通過在微生物中擴增pand基因製備d-泛酸的發酵方法

2023-08-13 06:10:31 2

專利名稱：通過在微生物中擴增pand基因製備d-泛酸的發酵方法
泛酸是應用於化妝品、醫藥、人類和動物營養的商業上重要的維生素。
泛酸可以通過化學合成來製備或通過生物技術在適當營養溶液中適當微生物的發酵來製備。化學合成中，DL-泛內酯(pantolactone)是重要的中間產物。它是在多步驟過程中從甲醛、異丁醛和氰化物製備的。在隨後的步驟中，拆分此消旋混合物並用β-丙氨酸縮合D-泛內酯以得到D-泛酸。
通過微生物發酵製備的優勢是直接形成所需的立體異構體D形泛酸而無L-泛酸。
正如EP-A 0 493 060中所示，不同種的細菌如大腸桿菌、產尿節桿菌、產紅棒桿菌和產氨短桿菌以及酵母如Debaromyces castellii。可以在含有葡萄糖、DL-泛解酸和β-丙氨酸的營養溶液中合成D-泛酸。EP-A 0493 060也表明，以大腸桿菌為例，在含有葡萄糖、DL-泛解酸和β-丙氨酸的營養溶液中D-泛酸的合成通過擴增質粒pFV3和pFV5中所含的來自大腸桿菌的泛酸生物合成基因得到增強。
EP-A 0 590 857和US 5,518,906描述了從大腸桿菌菌株IF003547衍生的突變體如FV5714、FV525、FV814、FV521、FV221、FV6051和FV5069，它們具有對各種抗代謝物如水楊酸、α-丁泛解酸、β-羥基天冬氨酸、O-甲基蘇氨酸和α-酮異戊酸的耐受性，並且在含有葡萄糖的營養溶液中合成泛解酸，在含有葡萄糖和β-丙氨酸的營養溶液中合成D-泛酸。EP-A 0590 857和US 5,518,906也表明，在上述菌株中，質粒pFV31中所含的特定泛酸生物合成基因擴增後，在含有葡萄糖的營養溶液中D-泛解酸的產量以及含有葡萄糖和β-丙氨酸的營養溶液中D-泛酸的產量均有提高。
另外，WO97/10340表明，在形成泛酸的大腸桿菌菌株中，泛酸合成可以通過提高纈氨酸生物合成酶—乙醯羥基羧酸合酶II的活性而得到進一步增強。發明目的本發明人的目的是提供製備泛酸的改良發酵方法的新原理。發明詳述維生素泛酸是應用於化妝品、醫藥、人類和動物營養的商業上重要的產品。所以，對提供製備泛酸的新方法有廣泛興趣。
當在下文中提到D-泛酸、泛酸和泛酸鹽時，它們應理解為不僅指游離酸也指D-泛酸鹽類如鈣鹽、鈉鹽、氨鹽或鉀鹽。
本發明特別提供使用微生物製備D-泛酸的方法，具體地，微生物是已能產D-泛酸的微生物並且其中編碼L-天冬氨酸-1-脫羧酶(E.C.4.1.1.11)的panD基因單獨或與panB和/或panC基因一起擴增並特別地過量表達。本發明進一步涉及權利要求書中所定義的相應重組DNA序列。本發明也提供使用按權利要求8-17製備的產D-泛酸微生物進行的製備D-泛酸的發酵方法。
本文中術語「擴增」是指微生物中由適當DNA編碼的一種或多種酶的細胞內活性例如通過增加基因拷貝數、使用強啟動子或使用編碼具有高活性的適當酶的基因以及選擇性地結合這些方法而得到提高。
本發明所提供的微生物可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉或纖維素或利用甘油和乙醇合成泛酸。所述微生物可以是真菌、酵母、革蘭氏陽性細菌如棒桿菌屬的細菌或是革蘭氏陰性細菌如腸桿菌科的細菌。腸桿菌科中可特別提出的是埃希氏菌屬和大腸桿菌種。大腸桿菌品種中，可以提及所謂的K-12菌株如菌株MG1655或W3110[Neidhard等大腸桿菌和沙門氏菌。細胞和分子生物學(ASM Press，Washington DC)]或大腸桿菌野生型菌株IFO3547(發酵研究所，Osaka，Japan)及由其衍生的突變體。在棒桿菌屬中，可特別提出穀氨酸棒桿菌，本領域技術人員已知其合成胺基酸的能力，此物種包括野生型菌株如穀氨酸棒狀菌ATCC13032、黃色短桿菌ATCC14067、Corynebacteriummelassecola ATCC17965及其突變體。
本發明人發現在過量表達尤其來自穀氨酸棒桿菌的編碼L-天冬氨酸-1-脫羧酶(E.C.4.1.1.11)的新panD基因後，微生物的泛酸合成得到增強。
本發明人還發現panD基因在其中編碼酮泛解酸羥甲基轉移酶和泛酸合成酶的panB和panC基因分別或一起額外表達的菌株中具有有利效應。
過量表達可以通過增加適當基因的拷貝數或突變位於結構基因上遊的啟動子和調控區域來實現。在結構基因上遊摻入的表達盒以相同方式起作用。另外，可誘導的啟動子可以通過發酵增加D-泛酸合成過程中的表達。延長mRNA壽命的方法也可提高表達。而且，酶活性也通過防止酶蛋白的降解而得到提高。基因或基因構建體可以位於可變拷貝數的質粒中或在染色體整合併擴增。選擇性地，也可以通過改變培養基的成分和培養技術實現目的基因的過量表達。
本領域技術人員將尤其在Martin等(生物/技術5，137-146(1987))、Guerrero等(基因138，35-41(1994))、Tsuchiya和Morinaga(生物/技術6，428-430(1988))、Eikmanns等(基因102，93-98(1991))、EP 0 472 869、US 4,601,893、Schwarzer和Pühler(生物/技術9，84-87(1991))、Reinscheid等，(應用和環境微生物學60，126-132(1994))、LaBarre等(細菌學雜誌175，1001-1007(1993))、專利申請WO96/15246、Jensen和Hammer(生物技術和生物工程58，191-195(1998))或美國細菌學學會(Washington DC，USA，1981)的手冊「普通細菌學方法手冊」中找到相關說明。
