及對動物疫病的有效防止。本發明通過應用高密度發酵技術，對豬源鏈球菌進行大規模培養，著重研究其發酵過程中菌體生長、基質消耗、中間產物的生成和轉化、產物生成的動態平衡及其內在規律等，確定控制發酵代謝的限制因子，實現對其發酵代謝過程的調節和控制，優化發酵培養基成分、菌體培養條件和發酵罐發酵工藝，並進行中試放大及產業化放大研究，實現鏈球菌菌體抗原的高密度培養。
發明內容
本發明的目的是在於提供一種高密度培養豬源鏈球菌的方法，本方法原料來源廣泛、成本低廉，並較常規的發酵方法生長快、菌數高，且易於實現豬源鏈球菌菌體抗原的大規模高密度培養。為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施通過應用高密度發酵技術，對豬源鏈球菌進行大規模培養，實現對其發酵代謝過程的調節和控制，優化發酵培養基成分、菌體培養條件和發酵罐發酵工藝，並進行中試放大及產業化放大研究，實現鏈球菌菌體抗原的高密度培養。一種豬源鏈球菌的高密度培養方法，其步驟是(1)製備平板種子將凍幹保存的豬源鏈球菌在TSA平皿上劃線，置37°C培養 16 M小時，待長出單菌落後，再接種TSA平板若干個(3-8個)，置37°C培養14 16小時，2 8°C保存。
上述豬源鏈球菌，具體涉及常見至病豬分離的各種血清型鏈球菌，所述的豬鏈球菌為1型(SSl)、2型(SS2)、7型(SS7)、9型(SS9)或C群馬鏈球菌獸疫亞種中的任意一種。所涉及到的豬鏈球菌1型(SSl)、2型(SS2)由華中農業大學(趙戰勤，胡睿銘，吳斌等.豬源鏈球菌的分離鑑定及生物學特性研究.畜牧獸醫學報，2007,38 ) :367 381.) 提供；所涉及到的7型菌為中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏菌株，其保藏號CCTCC NO :M2011160 ；所涉及到的9型(SS9) 22083株為從加拿大引進，由中國動物衛生與流行病學中心提供；所涉及到的C群馬鏈球菌獸疫亞種為ATCC35246株，分離於中國四川，或購自美國菌種保藏中心(ATCC)。(2)製備一級種子液用接種環取一環步驟(1)的一級種子的單菌落(挑3-5個)， 接種於TSB液體培養基(TSB+7 %體積濃度的牛血清)中，置37°C搖床170rpm/min，培養5_7 小時，OD600達到0. 4 0. 6，得到一級種子液。(3)製備二級種子液取步驟( 的一級種子液以V/V計為1. 5%的接種量接入裝有200mL發酵培養基的500mL搖瓶中進行發酵培養，控制搖床溫度為37°C，轉速為170rpm， 起始pH為6. 8-7. 5，發酵周期為4-6小時，得到豬鏈球菌二級種子液；二級種子液配方酵母粉(25g/L)、胰蛋白腖(25g/L)、硫酸鎂(0. 3g/L)、醋酸銨 (3g/L)調 pH 值達到 7. 1-7. 5，121°C滅菌 20min，加入牛血清 5% (V/V)，(300g/L 濃度的) 葡萄糖1 %、IM磷酸緩衝液5 % (V/V)。(4)上罐發酵1.發酵液配製酵母粉(25g/L)、胰蛋白腖(25g/L)、硫酸鎂(1.5g/L)、醋酸銨 (3g/L)，按50% 70%的裝液量配製，加入約0. 01 %體積的泡敵，用NaOHiI pH至7. 2-7. 6， 121 °C 滅菌 20min2.接種及補料按 3% (V/V)的接種量和5% 7% (V/V)的血清量將種子液和血清混合後，用補料泵打入發酵罐中。於接種後補一定體積的(600g/L濃度)葡萄糖溶液，其流加手段包括對數期一次流加發酵液終濃度為0.7% (m/V)葡萄糖、對數期分次流加終濃度為0.25% (m/V)葡萄糖、對數期連續流加葡萄糖溶液(維持糖質量濃度在 0. 05 % 0. 1 % )，其最優流加手段為對數期連續流加葡萄糖溶液(維持糖濃度在0. 05 % 0. )。3.發酵控制通過pH控制和DO控制維持菌體的對數生長。