一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變螢光pcr熔解曲線檢測試劑盒的製作方法

2023-07-17 14:46:31

專利名稱：一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變螢光pcr熔解曲線檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種應用螢光PCR熔解曲線分析檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變的試劑盒。
背景技術：
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏症(G6PD deficiency)是最常見的人類酶缺陷病之一，其病因是G6H)基因突變導致葡萄糖-6-磷酸脫氫酶合成減少。然而，絕大部分患者的生活質量並沒有因此降低，這主要是由於在我國出現的絕大部分Gero缺乏症患者只有在誘因的存在下才會出現相應的臨床症狀，因此，完全可以通過預先防範和及時接受正確的治療而有效的避免上述情況的發生。所以在我國Gero缺乏症的高發區進行全民篩查是十分必要的。目前G6H)缺乏症的臨床診斷方法包括生化檢測方法和分子生物學檢測方法，其中生化篩查是傳統診斷方法，通過直接或者間接地測定G6ro的酶活性來篩查G6ro缺乏症的攜帶者和患者。主要包括進行定性檢測的高鐵血紅蛋白還原試驗、螢光斑點試驗、硝基四氮唑藍(NBT)紙片法和進行定量檢測的NBT定量法、NADPH定量比值法等。分子生物學方法是基於DNA的分析進行G6H)基因突變的檢測，如反向點雜交(RDB)、PE/DHPLC、AS-PCR、PCR-SSCP、基因晶片等。生產廠家主要有杭州紐羅西敏生物科技有限公司和Solgent有限公司等。國內臨床常用的方法為檢測酶活性的生化檢測法和反向點雜交法。生化檢測方法雖然檢測成本低、檢測時間短，但其存在以下缺點:(I)對女性雜合子的檢出率低，僅為2(T45%左右；(2)結果易受實驗條件，操作人員等因素影響。

現有的分子檢測方法雖然能較好地解決Gero缺乏症女性雜合子檢測的問題，但是不同的方法有著自身的局限性。反向點雜交法是一種異相的突變檢測方法，需要對PCR產物進行後續處理，操作步驟較多，容易引起汙染，並且結果判讀易受主觀因素影響。PE/DHPLC對儀器要求設備高，應用性不強。AS-PCR檢測的通量十分有限，而且需要PCR後處理，容易出現汙染造成假陽性結果的發生。PCR-SSCP對實驗條件要求嚴格，只能檢測突變是否存在，對於突變的具體位置和類型還需要進一步的測序。此外，由於某些點突變類型對單鏈DNA的空間構象改變小，容易漏檢。基因晶片技術不但成本高、操作複雜而且結果存在不同程度的假陽性。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術缺陷，提供一種應用螢光PCR熔解曲線分析檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變的試劑盒。本發明的技術方案如下:一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變螢光PCR熔解曲線檢測試劑盒，該試劑盒包括:
特異擴增五種突變位點c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T 和c.1388G>A所在序列的上遊引物Fl和下遊引物R1，其中，Fl的鹼基序列如SEQ ID NO:1所示，Rl的鹼基序列如SEQ ID NO:2所示；特異擴增三種突變位點c.871G>A、c.10040A和c.10240T所在序列的上遊引物F2和下遊引物R2，其中，F2的鹼基序列如SEQ ID NO:3所示，R2的鹼基序列如SEQ ID NO:4所示；特異擴增突變位點c.95A>G所在序列的上遊引物F3和下遊引物R3其中，F3的鹼基序列如SEQ ID NO:5所不，R3的喊基序列如SEQ ID NO:6所不；特異擴增兩種突變位點c.383T>C和c.392G>T所在序列的上遊引物F4和下遊引物R4，其中，F4的喊基序列如SEQ ID NO:7所不，R4的喊基序列如SEQ ID NO:8所不；特異擴增五種突變位點c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.519C>T 和 c.592C>T 所在序列的上遊引物F5和下遊引物R5，其中，F5的鹼基序列如SEQ ID NO:9所示，R5的鹼基序列如SEQ ID NO:10所示；以及用於檢測上述十六種突變位點的螢光探針。