本領域技術人員也將尤其在Chang和Cohen(細菌學雜誌，134，1141-1156(1978))、Hartley和Gregori(基因13，347-353，(1981))、Amann和Brosius(基因40，183-190(1985))，de Broer等(美國國家科學院院報80，21-25(1983))、LaVallie等(生物/技術11，187-193(1993))、PCT/US97/13359、Llosa等(質粒26，222-224(1991))、Quandt和Klipp(基因80，161-169(1989))、Hamiton(細菌學雜誌171，4617-4622(1989))、Makrides(微生物學綜述60，512-538(1996))以及眾所周知的遺傳學和分子生物學書本中找到相關說明。
從穀氨酸棒桿菌分離panD基因或其它基因如panB和panC基因的第一個步驟是在大腸桿菌中構建此微生物的基因文庫。基因文庫的構建一般在眾所周知的書本和手冊中均有記錄。可提及的例子是Winnacker的題為「從基因到克隆，基因技術介紹」(Verlag Chemie，Weinheim，Germany，1990)的書本或Sambrook等題為「分子克隆，實驗手冊」(冷泉港實驗室出版社，1989)的手冊。眾所周知的基因文庫是由Kohara等在λ載體中構建的大腸桿菌K-12菌株W3110的基因文庫(細胞50，495-508(1987))。Bathe等(分子和普通遺傳學252，255-265(1996))描述了使用粘粒載體SuperCos I(Watl等，美國國家科學院院報84，2160-2164(1987))在大腸桿菌K-12菌株NM554(Raleigh等，核酸研究16，1563-1575(1988))中構建的穀氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。大腸桿菌中穀氨酸棒桿菌的基因文庫也可以使用諸如PBR322(Bolivar，生命科學25，807-818(1979))或PUC9(Vieira等，基因19，259-268(1982))的質粒得到構建。限制和重組缺陷性大腸桿菌是尤為適合的宿主，菌株DH5αmcr是由Grant等描述的例子(美國國家科學院院報87，4645-4649(1990))。
然後將基因文庫通過轉化(Hanahan，分子生物學雜誌166，557-580(1983))或電穿孔(Tauch等，FEMS Microbiological Letter123，343-347(1994))轉入指示菌株。指示菌株的鑑定性特徵是其在目的基因中有突變導致可檢測的表型，例如營養缺陷型。帶有panD基因中突變的大腸桿菌突變體DV9(Vallari和Rock，細菌學雜誌164，136-142(1985))，在本發明的框架中尤其有利。需要泛酸的大腸桿菌的另一例子是帶有panB基因中突變的菌株SJ2，可從耶魯大學的基因貯存中心(New Haven，Connecticut，USA)得到。用攜帶目的基因如panD基因的重組質粒轉化指示菌株如panD突變體DV9並表達目的基因，在適當特徵如需要泛酸方面，指示菌株變成原養型。用此方法分離的基因或DNA片段可以通過如Sanger等所述的序列測定(美國國家科學院院報，74，5463-5467(1977))得到鑑定。然後，與資料庫如基因庫中所含已知基因的相同性(Benson等，(sic)，1998，核酸研究，261-7)可以通過公開的方法(Altschul等，1990，分子生物學雜誌215403-410)分析。
來自穀氨酸棒桿菌編碼panD基因的新DNA序列以此方法獲得，為SEQID No1，它構成本發明的一部分。相應酶的胺基酸序列通過上述方法從所述DNA序列推導出來。panD基因產物即L-天冬氨酸-1-脫羧酶的胺基酸序列在SEQ ID No.2中表示。來自穀氨酸棒桿菌編碼panB和panC基因的新DNA序列以此方法獲得，為SEQ ID No3，它構成本發明的一部分。相應酶的胺基酸序列通過上述方法從所述DNA序列推導出來。所得的panB基因產物即酮泛解酸羥甲基轉移酶的胺基酸序列在SEQ ID No.4中表示，並且所得的panC基因產物即泛酸合成酶的胺基酸序列在SEQ ID No.5中表示。
由於遺傳密碼的簡併性而從SEQ ID No.1或SEQ ID No.3得到的編碼DNA序列也構成本發明的一部分。相似地，與SEQ ID No.1或SEQ ID No.3雜交的DNA序列構成本發明的一部分。而且，本領域技術人員已知保守胺基酸互換如蛋白質中甘氨酸換成丙氨酸或天冬氨酸換成穀氨酸為有義突變，這種突變不引起蛋白活性的基本改變，即它們是中性的。也已知蛋白N和/或C末端的改變基本上不破壞其功能，甚至可以穩定蛋白。本領域技術人員將尤其在Ben-Bassat等(細菌學雜誌169，751-757(1987))、O』Regan等(基因77，237-251(1989))、Sahin-Toth等(蛋白質科學3，240-247(1994))、Hochuli等(生物/技術6，1321-1325(1988))以及眾所周知的遺傳學和分子生物學書本中發現這方面的信息。從SEQ IDNo.2、SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.5相應得來的胺基酸序列也構成本發明的一部分。
然後用此方法鑑定的基因可以單獨或與其它基因結合在適當微生物中表達。表達或過量表達基因的已知方法在於藉助另外提供表達信號的質粒載體擴增基因。可能的質粒載體是那些能在適當微生物中複製的質粒載體。用於本發明的可能載體的例子對於大腸桿菌是pSC101(Vocke和Bastia美國國家科學院院報80(21)，6557-6561(1983))或pKK223-3(Brosius和Holy，美國國家科學院院報81，6929(1984))，或者對於穀氨酸棒桿菌是pEK Ex1[Eikmanns等，基因10293-98(1990)]或pZ8-1(EP 0 375 889)。這樣的微生物的例子是包含質粒pND-D1和pND-D2的穀氨酸棒桿菌菌株ATCC/13032/pND-D2和ATCC/3032/pND-DBC2和大腸桿菌菌株MG1655/PND-D2。質粒pND-D2是以質粒pZ8-1為基礎攜帶來自穀氨酸棒桿菌的panD基因的大腸桿菌—穀氨酸棒桿菌穿梭載體。質粒pND-DBC2是以質粒pZ8-1為基礎攜帶來自穀氨酸棒桿菌的panD、panB和panC基因的大腸桿菌—穀氨酸棒桿菌穿梭載體。