其pH控制手段有初始磷酸緩衝液控PH值、在線流加NaOH溶液控pH值在6. 7 7. 3、在線流加氨水溶液控pH 值在6. 7 7. 3，其中最優控制手段為在線流加氨水溶液控pH值在6. 7 7. 3 ；其DO控制手段在對數生長期通過加速攪拌和提高通氣量維持DO值在10% 30%。4.發酵終點判斷當DO值重新由較低值回升到較高時(80%以上)，即可放罐收菌。本發明通過對豬源鏈球菌的高密度培養，在3L罐中的活菌量可達120億/毫升， 總菌量OD6tltl值達到4. 854 ；在100L罐中的活菌量可達71億/毫升，總菌量OD6tltl值達到 6. 752，遠遠高於目前國內外較多應用商品化TSB培養基的常規培養。本發明的原料來源廣泛、低廉，工藝控制和放大簡單易行，發酵快、產量高，將會極大提高我國豬鏈球菌菌體抗原的發酵水平，帶來足以滿足國內需求的優質、價廉的豬鏈球菌疫苗產品。
圖1為一種在常規TSB培養條件下和本發明優化培養條件下，豬鏈球菌7型在3L 罐中的菌體生長曲線的比較。圖2為一種在常規TSB培養條件下和本發明優化培養條件下，C群馬疫鏈球菌獸疫亞種在3L罐中的菌體生長曲線的比較。
具體實施例方式實施例1 磷酸緩衝液控pH發酵菌種來源豬鏈球菌2型，於2004年9月分離於湖北羅田某豬場(豬鏈球菌2型請見趙戰勤，胡睿銘，吳斌等.豬源鏈球菌的分離鑑定及生物學特性研究.畜牧獸醫學報， 2007,38(4) 367 381)。一種豬源鏈球菌的高密度培養方法，其步驟是(1)製備平板種子將凍幹保存的豬鏈球菌2型種子菌在TSA平皿上劃線，置37°C 培養16或18或20或22或M小時，待長出單菌落後，再接種TSA平板若干個(3或5或6 或7或8個)，置37°C培養14或15或16小時，2或4或6或8°C保存。(2)製備一級種子液用接種環取一環步驟(1)的一級種子的單菌落(挑3或4或 5個)，接種於TSB液體培養基(TSB+7%體積濃度的牛血清)中，置37°C搖床170rpm/min， 培養5或6或7小時，OD600達到0. 4或0. 5或0. 6，得到一級種子液。(3)製備二級種子液取步驟( 的一級種子液以V/V計為1. 5%的接種量接入裝有200mL發酵培養基的500mL搖瓶中進行發酵培養，控制搖床溫度為37°C，轉速為170rpm， 起始pH為6. 8或7或7. 2或7. 4或7. 5，發酵周期為4或5或6小時，得到豬鏈球菌二級種子液；二級種子液配方酵母粉(25g/L)、胰蛋白腖(25g/L)、硫酸鎂(0. 3g/L)、醋酸銨 (3g/L)調 pH 值達到 7. 1-7. 5，121°C滅菌 20min，加入牛血清 5% (V/V)，(300g/L 濃度的) 葡萄糖1 %、IM磷酸緩衝液5 % (V/V)。(4)上罐發酵1.發酵液配製酵母粉(25g/L)、胰蛋白腖(25g/L)、硫酸鎂(1.5g/L)、醋酸銨 (3g/L)，按50 % 70 %的裝液量配製，加入約0. 01 %體積的泡敵，用NaOH調pH至7. 2或 7. 3 或 7. 4 或 7. 5 或 7. 6，121°C 滅菌 20min2.接種及補料按或2%或3% (V/V)的接種量和5%或6%或7% (V/V)的血清量將種子液和血清混合後，用補料泵打入發酵罐中。於接種後補一定體積的(600g/L濃度)葡萄糖溶液，其流加手段包括對數期一次流加發酵液終濃度為0.7% (m/V)葡萄糖、 對數期分次(3次)流加終濃度為0. 25% (m/V)葡萄糖、對數期連續流加葡萄糖溶液(維持糖質量濃度在0. 05 % 0. 1 % )，其最優流加手段為對數期連續流加葡萄糖溶液(維持糖濃度在 0. 05% 0. 1% ) ο3.發酵控制通過pH控制和DO控制維持菌體的對數生長。其pH控制手段有初始磷酸緩衝液控PH值、在線流加NaOH溶液控pH值在6. 7或6. 9或7. 1或7. 3、在線流加氨水溶液控pH值在6. 7或6. 9或7. 1或7. 3，其中最優控制手段為在線流加氨水溶液控pH 值在6. 7或6. 9或7. 1或7. 3 ；其DO控制手段在對數生長期通過加速攪拌和提高通氣量