在本發明的一個優選實施方案中，所述螢光探針包括:用於檢測突變位點c.13600T的螢光探針Pl，其鹼基序列如SEQ ID NO: 11所示；用於檢測突變位點c.871G>A的螢光探針P2，其鹼基序列如SEQ ID NO:12所示；用於檢測突變位點c.1004C>A和c.10240T的螢光探針P3，其鹼基序列如SEQ IDNO:13所示；用於檢測突變位點c.1376G>T、c.1388G>A、c.1381G>A 和 c.1387C>A 的螢光探針P4，其喊基序列如SEQ ID NO:14所不；用於檢測突變位點c.95A>G的螢光探針P5，其鹼基序列如SEQ ID NO:15所示；用於檢測突變位點c.383T>C和c.392G>T的螢光探針P6，其鹼基序列如SEQ IDNO:16所示；用於檢測突變位點c.487G>A和c.493A>G的螢光探針P7，其鹼基序列如SEQ IDNO:17所示；用於檢測突變位點c.517T>C和c.519C>T的螢光探針P8，其鹼基序列如SEQ IDNO:18所示；用於檢測突變位點c.592C>T的螢光探針P9，其鹼基序列如SEQ ID NO:19所示。在本發明的一個優選實施方案中，所述螢光探針5』端的螢光基團包括ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold540、JOE、HEX、CAL Flour0range560、TAMRA、Cal FluorRed590、R0X、CAL Fluor Red610、TEXASRED、CAL Flour Red635、Quasar670、CY3、CY5、CY5.5或Quasar705，所述螢光探針3』端的淬滅基團包括DABCYL、BHQ、ECLIPSE或TAMRA。在本發明的一個優選實施方案中，該試劑盒包括檢測體系A和檢測體系B，所述檢測體系A 包括:1 XPCR buffer、IU Taq DNA 聚合酶、200 ii MdNTP、2.5mMMgCl2、上遊引物FU F2各lpmo l、下遊引物RU R2各5pmol及螢光探針PU P2、P3、P4各5pmol ；所述檢測體系B 包括 IXPCR bufferUU Taq DNA 聚合酶、200 ii M dNTP,2.5mMMgCl2、上遊引物F3、F4、F5各lpmol、下遊引物R3、R4、R5各5pmol及螢光探針P5、P6、P7、P8、P9 各 5pmol ；上述IXPCR buffer 中包括:Tris_HCl pH8.510mM、KC150mM 和 50% (v/v)甘油。在本發明的一個優選實施方案中，所述檢測體系A和檢測體系B的螢光PCR熔解曲線檢測程序如下:(I) 50°C 2min,95°C IOmin(2)95°C 15s — 65°C 56°C 15s — 76°C 20s, 10 個循環，其中 65°C 56°C 15s 每個循環下降rc ；(3)95°C 15s — 55°C 15s — 76°C 20s, 50個循環，在55°C退火階段採集螢光信號；(4)95°C Imin — 35°C 3min — 40°C 85°C，其中 40°C 85°C 以 0.4°C /5s 的升溫速率進行熔解曲線分析，且在此階段採集螢光信號。本發明的有益效果是:1、簡便快速、耗時短:本發明在兩管PCR體系中即可完成16個位點16種突變的檢測，PCR擴增結束經一次螢光PCR熔解曲線分析就可知道樣本基因型，整個操作在2 3小時即可完成，操作步驟少、耗時短；2、均相檢測、閉管操作:本發明為均相檢測體系，PCR及熔解曲線分析都在同一封閉的反應管中完成，無需PCR後處理，減少了 PCR產物汙染的可能性；3、檢測位點多、突變覆蓋率高:本發明可同時檢測G6H)基因16個位點的16種突變，檢測位點多，對中國人群的突變覆蓋率高；4、檢測通量高:本發明基於螢光PCR熔解曲線分析技術，PCR之後只需運行一個簡單的熔解曲線分析步驟(在螢光PCR儀上40min以內完成)即可完成，而PCR可以在普通儀器上運行，一臺螢光PCR儀可配合多臺普通PCR儀完成熔解曲線分析，故可以大大提高檢測通量，提高螢光PCR儀的利用率；5、檢測特異性高、結果容易判讀:本發明是通過熔解峰的熔點來判定突變與否，結果易於判讀，且不易出錯，故檢測特異性高。