對於本領域技術人員很明顯，賦予對代謝物和抗代謝物耐受性或防止泛酸前體流失的染色體突變可以與本發明所提供的方法有利地結合。
按照本發明製備的微生物可以通過分批方法、補料分批方法和重複補料分批方法連續或不連續培養用於泛酸生產。Chmiel的書(生物加工技術1.生物工程介紹，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas的書(生物反應器和外周設備，Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))中提供了已知培養方法的總結。
欲使用的培養基必須適當地符合特定微生物的要求。不同微生物的培養基的描述可見於美國細菌學會的手冊「普通細菌學方法手冊」(Washington DC，USA，1981)。可以使用的碳源是糖類和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉和纖維素，油和脂肪如大豆油、葵花子油、花生油和椰子脂肪，脂肪酸如棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸，酒精如甘油和乙醇以及有機酸如乙酸。這些物質可以單獨或作為混合物使用。可以使用的氮源是有機含氮化合物如蛋白腖、酵母提取物、肉類抽提物、麥芽抽提物、玉米漿、大豆粉和尿素或無機化合物如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。氮源可以單獨或作為混合物使用。可以使用的磷源是磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應的鈉鹽。培養基還必須含有金屬鹽如對於生長必需的硫酸鎂或硫酸鐵。最後，除了以上所述的物質，可以使用必要的促生長物質如胺基酸和維生素。也可以將泛酸前體如天冬氨酸、β-丙氨酸、酮異戊酸、酮泛解酸或泛解酸和/或選擇性地它們的鹽類加入培養基以進一步增加泛酸產量。上述添加物可以一次全部加入培養物，也可在培養期間適當地加入。
培養基的PH值可以通過適當使用鹼性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨或者酸性化合物如磷酸或硫酸來控制。泡沫形成可以使用消泡劑多聚脂肪酸甘油酯來控制。質粒的穩定性可以通過加入適當選擇性作用物質如抗生素來維持。需氧條件通過向培養基輸入氧氣或含氧氣體混合物如空氣來保持。培養基的溫度正常在20℃-50℃，優選25℃-45℃。持續培養直至泛酸合成達到最大值。此目標一般在10到160小時達到。
具有高度L-天冬氨酸-1-脫羧酶活性的菌株也可用於從L-天冬氨酸製備β-丙氨酸。發酵方法、酶轉化反應或二者的結合都可用於此目的。
合成的泛酸濃度可用已知方法確定(Velisek，色譜科學60，515-560(1992))。
下列微生物依照布達佩斯條約條款保藏於德意志微生物和細胞保藏中心(DSMZ)，Brunswick，Germany穀氨酸棒桿菌ATCC13032/pND-D2為DSM12438穀氨酸棒桿菌ATCC13032/pND-DBC2為DSM12437實施例本發明藉助以下實施例得到更詳細的說明。實施例1來自穀氨酸棒桿菌的panD基因的克隆和測序1.panD基因的克隆按Tauch等所述的(質粒33，168-179(1995))從穀氨酸棒桿菌ATCC13032分離染色體DNA，並用限制性酶Sau3A(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany，產品描述Sau3A，編號27-0913-02)部分切割。用Nucleotrap抽提試劑盒(Macherey和Nagel，Düren，Germany；目錄號740584)分離大小範圍7-9kb的DNA片段，並將其連接入從MBI Fermentas(Vilnius，Lithuania)得到的載體pUC19(Norrander等，基因26，101-106(1982))的磷酸化BamHI酶切位點。按Sambrook等所述的(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)進行連接，DNA混合物與T4連接酶(PharmaciaBiotech，Freiburg，Germany)一起溫育過夜。然後，通過電穿孔(Tauch，FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))將此連接混合物轉入大腸桿菌DH5αmcr(Grant，美國國家科學院院報87，4645-4649(1990))中，並將其塗在LB瓊脂(Lennox，病毒學1，190(1995))+100μg/ml青黴素上。37℃培養24小時後，通過用Birnboim和Doly的鹼裂解方法再分離質粒DNA(核酸研究7，1513-1523(1997))，可以從轉化子獲得穀氨酸棒桿菌基因文庫。通過電穿孔將此基因文庫轉入帶有panD基因突變的大腸桿菌菌株DV9(Vallari和Rock，細菌學雜誌164，136-142(1985))中。再生期後(Tauch等，FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))，用培養基E(Vogel和Bonner，生物化學雜誌218，97-106(1956))將此電穿孔混合物洗兩次。介質E的組成見表1。用這些細胞接種250ml錐形瓶中的50ml培養基E+100μg/ml青黴素並於39℃在250rpm的通氣搖床中培養。培養兩天後，將細菌懸浮物稀釋並在補加100μg/ml青黴素的LB瓊脂(Lennox，病毒學1，190(1995))上劃線接種。