5維持DO值在10% 30%。4.發酵終點判斷當DO值重新由較低值回升到較高時(80%以上)，即可放罐收菌。結果如表1，可知菌體在對數生長初期就已將葡萄糖耗盡，後期有可能是利用葡萄糖再生途徑為自身提供葡萄糖，因此可以考慮在對數生長期補加適當濃度的葡萄糖滿足菌體生長需要。表 權利要求
1.一種豬源鏈球菌的高密度培養方法，其步驟是(1)製備平板種子將凍幹保存的豬源鏈球菌TSA平皿上劃線，置37°C培養16 M小時，待長出單菌落後，再接種TSA平板，置37°C培養14 16小時，2 8°C保存；(2)製備一級種子液用接種環取一環步驟(1)的一級種子的單菌落，接種於TSB液體培養基中，置37°C搖床170rpm/min，培養5_7小時，OD6tltl達到0. 4 0. 6，得到一級種子液；(3)製備二級種子液取步驟(2)的一級種子液以V/V計為1.5%的接種量接入裝有 200mL發酵培養基的500mL搖瓶中進行發酵培養，控制搖床溫度為37°C，轉速為170rpm，起始pH為6. 8-7. 5，發酵周期為4-6小時，得到豬鏈球菌二級種子液；二級種子液配方酵母粉25 g/L、胰蛋白腖25 g/L、硫酸鎂0.3g/L、醋酸銨3 g/L調pH 值達到7. 1-7. 5，121°C滅菌20min，加入牛血清5%V/V，300g/L濃度葡萄糖1%、IM磷酸緩衝液 5%(V/V ；(4)上罐發酵A、發酵液配製酵母粉25g/L、胰蛋白腖25 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、醋酸銨3 g/L, 按50% 70%的裝液量配製，加入0. 01%體積的泡敵，用NaOH調pH至7. 2-7. 6，121 °C滅菌 20min ；B、接種及補料按19T3%V/V的接種量和59T7%V/V的血清量將種子液和血清混合後，用補料泵打入發酵罐中，於接種後補600g/L濃度葡萄糖溶液，其流加手段包括對數期一次流加發酵液終濃度為0. 7%m/V葡萄糖、對數期分次流加終濃度為0. 25%m/V葡萄糖、對數期連續流加葡萄糖溶液，維持糖質量濃度在0. 059Γ0. 1%，其最優流加手段為對數期連續流加葡萄糖溶液，維持糖濃度在0. 059ΓΟ. 1% ；C、發酵控制通過pH控制和DO控制維持菌體的對數生長，其pH控制手段有初始磷酸緩衝液控PH值、在線流加NaOH溶液控pH值在6. Π. 3、在線流加氨水溶液控pH值在 6. Π. 3，其中最優控制手段為在線流加氨水溶液控pH值在6. Π. 3 ；其DO控制手段在對數生長期通過加速攪拌和提高通氣量維持DO值在109Γ30% ；D、發酵終點判斷當DO值重新由較低值回升到80%，放罐收菌。
2.根據權利要求1所述一種豬源鏈球菌的高密度培養方法，其特徵在於所述的豬源鏈球菌為1型、2型、7型、9型或C群馬鏈球菌獸疫亞種中的任意一種。
全文摘要
本發明公開了一種豬源鏈球菌的高密度培養方法，其步驟(1)製備平板種子將凍幹保存的豬源鏈球菌野生種在TSA平皿上劃線，培養，待長出單菌落後，再接種TSA平板，保存；(2)製備一級種子液用接種環取一環的一級種子的單菌落，接種於TSB液體培養基中，培養，得到一級種子液；(3)製備二級種子液取一級種子液接種量接入裝有發酵培養基的搖瓶中進行發酵培養，得到豬鏈球菌二級種子液；(4)上罐發酵；A、發酵液配製；B、接種及補料；C、發酵控制；D、發酵終點判斷當DO值重新由較低值回升到80%，放罐收菌。原料來源廣泛、低廉，發酵快、產量高，提高豬鏈球菌菌體抗原的發酵水平，帶來優質、價廉的豬鏈球菌疫苗產品。
文檔編號C12R1/46GK102220273SQ20111014594
公開日2011年10月19日 申請日期2011年6月1日 優先權日2011年6月1日
發明者康超, 徐高原, 王楊波, 金梅林, 陳關平, 陳波, 陳煥春, 韓進 申請人:武漢科前動物生物製品有限責任公司