圖1為實施例2中本發明的試劑盒的檢測體系A的FAM螢光通道的檢測結果圖；圖2為實施例2中本發明的試劑盒的檢測體系A的HEX螢光通道的檢測結果圖；圖3為實施例2中本發明的試劑盒的檢測體系A的ROX螢光通道的檢測結果圖；圖4為實施例2中本發明的試劑盒的檢測體系A的Cy5螢光通道的檢測結果圖；圖5為實施例2中本發明的試劑盒的檢測體系B的FAM螢光通道的檢測結果圖；圖6為實施例2中本發明的試劑盒的檢測體系B的HEX螢光通道的檢測結果圖；圖7為實施例2中本發明的試劑盒的檢測體系B的ROX螢光通道的檢測結果圖；圖8為實施例2中本發明的試劑盒的檢測體系B的Cy5螢光通道的檢測結果圖。
具體實施例方式以下通過具體實施方式
將結合附圖，對本發明的技術方案進行進一步的說明和描述。實施例1
本試劑盒中的引物和探針根據Genebank中的葡萄糖_6_磷酸脫氫酶基因序列及其突變位點設計，具體如下:Fl:5』 -GGCATGTTCTTCAACC-3』 (SEQ ID NO:1),Rl:5，-GCCCTCATACTGGAAA-3』 (SEQ ID NO:2),F1/R1 特異擴增五種突變位點 c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T 和c.1388G>A所在序列；F2:5，-AGAAGTCACCACCTCT-3，(SEQ ID NO:3),R2:5，-GGCCACATCATGGAAC-3，(SEQ ID NO:4),F2/R2特異擴增三種突變位點c.871G>A、c.10040A和c.10240T所在序列；F3:5』 -TTTACTCGGTTGTCCAGAA-3』 (SEQ ID NO:5),R3:5，-GGCGACCAGAGCAAA-3』 (SEQ ID NO:6),F3/R3特異擴增突變位點c.95A>G所在序列；F4:5』 -TGCTCTCGTACTTCCTT-3』 (SEQ ID NO:7),R4:5，-TTGAAAATGAGAAGAGGACC-3』 (SEQ ID NO:8),F4/R4特異擴增兩種突變位點c.383T>C和c.392G>T所在序列；F5:5，-GAGGAAGCCATGGCTT-3，(SEQ ID NO:9),R5:5，-AAACCGTGGGGTGCTT-3，(SEQ ID NO:10),特異擴增五種突變位點c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.519C>T 和 c.592C>T 所在序列；Pl:5』 -FAM-GGCCAGATGCACTTCGTGCGTGGCC-BHQ1-3』 (SEQ IDNO:11)，用於檢測突變位點c.13600T ；P2:5，-HEX-AGCCGGTGTTGAAATGCATCTCAGAGGGCT-BHQ1-3，(SEQ ID N0:12)，用於檢測突變位點c.871G>A ；P3:5，-R0X-GGCCACTTTTGCAGCCGTCGTCTGTGGCC-BHQ2-3，(SEQ IDN0:13)，用於檢測突變位點c.10040A和c.10240T ；P4:5，-CY5-GGACCTCCTTGAGGCCTGGCGTGGTCC-BHQ2-3，(SEQID N0:14)，用於檢測突變位點 c.1376G>T、c.1388G>A、c.1381G>A 和 c.1387C>A ；P5:5，-FAM-GCGGCATATTCATCATCATGGGTGCCGC-BHQl-3，(SEQID N0:15)，用於檢測突變位點c.95A>G ；P6:5』-FAM-GGCTCCACCTGGGGTCACAGGCGGAGCC-BHQl-3』 (SEQID NO: 16)，用於檢測突變位點 c.383T>C 和 c.392G>T ；
P7:5，-HEX-GCGCCAAGCTGGAACCGCATCATCGTGGAGAATGGCGC-BHQ1-3，(SEQ ID NO:17),用於檢測突變位點c.487G>A和c.493A>G ；P8:5，-R0X-GGGTTCGGGAGGGACCTGCAGAGCTAACCC-BHQ2-3，(SEQ ID NO: 18)，用於檢測突變位點c.517T>C和c.519C>T ；P9:5，-CY5-GGCCACGCATCGACCACTACCTGGGTGGCC-BHQ2-3，(SEQ ID N0:19)，用於檢測突變位點c.592C>T。本試劑盒中的檢測體系包括檢測體系A和檢測體系B，