表1
分離稱為pNIC-1.3的DV9轉化子的質粒DNA並通過瓊脂糖凝膠電泳(Sambrook等，分子克隆實驗手冊(1989)，冷泉港實驗室出版社)並與已知長度的標準DNA片段比較進行鑑定。質粒pNIC-1.3含有7kbp插入片段。pNIC-1.3的互補能力通過panD突變體DV9的重新轉化來檢測。繼而所得的轉化子能在上述條件下於無β-丙氨酸的培養基E中生長。
通過用限制性BamH I(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany，產品描述BamH I，編號27-0868-03)、EcoR I(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany，產品描述EcoR I，編號27-0884-03)和Bgl II(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany，產品描述Bgl II，編號27-0946-02)切割質粒pNIC1.3，接著與用適當限制性酶(Schǎfer，基因145，69-73(1994))消化的載體pK18mob連接對7Kb插入片段進行亞克隆。通過電穿孔將得到的連接混合物轉入大腸桿菌panD突變體DV9；按上述進行互補轉化子的篩選，此例中的瓊脂平板含50μg/ml卡那黴素。分離互補單克隆的質粒並通過限制性分析進行鑑定選擇此後稱為pNIC-10的含有約3kb DNA插入序列的EcoR I亞克隆進行下列序列分析。2.panD基因的序列測定為進行雙鏈測序，用各種限制性酶切割pNIC-10的3kb片段，並將片段亞克隆入質粒pUC19或pK18mob。按製造商的說明用QIAGEN質粒Mini試劑盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，Ca.，USA)分離用於測序的質粒DNA，並且可以通過瓊脂糖凝膠電泳確定質粒的大小。
測序按Sanger等的雙脫氧鏈終止法(美國國家科學院院報74，5463-5467(1977))進行，並經Zimmermann等改良(核酸研究18，1067(1990))。使用來自Pharmacia的Cy5自動測序試劑盒(產品號27-2690-02，Freiburg，Germany)。凝膠電泳分離和測序反應的分析用來自Amersham Pharmacia Biotech(Uppsla，Sweden)的自動雷射螢光(A.L.F)顯示DNA測序儀，在長範圍凝膠溶液聚丙烯凝膠(FMC Bioproducts，Rockland，Me.，USA)上進行。然後對獲得的原始序列資料用97-0版Staden軟體包進行處理(核酸研究14，217-231(1986))。所有pNIC-10亞克隆的各個序列都被整理到稱為重疊群13的衍接的3060bp重疊群中。用XNIP軟體(Staden，核酸研究14，217-231(1986))對整個DNA片段進行計算機輔助的編碼區分析，鑑定到5個開放讀碼框(ORF)。


圖1表示重疊群13的限制性圖譜和表示為orf1-orf5的ORF的位置。用可通過國家醫學圖書館(Bethesda，MD，USA)的NCBI伺服器的網上服務得到BLAST搜索程序[Gish和States，Nature of基因tics 3，266-272(1993))；Altschul等，分子生物學雜誌215，403-410(1990)]進行同源性分析。重疊群13分析表明orf-3是panD基因。orf-3以後稱為panD基因。含有panD基因的DNA片段的核苷酸序列表示為SEQ ID No.1。從上述步驟得到的panD基因產物即L-天冬氨酸-1-脫羧酶的胺基酸順序表示為SEQ ID No.2。實施例2來自穀氨酸棒桿菌的panB和panC基因的克隆和測序1.panB和panC基因的克隆按Schwarzer和Pühler所述的(生物/技術9，84-87(1995))從穀氨酸棒桿菌ATCC13032分離染色體DNA，並用限制性酶Sau3A切割。凝膠電泳(sic)分離後，分離大小範圍3-7kb或9-20kb的DNA片段並將其與載體BR332的單一BamH I酶切位點連接。用連接混合物轉化(Hanahan，分子生物學雜誌166，(1983)557-580)大腸桿菌DH5αmcr(Grant，美國國家科學院院報(sic)87，4645-4649(1990))。在含有100μg/ml青黴素的LB瓊脂平板上接種後，通過它們的四環素敏感性鑑定帶有插入片段的克隆。通過質粒製備方法(Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊(1989)，冷泉港實驗室出版社)從匯集的克隆分離8組各含有帶有9-20kb插入大小的400個質粒和9組各含有帶有3-7kb插入大小的500個質粒。通過電穿孔(Wehrmann等，1994，分子生物學1403349-3356)用此基因庫轉化大腸桿菌panB突變體SJ2。轉化混合物直接塗在含有15g/l瓊脂的CGXII培養基(Keilhawer等，細菌學雜誌(1993)1755595-5603)上。從能在無泛酸添加劑的情況下生長的菌落分離質粒DNA(Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊(1989)，冷泉港實驗室出版社)。以8個質粒為例，可以通過再轉化證實異源互補大腸桿菌突變體SJ2的panB缺陷的能力。
