一種山蒼子精油在控制辣椒疫病上的應用的製作方法
2023-08-13 01:56:06 2
本發明屬於農業防治技術領域，具體涉及一種山蒼子精油在控制辣椒疫病上的應用。
背景技術：
山蒼子精油是從樟科木姜子屬落葉灌木山蒼子litseacubebapers鮮果中提取的揮髮油，是gb2760-2011規定為允許使用的食用天然香料，為我國單一品種出口量最大的植物精油。《中藥大辭典》記載其具有祛風散寒、理氣殺蟲、解毒止痛之效，為民間常用藥之一。最初，周勇等通過試驗研究發現山蒼子精油是一種廣譜抗真菌藥物，並證實其有殺菌作用。隨後，對山蒼子油抗菌作用及機制的研究日益增多，但主要集中在食品和醫學領域。餘伯良等研究表明山蒼子精油對食品中常見的黃麴黴（aspergillusflauus）、桔青黴（penicilliumcitrinum）、總狀毛黴（mucorracemosus）和黑根黴（rhizopusnigricans）等多種黴菌均有較強的抗菌作用，可作為易汙染黴菌和黃麴黴毒素的花生、玉米等食品的良好天然防腐保鮮劑。山蒼子精油對念珠菌（candidaalbicans）、毛癬菌（trichophytonrubrum）、煙麴黴菌（aspergillusfumigatus）等十餘種真菌和金黃色葡萄球菌（staphyloccocusaureus）、淋球菌（neisseriagonorrhoeae）和大腸桿菌（escherichiacoli）等十餘種致病細菌均有很好的抑制和殺滅作用，是已知抗菌譜最廣且藥力強勁的天然植物提取物之一。
目前，有關山蒼子精油對植物病原真菌生物活性的研究報導較少。黃梁綺齡等研究發現山蒼子油具有很強的抑制植物病原真菌尖孢鐮刀菌（fusariumoxysporum）、helminthosporiumsp.,stemphyilliumsp.生長的能力，並有明顯的保鮮作用；袁萍等報導山蒼子精油對黴菌具有較強的抑制活性。
由辣椒疫黴菌（phytophthoracapsici）引起的植物病害已成為世界各地蔬菜生產的主要制約因素。該病菌危害茄科、葫蘆科和豆科的多種蔬菜及其他植物共計50多種，可侵染植株各個部位，引起植株枯萎、根腐、頸腐、幼苗猝倒、葉枯、莖枯、果腐等症狀。由辣椒疫黴菌侵染引起的辣椒疫病目前已成為一種毀滅性土傳真菌性病害，世界各地均有發生，發病較輕的田塊病株率為15~30%，造成產量損失為20~25%，嚴重的田塊損失在50%以上，甚至絕收。我國辣椒種植地區如四川、貴州、陝西、甘肅、廣東等均有辣椒疫病嚴重發生的報導，並且隨著保護地辣椒種植面積的增加，辣椒疫病的發生有逐年加重的趨勢。近年來，為減少辣椒疫病造成的損失，國內外在遺傳育種、耕作措施、化學防治等方面對辣椒疫病的防治進行了大量研究，但目前並未發現抗病種質材料；防治辣椒疫病的農業管理措施較複雜，大面積生產栽培難以實施；生產上防治辣椒疫病最常用的措施仍是使用殺菌劑。20世紀80年代後開始使用內吸性殺菌劑甲霜靈、殺毒礬m8、氰霜唑等防治辣椒疫病效果較好，但隨著這些藥劑的長期使用，已引起病菌抗藥性的產生，且大量使用易造成環境汙染，威脅食品安全，對人類健康造成危害。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供了山蒼子精油在控制作物辣椒疫病上的應用。
為了實現上述目的，本發明採用的技術方案為：
