副溶血性弧菌雙重實時螢光pcr檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法
2023-07-17 22:44:21
專利名稱：副溶血性弧菌雙重實時螢光pcr檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，具體涉及重要的食源性病原菌副溶血性弧菌 (Vibrio Parahemolyticus)的雙重實時螢光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法， 適合於進出口食品檢驗、疾病控制中心、質量監督部門使用。
背景技術：
副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽桿菌，是沿海國 家的重要食物中毒致病菌之一，可導致患者腹瀉、腸痙攣、噁心、嘔吐、發燒等典型胃腸炎反 應。副溶血性弧菌主要存在於海水及海產品中，在日本由該菌引起的食物中毒佔細菌性食 物中毒的40% 60%，位居首位。另外，美國、澳大利亞、英國、比利時、法國、韓國和東南亞 地區，都有該菌引起食物中毒爆發的報告。我國從1998年以來的資料顯示，副溶血弧菌引 發的食物中毒的發生規模及人群暴露規模呈明顯上升趨勢，均已超過沙門氏菌食物中毒， 躍居細菌性中毒的首位。副溶血性弧菌傳統的檢測方法是基於形態特徵、染色特徵、生化特徵、血清分型等 表型特徵來鑑定。這些常規的方法在副溶血性弧菌研究工作中起到了重要作用，但現代科 學技術的發展，傳統的依靠表型特徵來鑑定副溶血性弧菌的方法，已遠遠不能滿足對該菌 的快速診斷以及流行病學研究的需要，暴露出許多不足之處操作繁瑣，鑑定周期長，不利 於急性中毒的快速診斷和口岸快速通關的要求；副溶血性弧菌的致病機理複雜且多樣化， 不含毒力因子的菌株不一定致病，而傳統的培養鑑定法短時間內無法確定該菌的毒力強 弱，還需繼續增加其他特殊的生化等鑑定實驗，這無疑使鑑定周期更加漫長。因此，迫切急 需研究出能夠更加快速、準確無誤、檢測通量更高、人為影響因素儘可能減少，而且能獲得 分離的病原體基因型別、毒力基因分布等多重信息的檢測方法。用於副溶血性弧菌分子檢測比較常見的主要有常規PCR、單一實時螢光PCR以及 基因晶片等。雖然，常規PCR具有高靈敏度、操作簡單等優點，但是需要對產物進行後處理， 容易汙染，同時，染色劑、紫外光等對操作人員身體健康有威脅，不易自動化和標準化；基因 晶片技術具有高特異性、高通量等優點，但是需要先擴增再雜交，技術還不是很穩定，尤其 是儀器設備昂貴，不利於推廣應用。實時螢光PCR技術充分結合了 PCR擴增和探針雜交的 優勢，具有高靈敏度、高特異性，重複性和穩定性良好的優點，一次上機即可完成結果檢測， 容易自動化。實時螢光PCR技術根據螢光能量傳遞原理，融合了 PCR技術的高效擴增、探針技術 的高特異性、光譜技術的高敏感性和高精確性等優點。它是利用螢光信號伴隨著PCR產物 的增加而增強的原理，在PCR擴增過程中，連續不斷地檢測反應體系中螢光光信號的變化。 根據螢光信號基線的平均值和平均標準差，在99. 7%的置信度時計算出大於平均值的螢光 信號即閾值，然後收集螢光信號增強到預定閾值時的PCR循環次數(即Ct值)。該參數和 PCR反應體系中起始DNA模板量的對數值之間有嚴格的線性關係。利用陽性梯度稀釋標準品的Ct值繪製成標準曲線，再根據檢測樣品的Ct值就可以準確地測定靶標病原菌的起始 模板拷貝數。實時螢光定量PCR的化學原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序 列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加，非探針類則是利用螢光染料或者特殊設計的引 物來指示擴增的增加。前者由於增加了探針的識別步驟，特異性更高，但後者則簡便易行。目前副溶血性弧菌的螢光PCR檢測上，文獻報導以gyrase為目的基因就無法區分 副溶血性弧菌和溶藻弧菌，tlh和tdh為靶基因容易出現假陽性結果。副溶血性弧菌在我 妻氏瓊脂上引起β-溶血，稱為神奈川現(KP現象)。KP現象是鑑定副溶血性弧菌致病性 和非致病性菌株的一項重要指標，其主要是熱穩定性溶血素tdh基因引起，tdh基因是副溶 血性弧菌的主要毒力因子，具有致死毒性、心臟毒性、細胞毒性和腸毒素作用。最近的研究 還表明，tdh基因家族也廣泛存在於人類致病性弧菌中，如部分霍利斯弧菌(V.hollisae)， 某些擬態弧菌菌株中也有tdh基因，非01群霍亂弧菌中也存在同源性約為93% 96%的 tdh相關基因。因此，以單獨以tdh基因為目標基因就無法準確鑑定出副溶血性弧菌。在單一螢光PCR基礎上的多重實時螢光PCR方法，可針對多個基團為目的基因進 行檢測。多重實時螢光PCR法用於病原菌的檢測，無論在國內還是在國外都剛剛起步，目前 尚無副溶血性弧菌的多重實時螢光PCR的檢測試劑盒問世。
發明內容