使用8個質粒進行限制性作圖。一個研究的質粒載體(此後稱為POR1)含有9.3kb插入(圖2)。大腸桿菌panC突變體DV39(Vallari和Rock，1985，細菌學雜誌164136-142)的轉化表明載體pUR1也能互補此突變體的panC缺陷。2.panB和panC基因的序列測定pUR1的2.2kb插入片段(圖2)按Sanger等的雙脫氧鏈終止法(美國國家科學院院報74，5463-5467(1977))進行測序。為進行測序，首先用內切核酸酶III製備亞克隆並藉助標準引物(來自德國BoehringerMannheim公司的通用和反向引物)對它們進行測序。測序混合物的凝膠電泳分析用來自Amersham Pharmacia Biotech(Uppsla，Sweden)的自動雷射螢光(A.L.F)測序儀進行。得到的核苷酸序列用HUSAR軟體包(Release 4.0，EMBL，Cambridge，GB)進行。分析鑑定了兩個開放閱讀框架。核苷酸序列表示為SEQ ID No.3。鑑定為panB基因的一個813bp開放閱讀框架編碼271個胺基酸並表示為SEQ ID No.4。鑑定為panC基因的第二個開放閱讀框包含837個鹼基對。它編碼279個胺基酸並表示為SEQ ID No.5。實施例3構建表達panD、panBC和panDBC的載體使用聚合酶鏈反應(PCR)和合成的寡聚核苷酸擴增來自穀氨酸棒桿菌和大腸桿菌的泛酸生物合成基因。用來自Gibco-BRL(Eggestein，Germany)的Taq DNA聚合酶在PCT-100熱循環儀(MJ ResearchInc.，Watertown，Mass.，USA)中進行PCR實驗。於94℃2分鐘的一次變性步驟後，接著是於94℃ 90秒的變性步驟、於引物依賴溫度T＝(2AT+4GC)-5℃(Suggs等，1981，683-693頁，於D.D.Brown和C.F.Fox(編)，使用純化基因的發育生物學。Acedemic Press，New York，USA)90秒的退火步驟，於72℃90秒的延伸反應。最後三個步驟循環重複35次，反應以72℃10分鐘的延伸反應結束。通過瓊脂糖凝膠電泳對它們進行檢測後，按廠商說明將以此方法擴增的產物與載體pCR2.1[原始TA克隆試劑盒，Invitrogen(Leek，The Netherlsnds)，產品描述原始TA克隆試劑盒，目錄號KNM2030-01]連接，然後轉化入大腸桿菌菌種TOP10F』。通過在含有100μg/ml氨苄青黴素和40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的LB瓊脂板上培養進行轉化子的篩選。
從來自穀氨酸棒桿菌ATCC13032和大腸桿菌K12(W.K.Merkel和B.P.Nichols，1993，基因庫L17086)的泛酸生物合成基因panD(SEQ IDNo.1)和panBC(SEQ ID No.3)合成PCR引物。選擇這些引物以使擴增的片段含有這些基因及其固有的核糖體結合位點，但不含有可能的啟動子區。另外，插入適當限制性酶切位點以便克隆入目的載體。下面表2中列出了PCR引物、插入的切割位點(序列下劃線)和擴增的基因(以bp表示的片段長度在括號中給出)的序列。
表2<
圖3中所示的大腸桿菌-穀氨酸棒桿菌穿梭表達載體pZ8-1(EP 0 375889)用作在穀氨酸棒桿菌和大腸桿菌中表達的基本載體。以前克隆入載體pCR2.1的擴增產物通過引物插入的限制性酶切位點與相似處理的表達載體pZ8-1連接，並由此在該質粒中的tac啟動子的控制之下。唯一例外是擴增產物panDE.C.，在此例中將EcoR I-Bgl II片段克隆入載體pZ8-1的相容EcoR I-BamH I限制性末端。按這種方法構建的表達質粒的相應名稱在表2中表示。帶有來自大腸的panDE.C.基因的表達載體pZ8-1稱為PND-D1，而帶有來自穀氨酸棒桿菌的panDC.g.基因的表達載體稱為pND-D2。含有panDE.C.和panDC.g.的表達質粒相應地分別稱為pND-BC1和pND-BC2。以舉例方式，panDE.C.和panDC.g.的克隆策略在圖3中表示。所有表達載體的正確克隆通過相應插入片段的測序來檢測。
而且，用大腸桿菌和穀氨酸棒桿菌panD基因構建合成的panDBC操縱子。對於大腸桿菌操縱子，含有panDE.C.的載體pCR2.1用EcoRI酶切，在瓊脂糖凝膠中分離DNA並利用用於核酸的Nucleotrap抽提試劑盒(Macherey和Nagel，Düren，Germany)採用已在實施例1.1中描述的方法從凝膠純化panD片段。然後將片段與EcoRI酶切的質粒pND-BC1連接。通過將連接混合物轉化入panD營養缺陷型大腸桿菌菌株DV9並如實施例1中所述的選擇對營養缺陷型的互補作用，得到帶有正確方向的panD基因的質粒。分離互補突變體的質粒DNA並通過對稱為pND-DBC1的質粒(圖4)的插入片段測序來證實正確的基因排列。
相同方法適用於穀氨酸棒桿菌panDBC操縱子的構建。含有panDC.g.的載體pCR2.1用EcoRI酶切。一端通過引物內的酶切位點而另一端通過載體的酶切位點將panDC.g.基因從載體上切下。純化後，將此基因片段克隆入EcoRI酶切的載體pZ8-1，得到帶有正確方向panD稱為pND-D4的質粒並如上所述檢測。然後用限制性酶SalI酶切質粒pND-D4並將其與純化的通過SalI酶切得到的panBC片段(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany，產品描述SalI，編號27-0882-01)連接。將電穿孔混合物通過電穿孔轉入大腸桿菌菌株DX5αmcr，並通過限制性分析確定10個帶有panDBC基因排列的質粒。稱為pND-DBC2(圖4)的這些質粒之一的正確基因排列通過序列分析證實。
將表達載體pZ8-1和基於此質粒的構建體pND-D1、pND-2和pND-DBC1轉化入大腸桿菌MG1655，並在LB瓊脂糖(Lennox，病毒學1，190(1955))+50μg/ml卡那黴素上選擇轉化子。獲得的菌株稱為MG1655/pZ8-1、MG1655/pND-D1如MG1655/pND-DBC1。