一種山蒼子精油在控制辣椒疫病上的應用。
優選地，將山蒼子精油溶於有機溶劑，再加入吐溫型乳化劑，最後用無菌水稀釋、混勻，得到所需山蒼子精油濃度的藥液；將藥液採用噴霧或灌根的方式進行施用。
優選地，採用噴霧的方式進行施用時，每1l藥液中含山蒼子精油1~2g、有機溶劑0.2~0.4g、吐溫型乳化劑1~2g。
優選地，採用灌根的方式進行施用時，每1l藥液中含山蒼子精油1.5~2.5g、有機溶劑0.3~0.5g、吐溫型乳化劑1~3g。
優選地，所述山蒼子精油的製備方法，包括以下步驟：將山蒼子果實幹燥、研磨、過篩，得到山蒼子粉；將山蒼子粉採用超臨界co2萃取，得到山蒼子精油；其中，超臨界co2萃取條件：萃取溫度40~50℃，萃取時間40~80分鐘，萃取壓力2~3mpa，co2流量1.2~2ml/min。
優選地，所述有機溶劑為丙酮、甲醇、乙醇、丙二醇及甘油中的一種或兩種以上。
優選地，所述吐溫型乳化劑為吐溫-60或吐溫-80。
山蒼子精油不僅可有效抑制辣椒疫黴病菌遊動孢子囊的形成和釋放，其ec50值分別為29.68mg/l和207.96mg/l，同時對已釋放的遊動孢子的萌發及菌絲生長也具有很好的抑制作用，其ec50值分別90.68mg/l和161.49mg/l。
採用本發明所述山蒼子精油製成的藥液，對辣椒疫病同時具有良好的保護作用和治療作用，是一種有效的p.capsici的抑制劑，可用於辣椒疫病的綜合治理。在病害發生的不同階段均可使用其進行防治，尤其在孢子囊形成之前施用該類藥劑可有效抑制病原菌的再侵染及病害的發展蔓延。
具體實施方式
為了使本發明的技術目的、技術方案和有益效果更加清楚，下面結合具體實施例對本發明的技術方案作出進一步的說明，但所述實施例旨在解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制，實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。
下述實施例中所用山蒼子果實（新鮮）來自購自江西省吉安市吉安區集貿市場。
實施例1
將山蒼子精油溶於丙酮中，再加入吐溫-60，最後用無菌水稀釋、混勻，得到所需山蒼子精油濃度的藥液。每1l藥液中含山蒼子精油的濃度為1g、丙酮0.2g、吐溫-601g。
上述山蒼子精油的製備方法，包括以下步驟：將山蒼子果實幹燥、研磨、過篩，得到山蒼子粉；將山蒼子粉採用超臨界co2萃取，得到山蒼子精油；其中，超臨界co2萃取條件：萃取溫度45℃，萃取時間60分鐘，萃取壓力2.5mpa，co2流量1.5ml/min。
實施例2
將山蒼子精油溶於甲醇，再加入吐溫-80，最後用無菌水稀釋、混勻，得到所需山蒼子精油濃度的藥液。每1l藥液中含山蒼子精油的濃度為1.5g、甲醇0.3g、吐溫-801.5g。
上述山蒼子精油的製備方法，包括以下步驟：將山蒼子果實幹燥、研磨、過篩，得到山蒼子粉；將山蒼子粉採用超臨界co2萃取，得到山蒼子精油；其中，超臨界co2萃取條件：萃取溫度40℃，萃取時間80分鐘，萃取壓力2mpa，co2流量2ml/min。
實施例3
將山蒼子精油溶於乙醇，再加入吐溫-60，最後用無菌水稀釋、混勻，得到所需山蒼子精油濃度的藥液。每1l藥液中含山蒼子精油的濃度為2g、乙醇0.4g、吐溫-602g。