本發明的目的是提供一種快速、可靠、靈敏度高、特異性強的副溶血性弧菌雙重實 時螢光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法，通過一次反應就能完成副溶血性弧菌 的特異性檢測和毒力基因檢測。本發明利用雙重實時螢光PCR方法，以副溶血性弧菌的toxR基因和tdh基因作為 靶基因，toxR基因用於特異性檢測副溶血性弧菌，tdh基因用於檢測是否攜帶毒力基因，優 化設計引物、探針和反應條件，使得在一次擴增反應中對副溶血性弧菌進行特異性檢測的 同時檢測其毒力基因，達到簡便、快速、準確可靠和安全的目的，從而實現了本發明的目的。本發明的副溶血性弧菌雙重實時螢光PCR檢測引物，其特徵在於，所述的檢測引 物如下所示針對toxR 基因5~ -AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3~ ；(如 SEQ ID NO. 1 所示)5:CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3~ ；(如 SEQ ID N0. 2 所示)針對tdh 基因5~ -GGCTGACATCCTACATGACTG-3「；(如 SEQ ID N0. 3 所示)5~-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3、；(如 SEQ ID N0. 4 所示)本發明的副溶血性弧菌雙重實時螢光PCR檢測探針，其特徵在於，所述的檢測探 針如下所示toxR 基因的探針5~-AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3、；(如 SEQ ID N0. 5 所示)tdh 基因的探針5~ -CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3、；(如 SEQ ID N0. 6 所示)探針的5、端標記有螢光報告基團，3、端標記有螢光淬滅基團，兩探針的5、端標記 的螢光報告基團是不同的螢光報告基團。所述的螢光報告基團優選為FAM、HEX或VIC，所述的螢光淬滅基團優選為BHQl。本發明的副溶血性弧菌雙重實時螢光PCR檢測試劑盒，包括實時螢光定量PCR反
5應液、耐熱DNA聚合酶、檢測引物和檢測探針，其特徵在於，所述的檢測引物包括兩對(1)針對 toxR 基因5~ -AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3~ ；(如 SEQ ID NO. 1 所示)5:CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3~ ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)(2)針對 tdh 基因5:GGCTGACATCCTACATGACTG-3~ ；(如 SEQ ID NO. 3 所示)5~-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3、；(如 SEQ ID NO. 4 所示)所述的檢測探針包括(1) toxR基因的探針5~ -AGGATTCACAGCAGMGCCACAGG-3、；(如 SEQ ID N0. 5所示)(2) tdh 基因的探針5~ -CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3、；(如 SEQ ID N0. 6 所 示)探針的5、端標記有螢光報告基團，3、端標記有螢光淬滅基團，兩探針的5、端標記 的螢光報告基團是不同的螢光報告基團。本發明的副溶血性弧菌雙重實時螢光PCR檢測方法，用於檢測食品或海產品，其 特徵在於，包括以下步驟(1)對樣品進行增菌培養，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；(2)使用上述針對toxR基因和tdh基因的檢測引物及其檢測探針，與實時螢光 PCR擴增用的反應液及耐熱DNA聚合酶混合形成擴增反應體系；(3)將擴增反應體系在螢光PCR儀上進行實時螢光PCR反應，反應結束後，根據 探針標記的螢光報告基團記錄的螢光信號，讀取並記錄各檢測樣品的PCR擴增循環次數 (Ct)；(4)根據各樣品的Ct值，按照建立的判斷標準，判斷樣品中是否含有副溶血性弧 菌，以及該副溶血性弧菌是否含有毒力基因tdh基因。所述的步驟O)的擴增反應體系優選為
權利要求
1.一種副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)雙重實時螢光PCR檢測引物，其特 徵在於，所述的檢測引物如下所示針對 toxR 基因5~ -AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3~ ； -CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3~ ；針對 tdh 基因5~ -GGCTGACATCCTACATGACTG-3~ ； -AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3~。