通過將pZ8-1、pND-D1、pND-D2和pND-DBC2電穿孔入穀氨酸棒桿菌菌株ATCC13032接著在LB瓊脂(lennox，1955，病毒學，1190)+25μg/ml卡那黴素上選擇，得到菌株ATCC13032/pZ8-1、ATCC13032/pND-D1、ATCC13032/pND-D2和ATCC13032/pND-DBC2。實施例4用各種大腸桿菌K12菌株合成泛酸通過植物乳桿菌泛酸分析對D-泛酸進行定量(測試菌株植物乳桿菌ATCC8014，目錄號3211-30-3；培養基Bacto泛酸分析培養基(DIFCOLaboratories，Michgan，USA，目錄號0604-15-3)。這種指示性菌株只能在含有泛酸的指示培養基中生長，並表現可用分光計測量的細菌生長與培養基泛酸濃度之間的線性依賴關係。用泛酸的高鈣鹽(hemicalcium)(Sigma，產品號P 2250)進行校準。於580nm測量波長在LKB Biochrom光度計(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany)上測定光密度(OD580)。
為從大腸桿菌菌株MG1655/pZ8-1、MG1655/pND-D1、MG1655/pND-D2和MG1655/pND-DBC1製備泛酸，用相同培養基中OD580為0.1的16小時培養物接種50ml測試培養基(培養基E加50μg/ml卡那黴素)。於37℃和250rpm培養這些培養物5和72小時後，通過於5000×g離心10分鐘沉澱細胞，將獲得的無細胞上清過濾除菌並於4℃保存直到對泛酸進行定量。
按DIFCO手冊(第10版，1100-1102頁；Michigan，USA)中說明的方法，用植物乳桿菌ATCC8014對培養物上清中的D-泛酸進行定量。這些測量結果在表3中表示。
表3
實施例5用穀氨酸棒桿菌的各種菌株合成泛酸對穀氨酸棒桿菌菌株ATCC13032/pZ8-1、ATCC13032/pND-D1、ATCC13032/pND-D2和穀氨酸棒桿菌ATCC13032/pND-DBC2在加有25μg/ml卡那黴素的培養基CGXII(keilhaney等，1993，細菌學雜誌，1755595-5603；表4)中的泛酸合成進行測試，此培養基此後稱為穀氨酸棒桿菌測試培養基。用相同培養基中的16小時培養物接種50ml穀氨酸棒桿菌測試培養基。於30℃和150rpm培養48小時後，通過於5000×g離心10分鐘除去細胞，將上清過濾除去並如實施例中所述測定泛酸濃度。用各種穀氨酸棒桿菌菌株的泛酸合成結果整理在表5中。
表4
表5
附圖附加下列附圖圖1含有orf-1到orf-5的重疊群13的圖譜圖2PUR1所含的克隆的DNA片段的圖譜以及測序的DNA片段的位置圖3質粒pZ8-1、pND-D1和pND-D2的圖譜圖4質粒pND-DBC1和pND-DBC2的圖譜附圖中所用的縮寫如下定義rrnB T1T2rrnB基因的轉錄終止子Ptac tac啟動子panB panB基因的編碼區panC panC基因的編碼區panD panD基因的編碼區rep-C.g. 在穀氨酸棒桿菌中複製的DNA區域oriV-E.c.用於向大腸桿菌無性轉移的起始點kan 卡那黴抗性基因EcoRI限制性酶EcoRI的酶切位點E限制性酶EcoRI的酶切位點BamHI限制性酶BamHI的酶切位點B限制性酶BamHI的酶切位點BglII限制性酶BglII的酶切位點ClaI 限制性酶ClaI的酶切位點H限制性酶HindIII的酶切位點NcoI 限制性酶NcoI的酶切位點NruI 限制性酶NruI的酶切位點NsiI 限制性酶NsiI的酶切位點P限制性酶PstI的酶切位點PstI 限制性酶PstI的酶切位點PvuI 限制性酶PvuI的酶切位點SacI 限制性酶SacI的酶切位點SalI 限制性酶SalI的酶切位點ScaI 限制性酶ScaI的酶切位點SphI 限制性酶SphI的酶切位點X限制性酶XhoI的酶切位點XhoI 限制性酶XhoI的酶切位點序列表(1)基本信息(i)申請人(A)名稱Degussa Aktiengesellschaft(B)街道Weissfrauenstr.9(C)城市Frankfurt am Main(D)地區Hessen(E)國家德國(F)郵政編號D-60311(ii)發明名稱用腸桿菌科菌株製備D-泛酸的發酵方法(iii)序列數5(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPA)(2)關於SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度540個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設否(iii)反義否(vi)來源(A)生物穀氨酸棒桿菌
(B)菌株ATCC13032(ix)特徵(A)名稱/關鍵CDS(B)位置77..484(C)其它信息/密碼_起始＝77/EC_號＝4.1.1.11/產品＝「L-天冬氨酸-1-脫羧酶」/基因＝「panD」(xi)序列描述SEQ ID NO1AATATTCCTT TCCTTGTCAT CTCACGCTAT GATTTCTAAA ACTTGCAGGA CAACCCCCAT 60AAGGACACCA CAGGAC ATG CTG CGC ACC ATC CTC GGA AGT AAG ATT CAC 109Met Leu Arg Thr Ile Leu Gly Ser Lys Ile His1 5 10CGA GCC ACT GTC ACT CAA GCT GAT CTA GAT TAT GTT GGC TCT GTA ACC157Arg Ala Thr Val Thr Gln Ala Asp Leu Asp Tyr Val Gly Ser Val Thr15 20 25ATC GAC GCC GAC CTG GTT CAC GCC GCC GGA TTG ATC GAA GGC GAA AAA205Ile Asp Ala Asp