上述山蒼子精油的製備方法，包括以下步驟：將山蒼子果實幹燥、研磨、過篩，得到山蒼子粉；將山蒼子粉採用超臨界co2萃取，得到山蒼子精油；其中，超臨界co2萃取條件：萃取溫度50℃，萃取時間40分鐘，萃取壓力3mpa，co2流量1.2ml/min。
實施例1~3製得的藥液採用整株噴霧的方式施用於作物。
實施例4
將山蒼子精油溶於丙二醇，再加入吐溫-80，最後用無菌水稀釋、混勻，得到所需山蒼子精油濃度的藥液。每1l藥液中含山蒼子精油的濃度為1.5g、丙二醇0.3g、吐溫-801g。
上述山蒼子精油的製備方法，包括以下步驟：將山蒼子果實幹燥、研磨、過篩，得到山蒼子粉；將山蒼子粉採用超臨界co2萃取，得到山蒼子精油；其中，超臨界co2萃取條件：萃取溫度45℃，萃取時間60分鐘，萃取壓力2.5mpa，co2流量1.5ml/min。
實施例5
將山蒼子精油溶於甘油，再加入吐溫-60，最後用無菌水稀釋、混勻，得到所需山蒼子精油濃度的藥液。每1l藥液中含山蒼子精油的濃度為2g、甘油0.4g、吐溫-602g。
上述山蒼子精油的製備方法，包括以下步驟：將山蒼子果實幹燥、研磨、過篩，得到山蒼子粉；將山蒼子粉採用超臨界co2萃取，得到山蒼子精油；其中，超臨界co2萃取條件：萃取溫度40℃，萃取時間80分鐘，萃取壓力2mpa，co2流量2ml/min。
實施例6
將山蒼子精油溶於乙醇，再加入吐溫-80，最後用無菌水稀釋、混勻，得到所需山蒼子精油濃度的藥液。每1l藥液中含山蒼子精油的濃度為2.5g、乙醇0.5g、吐溫-803g。
上述山蒼子精油的製備方法，包括以下步驟：將山蒼子果實幹燥、研磨、過篩，得到山蒼子粉；將山蒼子粉採用超臨界co2萃取，得到山蒼子精油；其中，超臨界co2萃取條件：萃取溫度50℃，萃取時間40分鐘，萃取壓力3mpa，co2流量1.2ml/min。
實施例4~6製得的藥液採用灌根的方式施用於作物。
效果試驗：
試驗材料：辣椒疫黴病菌p.capsici由河南省新型農藥創製與應用重點試驗室提供。v8培養基：100mlv8汁加入去離子水900ml，caco31.5g，瓊脂20g。v8培養液：100mlv8汁加入去離子水900ml，caco30.02g。
試驗液的配製：將3g山蒼子精油、0.2g丙酮及1g吐溫-60混勻，並用無菌水稀釋至1l，得到濃度為3000mg/l的山蒼子精油試驗液，記為試驗液11；將試驗液11用無菌水分別稀釋至山蒼子精油濃度為25mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l、500mg/l、600mg/l、1000mg/l及2000mg/l，分別記為試驗液1、試驗液2、試驗液3、試驗液4、試驗液5、試驗液6、試驗液7、試驗液8、試驗液9、試驗液10。
對照液的配置：將0.2g丙酮及1g吐溫-60混勻，並用無菌水稀釋至1l，即得對照液1；將0.3g丙酮及1g吐溫-60混勻，並用無菌水稀釋至1l，即得對照液2。
1．山蒼子精油對辣椒疫黴菌菌絲生長的抑制毒力
分別取不同濃度的試驗液1ml加到含9mlv8培養基的培養皿（直徑9cm）中。用打孔器打取直徑為5mm的辣椒疫黴菌餅，每個培養皿放置1個菌餅，以對照液1為對照，每處理重複3次。置於25℃恆溫培養箱中培養，當對照菌落直徑長至7cm以上時，用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率，具體結果見表1。