所述檢測體系A 包括:1 XPCR bufferUU Taq DNA 聚合酶、200μΜ dNTP、2.5mMMgCl2、上遊引物FU F2各lpmol、下遊引物RU R2各5pmol及螢光探針PU P2、P3、P4各5pmol ；所述檢測體系B 包括 IXPCR bufferUU Taq DNA 聚合酶、200μΜ dNTP、2.5mMMgCl2、上遊引物F3、F4、F5各lpmol、下遊引物R3、R4、R5各5pmol及螢光探針P5、P6、P7、P8、P9 各 5pmol ；上述IXPCR buffer 中包括:Tris_HCl ρΗ8.510mM、KC150mM 和 50% (v/v)甘油。上述檢測體系A和檢測體系B的螢光PCR熔解曲線檢測程序如下:(I) 50°C 2min,95°C IOmin(2)95°C 15s — 65°C 56°C 15s — 76°C 20s, 10 個循環，其中 65°C "56°C 15s 每個循環下降rc ；(3) 95°C 15s — 55V 15s — 76°C 20s, 50 個循環，在 55°C退火階段採集 FAM、HEX、ROX和CY5螢光信號；(4)95°C Imin — 35°C 3min — 40°C 85°C，其中 40°C 85°C 以 0.4°C /5s 的升溫速率進行熔解曲線分析，且在此階段採集FAM、HEX、ROX和CY5螢光信號。實施例2應用實施例1的試劑盒進行檢測分析，操作過程所使用的儀器為Bio_RadCFX96實時螢光PCR儀:
(I)用實施例1的試劑盒中的5對引物分別擴增葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的16個突變位點，以此獲得16個突變序列，將所得16個突變序列的PCR產物分別插入PMD18-T質粒載體中，以此獲得16個突變陽性標準品；(2)將步驟(I)中獲得的16個突變陽性標準品、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶野生型(Wt)序列和陰性對照(NTC)分別加入到實施例1的試劑盒的檢測體系中，並按實施例1的試劑盒的螢光PCR熔解曲線檢測程序進行檢測,每個樣本的檢測體系A和檢測體系B的模板加入量均為5微升，每微升3 X IO3拷貝；陰性對照為IOmM Tris-EDTA緩衝液，pH8.0，加入量為5微升。(3)結果判讀:步驟(2)中每種萄糖-6-磷酸脫氫酶基因型的樣品在不同的螢光檢測通道都有其特徵Tm值(陰性對照中無熔解曲線檢測信號)，計算野生型對照在各個通道的Tm值與16個突變陽性標準品在各個通道的Tm值的差異，即Λ Tm值，將所得Λ Tm值與
螢光探針和檢測通道的關係歸納如下表:
權利要求
1.一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變螢光PCR熔解曲線檢測試劑盒，其特徵在於:該試劑盒包括: 特異擴增五種突變位點 c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T 和 c.1388G>A 所在序列的上遊引物Fl和下遊引物R1，其中，Fl的鹼基序列如SEQ ID NO:1所示，Rl的鹼基序列如SEQ ID NO:2所示； 特異擴增三種突變位點c.871G>A、c.1004C>A和c.1024C>T所在序列的上遊引物F2和下遊引物R2，其中，F2的鹼基序列如SEQ ID NO:3所示，R2的鹼基序列如SEQ ID NO:4所示； 特異擴增突變位點c.95A>G所在序列的上遊引物F3和下遊引物R3其中，F3的鹼基序列如SEQ ID NO:5所示，R3的鹼基序列如SEQ ID NO:6所示； 特異擴增兩種突變位點c. 383T>C和c.392G>T所在序列的上遊引物F4和下遊引物R4，其中，F4的喊基序列如SEQ ID NO:7所不，R4的喊基序列如SEQ ID NO:8所不； 特異擴增五種突變位點 c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.519C>T 和 c.592C>T 所在序列的上遊引物F5和下遊引物R5，其中，F5的鹼基序列如SEQ ID NO:9所示，R5的鹼基序列如 SEQ ID NO:10 所示； 以及用於檢測上述十六種突變位點的螢光探針。