Leu Val His Ala Ala Gly Leu Ile Glu Gly Glu Lys30 35 40GTT GCC ATC GTA GAC ATC ACC AAC GGC GCT CGT CTG GAA ACT TAT GTC253Val Ala Ile Val Asp Ile Thr Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Val45 50 55ATT GTG GGC GAC GCC GGA ACG GGC AAT ATT TGC ATC AAT GGT GCC GCT301Ile Val Gly Asp Ala Gly Thr Gly Asn Ile Cys Ile Asn Gly Ala Ala60 65 70 75GCA CAC CTT ATT AAT CCT GGC GAT CTT GTG ATC ATC ATG AGC TAC CTT349Ala His Leu Ile Asn Pro Gly Asp Leu Val Ile Ile Met Ser Tyr Leu80 85 90CAG GCA ACT GAT GCG GAA GCC AAG GCG TAT GAG CCA AAG ATT GTG CAC397Gln Ala Thr Asp Ala Glu Ala Lys Ala Tyr Glu Pro Lys Ile Val His95 100 105GTG GAC GCC GAC AAC CGC ATC GTT GCG CTC GGC AAC GAT CTT GCG GAA445Val Asp Ala Asp Asn Arg Ile Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Ala Glu110 115 120GCA CTA CCT GGA TCC GGG CTT TTG ACG TCG AGA AGC ATT TAGCGTTTTA 494Ala Leu Pro Gly Ser Gly Leu Leu Thr Ser Arg Ser Ile125 130 135GCTCGCCAAT ATTGCTGCCG GCCTCGTTGA AAATGGTCAT GGTGGC 540(2)關於SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度136個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線型(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Leu Arg Thr Ile Leu Gly Ser Lys Ile His Arg Ala Thr Val Thr1 5 10 15Gln Ala Asp Leu Asp Tyr Val Gly Ser Val Thr Ile Asp Ala Asp Leu20 25 30Val His Ala Ala Gly Leu Ile Glu Gly Glu Lys Val Ala Ile Val Asp35 40 45Ile Thr Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Val Ile Val Gly Asp Ala50 55 60Gly Thr Gly Asn Ile Cys Ile Asn Gly Ala Ala Ala His Leu Ile Asn65 70 75 80Pro Gly Asp Leu Val Ile Ile Met Ser Tyr Leu Gln Ala Thr Asp Ala85 90 95Glu Ala Lys Ala Tyr Glu Pro Lys Ile Val His Val Asp Ala Asp Asn100 105 110Arg Ile Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Ala Glu Ala Leu Pro Gly Ser115 120 125Gly Leu Leu Thr Ser Arg Ser Ile130 135(2)關於SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度2164個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設否(iii)反義否(vi)來源(B)生物穀氨酸棒桿菌(B)菌株ATCC13032(ix)特徵(A)名稱/關鍵CDS(B)位置351..1163(C)其它信息/密碼_起始＝351/EC_號＝4.1.2.12/產品＝「酮泛解酸羥甲基轉移酶」/基因＝「panB」(ix)特徵(A)名稱/關鍵CDS(B)位置1166..2002(C)其它信息/密碼_起始＝1166/EC_號＝6.3.2.1/產品＝「泛酸合成酶」/基因＝「panC」(xi)序列描述SEQ ID NO3GCTTCGGGGT ACCAATTCCT TTAAGAACCA TCAGATCAAT CTGTTGTACA TTCTCGGCCA60GATTCAGCTT TTCGGTAAGG ACGAAACACT TTCACTTGAA TCGGCAGCAA AGTTTCTTAA 120AGTTTCTAAG GCAACTGCAA CGAGGTATTT TAGAACTCTC CGAGAAATGG AATTAGTTCA 180CGAGGTCAGC AAACGCCCTT TGCGGTTTGC GCTCACGGAT AAAGGTCGTG AGATAGTAGG 240TCTTGAGGTA AAAATTTGAC TCCATAACGA GAACTTAATC GAGCAACACC CCTGAACAGT 300GAATCAAATC GGAATTTATT TATTCTGAGC TGGTCATCAC