2.一種副溶血性弧菌雙重實時螢光PCR檢測探針，其特徵在於，所述的檢測探針如下 所示toxR 基因的探針5~-AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3~ ；tdh 基因的探針5:CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3—；探針的5、端標記有螢光報告基團，3、端標記有螢光淬滅基團，兩探針的5、端標記的熒 光報告基團是不同的螢光報告基團。
3.根據權利要求2所述的副溶血性弧菌雙重實時螢光PCR檢測探針，其特徵在於，所述 的螢光報告基團為FAM、HEX或VIC，所述的螢光淬滅基團為BHQl。
4.一種副溶血性弧菌雙重實時螢光PCR檢測試劑盒，包括實時螢光定量PCR反應液、耐 熱DNA聚合酶、檢測引物和檢測探針，其特徵在於，所述的檢測引物包括兩對(1)針對toxR 基因5~ -AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3~ ； -CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3~ ；(2)針對tdh 基因5~ -GGCTGACATCCTACATGACTG-3~ ；5—-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3、；所述的檢測探針包括(1) toxR 基因的探針5~ -AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3、；U) tdh 基因的探針5:CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3、；探針的5、端標記有螢光報告基團，3、端標記有螢光淬滅基團，兩探針的5、端標記的熒 光報告基團是不同的螢光報告基團。
5.一種副溶血性弧菌雙重實時螢光PCR檢測方法，用於檢測食品或海產品，其特徵在 於，包括以下步驟(1)對樣品進行增菌培養，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；(2)使用權利要求1所述的針對toxR基因和tdh基因的檢測引物和權利要求2所述的 toxR基因和tdh基因的檢測探針，與實時螢光PCR擴增用的反應液及耐熱DNA聚合酶混合 形成擴增反應體系；(3)將擴增反應體系在螢光PCR儀上進行實時螢光PCR反應，反應結束後，根據探針標 記的螢光報告基團記錄的螢光信號，讀取並記錄各檢測樣品的PCR擴增循環次數(Ct)；(4)根據各樣品的Ct值，按照建立的判斷標準，判斷樣品中是否含有副溶血性弧菌，以 及該副溶血性弧菌是否含有毒力基因tdh基因。
6.根據權利要求5所述的副溶血性弧菌雙重實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於，所述 的步驟O)的擴增反應體系為
7.根據權利要求5或6所述的副溶血性弧菌雙重實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於， 所述步驟(3)的進行實時螢光PCR反應，其反應參數為95°C 30s,93°C 5s,60°C 30s、40個 循環。
全文摘要
本發明公開了一種副溶血性弧菌雙重實時螢光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法。本發明利用雙重實時螢光PCR方法，以副溶血性弧菌的toxR基因和tdh基因作為靶基因，toxR基因用於特異性檢測副溶血性弧菌，tdh基因用於檢測是否攜帶毒力基因，優化設計引物、探針和反應條件，使得在一次擴增反應中對副溶血性弧菌進行特異性檢測的同時檢測其毒力基因，檢測快速，8-10小時可以完成從製備樣品到出具檢測結果的過程，不受假陽性和交叉汙染等幹擾，結果可靠，且靈敏度高、特異性強，為副溶血性弧菌進行流行病學調查提供了有利工具。適用於食品以及海產品的檢驗檢疫，可供檢驗檢疫局、疾病預防控制中心和質量監督部門對樣品進行簡便、快速、準確的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102146469SQ20111004348
公開日2011年8月10日 申請日期2011年2月22日 優先權日2011年2月22日
發明者凌莉, 張旺, 易敏英, 相大鵬, 袁慕雲, 許龍巖, 鄒志飛, 陽靜 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心