表1山蒼子精油對辣椒疫黴菌菌絲生長的抑制作用
通過研究山蒼子精油對辣椒疫黴菌絲生長的毒力可知，山蒼子精油對辣椒疫黴菌菌絲生長具有顯著的抑制作用，其中200mg/l和300mg/l兩個處理的抑制率分別達到78.40%和91.98%。
2．山蒼子精油對辣椒疫黴菌遊動孢子囊形成的影響
將培養3d的辣椒疫黴菌取出，從菌落邊緣1/3處切取直徑5mm的菌餅10塊，置於滅菌培養皿（直徑9cm）中，倒入15ml的v8汁剛好淹沒菌絲塊，25℃黑暗培養2d待菌絲叢長出。菌絲叢應用無菌水漂洗3次，分別各加入10ml試驗液1、試驗液2、試驗液3、試驗液4，25℃全光照培養2d，以對照液2為對照。每個處理重複3次。24h後，每個重複隨機選取3個視野統計孢子囊個數，計算孢子囊形成抑制率，結果如表2所示。
表2山蒼子精油對辣椒疫黴病菌遊動孢子囊形成的影響
由表2可知，山蒼子精油可有效抑制辣椒疫黴病菌遊動孢子囊的形成，且精油濃度越高，抑制作用越強。低濃度山蒼子精油處理下，辣椒疫黴孢子囊有不同程度的萌發率，但當精油濃度升高到150mg/l時，則孢子囊幾乎不能形成。進一步試驗求出精油對辣椒疫黴孢子囊形成的毒力回歸方程為y=0.6928+2.9252x，相關係數為0.9910，ec50值為29.68mg/l。
3．山蒼子精油對辣椒疫黴菌遊動孢子囊釋放的影響
將已產生大量孢子囊的菌絲叢挑入錐形瓶，加入10ml無菌水，用玻璃棒攪拌，使遊動孢子囊震落，挑出菌絲塊，即為遊動孢子囊懸浮液。分別吸取30µl對照液1、試驗液3、試驗液5、試驗液8、試驗液9、試驗液10加入到含有30µl孢子囊懸浮液的凹玻片上，將凹玻片置於含有溼濾紙的培養皿中保溼，經4℃低溫處理30min，移至25℃恆溫箱中培養5h，取出凹玻片在10×10倍顯微鏡下隨機檢查3個視野，每個視野觀察約50個孢子囊，以遊動孢子囊中遊動孢子全部遊出而成空殼記錄為完全釋放，計算孢子囊萌發率。每處理3個重複，結果如表3所示。
表3山蒼子精油對辣椒疫黴菌遊動孢子囊釋放的影響
由表3可以看出，不同濃度山蒼子精油對辣椒疫黴遊動孢子囊釋放有不同程度的影響，且隨著精油濃度增大，孢子囊釋放量降低。當山蒼子精油濃度高於300mg/l時，其對孢子囊釋放的抑制率超過50%，當精油濃度為1000mg/l時，孢子囊釋放抑制率提高到97.91%。由此求出山蒼子精油對辣椒疫黴菌孢子囊釋放的毒力回歸方程為y=-0.8810+2.5371x，相關係數r值為0.9593，ec50值為207.96mg/l。
4．山蒼子精油對辣椒疫黴病菌遊動孢子萌發的影響
採用懸滴法測定山蒼子精油對辣椒疫黴病菌遊動孢子萌發的影響。將已產生大量孢子囊的菌絲先置於4℃低溫下處理30min，25℃恆溫培養箱培養1h，將菌絲叢挑出，收集孢子懸浮液。分別吸取30µl對照液1、試驗液3、試驗液5、試驗液8、試驗液9、試驗液10加入到含有30µl孢子懸浮液的凹玻片上，將凹玻片置於含有溼濾紙的培養皿中保溼，每處理重複3次，25℃黑暗培養3h。當對照孢子萌發率大於80%後，檢查所有處理的萌發率，計算孢子萌發抑制率，並根據機率值分析法求毒力回歸方程和抑制中濃度ec50值，結果如表4所示。
表4山蒼子精油對辣椒疫黴病菌遊動孢子萌發的影響