2.按權利要求1所述的一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變螢光PCR熔解曲線檢測試劑盒，其特徵在於:所述螢光探針包括: 用於檢測突變位點c.13600T的螢光探針Pl，其鹼基序列如SEQ ID NO: 11所示； 用於檢測突變位點c.871G>A的螢光探針P2，其鹼基序列如SEQ ID NO:12所示； 用於檢測突變位點c.1004C>A和c.10240T的螢光探針P3，其鹼基序列如SEQ ID NO:13所示； 用於檢測突變位點c.1376G>T、c.1388G>A、c.1381G>A和c.1387C>A的螢光探針P4，其喊基序列如SEQ ID NO: 14所不； 用於檢測突變位點c.95A>G的螢光探針P5，其鹼基序列如SEQ ID NO:15所示； 用於檢測突變位點c.383T>C和c.392G>T的螢光探針P6，其鹼基序列如SEQ ID NO:16所示； 用於檢測突變位點c.487G>A和c.493A>G的螢光探針P7，其鹼基序列如SEQ ID NO:17所示； 用於檢測突變位點c.517DC和c.519C>T的螢光探針P8，其鹼基序列如SEQ ID NO:18所示； 用於檢測突變位點c.592C>T的螢光探針P9，其鹼基序列如SEQ ID NO:19所示。
3.按權利要求2所述的一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變螢光PCR熔解曲線檢測試劑盒，其特徵在於:所述螢光探針5』端的螢光基團包括ALEX-350、FAM、VIC、TET、CALFluor Gold540、J0E、HEX、CAL Flour0range560、TAMRA、Cal Fluor Red590、R0X、CAL FluorRed610、TEXASRED、CAL Flour Red635、Quasar670、CY3、CY5、CY5.5 或 Quasar705，所述螢光探針3』端的淬滅基團包括DABCYL、BHQ、ECLIPSE或TAMRA。
4.按權利要求1所述的一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變螢光PCR熔解曲線檢測試劑盒，其特徵在於:該試劑盒包括檢測體系A和檢測體系B，所述檢測體系 A 包括:1 XPCR bufferUU Taq DNA 聚合酶、200 y MdNTP、2.5mM MgCl2,上遊引物Fl、F2各Ipmo1、下遊引物Rl、R2各5pmol及螢光探針P1、P2、P3、P4各5pmol ； 所述檢測體系 B 包括 IXPCR bufferUU Taq DNA 聚合酶、200 y M dNTP,2.5mM MgCl2,上遊引物F3、F4、F5各lpmol、下遊引物R3、R4、R5各5pmol及螢光探針P5、P6、P7、P8、P9各 5pmol ； 上述 IXPCR buffer 中包括:Tris_HCl pH8.510mM、KC150mM 和 50% (v/v)甘油。
5.按權利要求1所述的一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變螢光PCR熔解曲線檢測試劑盒，其特徵在於:所述檢測體系A和檢測體系B的螢光PCR熔解曲線檢測程序如下:(1)500C 2min,95°C IOmin ； (2)95°C15s — 65°C "56°C 15s — 76°C 20s, 10 個循環，其中 65°C "56°C 15s 每個循環下降1°C ； (3)95°C15s —55°C 15s — 76°C 20s, 50個循環，在55°C退火階段採集螢光信號； (4)95°CImin — 35°C 3min — 40°C 85°C，其中 40°C 85°C 以 0.4°C /5s 的升溫速率進行熔解曲線分析，且 在此階段採集螢光信號。
全文摘要
本發明公開了一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變螢光PCR熔解曲線檢測試劑盒。本發明的試劑盒在兩管PCR體系中即可完成16個位點16種突變的檢測，PCR擴增結束經一次螢光PCR熔解曲線分析就可知道樣本基因型，整個操作在2～3小時即可完成，操作步驟少，耗時短，通量高，且檢測位點多，突變覆蓋率高；此外本發明的試劑盒採用均相檢測、閉管操作，減少了PCR產物汙染的可能性，且檢測特異性高，結果容易判讀。
文檔編號C12Q1/68GK103088135SQ201310024568
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月23日 優先權日2013年1月23日
發明者李慶閣, 黃秋英, 夏眾敏, 楊蓉 申請人:廈門大學, 廈門致善生物科技有限公司