表4表明，山蒼子精油對辣椒疫黴菌遊動孢子萌發的抑制活性隨藥劑濃度的增加而增大。當精油濃度為100mg/l時，對遊動孢子萌發的抑制率為52.44%，當精油濃度提高到500mg/l時，對遊動孢子萌發的抑制率則達82.44%。山蒼子精油抑制辣椒疫黴遊動孢子萌發的ec50值為90.68mg/l，毒力回歸直線方程為y=-2.2061+1.4273x（r=0.9876）。
5．噴霧法測定山蒼子精油對辣椒疫病的田間防治效果
本試驗安排在河南省鄭州市黃河漁場歷年辣椒疫病發病較重的田塊。對照藥劑250克/升嘧菌酯懸浮劑由華北製藥河北華諾有限公司提供；豫甜大甜椒由河南豫藝種業科技發展有限公司提供。
試驗共5個處理（包括清水對照），4次重複，20個小區，隨機區組排列。每小區面積約20m2，小區間間隔2行作為保護行。在辣椒疫病初發生時，用16a型背負式手動增壓噴霧器對辣椒整株進行均勻噴霧，藥液量為每小區1.6kg。噴霧時從低濃度到高濃度依次進行。噴藥後15天和30天，分別調查並記錄每小區的病株數、死株數和明顯枯萎的植株數計算不同處理的發病株率和防治效果。具體結果見表5。
表5山蒼子精油對辣椒疫病的防治效果（噴霧法）
從表5可以看出，採用噴霧法對辣椒整株進行噴施，2000mg/l山蒼子精油對辣椒疫病的防治效果達75.62%，和對照藥劑的防效相當；1500mg/l和1000mg/l山蒼子精油的防效雖顯著低於對照藥劑，但對辣椒疫病這一毀滅性的土傳病害來說，其防效均達65%以上，值得推廣應用。
6．灌根法測定山蒼子精油對辣椒疫病的田間防治效果
本試驗安排在河南省鄭州市黃河漁場歷年辣椒疫病發病較重的田塊。對照藥劑250克/升嘧菌酯懸浮劑由華北製藥河北華諾有限公司提供；豫甜大甜椒由河南豫藝種業科技發展有限公司提供。
試驗共5個處理（包括清水對照），4次重複，20個小區，隨機區組排列。每小區面積約20m2，小區間間隔2行作為保護行。在辣椒疫病初發生時，用注射器將50ml不同處理的藥液在距離根莖3cm處灌根。藥後15天和30天，每小區隨機調查5個點，每點查5株，記錄病株數、死株數和明顯枯萎的植株數，計算不同處理的發病株率和防治效果。具體結果見表6。
表6山蒼子精油對辣椒疫病的防治效果（灌根法）
從表6可以看出，採用灌根法進行施藥，2500mg/l和2000mg/l山蒼子精油對辣椒疫病的防治效果分別達80.37%和74.90%，和對照藥劑的防效相當；1500mg/l山蒼子精油的防效與雖顯著低於對照藥劑和高濃度處理的防效，但對辣椒疫病的防效達65%以上，與中濃度處理的防效無差異。
綜上，本試驗研究發現山蒼子精油不僅可有效抑制辣椒疫黴病菌遊動孢子囊的形成和釋放，其ec50值分別為29.68mg·l-1和207.96mg·l-1，同時對已釋放的遊動孢子的萌發及菌絲生長也具有很好的抑制作用，其ec50值分別90.68mg·l-1和161.49mg·l-1；噴霧法和灌根法的田間藥效試驗結果表明，該精油對辣椒疫病具有良好的防治效果，是一種有效的p.capsici的抑制劑，可用於辣椒疫病的綜合治理。在病害發生的不同階段均可使用其進行防治，尤其在孢子囊形成之前施用該類藥劑可有效抑制病原菌的再侵染及病害的發展蔓延。
以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其做出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和範圍。