ATCTATACTC ATG CCC 356Met ProATG TCA GGC ATT GAT GCA AAG AAA ATC CGC ACC CGT CAT TTC CGC GAA 404Met Ser Gly Ile Asp Ala Lys Lys Ile Arg Thr Arg His Phe Arg Glu140 145 150GCT AAA GTA AAC GGC CAG AAA GTT TCG GTT CTC ACC AGC TAT GAT GCG 452Ala Lys Val Asn Gly Gln Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr Asp Ala155 160 165 170CTT TCG GCG CGC ATT TTT GAT GAG GCT GGC GTC GAT ATG CTC CTT GTT 500Leu Ser Ala Arg Ile Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu Leu Val175 180185GGT GAT TCC GCT GCC AAC GTT GTG CTG GGT CGC GAT ACC ACC TTG TCG548Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr Leu Ser190 195 200ATC ACC TTG GAT GAG ATG ATT GTG CTG GCC AAG GCG GTG ACG ATC GCT596Ile Thr Leu Asp Glu Met Ile Val Leu Ala Lys Ala Val Thr Ile Ala205 210 215ACG AAG CGT GCG CTT GTG GTG GTT GAT CTG CCG TTT GGT ACC TAT GAG644Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr Tyr Glu220 225 230GTG AGC CCA AAT CAG GCG GTG GAG TCC GCG ATC CGG GTC ATG CGT GAA692Val Ser Pro Asn Gln Ala Val Glu Ser Ala Ile Arg Val Met Arg Glu235 240 245 250ACG GGT GCG GCT GCG GTG AAG ATC GAG GGT GGC GTG GAG ATC GCG CAG740Thr Gly Ala Ala Ala Val Lys Ile Glu Gly Gly Val Glu Ile Ala Gln255260 265ACG ATT CGA CGC ATT GTT GAT GCT GGA ATT CCG GTT GTC GGC CAC ATC788Thr Ile Arg Arg Ile Val Asp Ala Gly Ile Pro Val Val Gly His Ile270 275 280GGG TAC ACC CCG CAG TCC GAG CAT TCC TTG GGC GGC CAC GTG GTT CAG836Gly Tyr Thr Pro Gln Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val Val Gln285 290 295GGT CGT GGC GCG AGT TCT GGA AAG CTC ATC GCC GAT GCC CGC GCG TTG884Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ala Arg Ala Leu300 305 310GAG CAG GCG GGT GCG TTT GCG GTT GTG TTG GAG ATG GTT CCA GCA GAG932Glu Gln Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro Ala Glu315 320 325 330GCA GCG CGC GAG GTT ACC GAG GAT CTT TCC ATC ACC ACT ATC GGA ATC980Ala Ala Arg Glu Val Thr Glu Asp Leu Ser Ile Thr Thr Ile Gly Ile335 340 345GGT GCC GGC AAT GGC ACA GAT GGG CAG GTT TTG GTG TGG CAG GAT GCC1028Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gln Val Leu Val Trp Gln Asp Ala350 355 360TTC GGC CTC AAC CGC GGC AAG AAG CCA CGC TTC GTC CGC GAG TAC GCC1076Phe Gly Leu Asn Arg Gly Lys Lys Pro Arg Phe Val Arg Glu Tyr Ala365 370 375ACC TTG GGC GAT TCC TTG CAC GAC GCC GCG CAG GCC TAC ATC GCC GAT1124Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gln Ala Tyr Ile Ala Asp380 385 390ATC CAC GCG GGT ACC TTC CCA GGC GAA GCG GAG TCC TTT TA ATG CAG 1171Ile His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser PheMet Gln395 400 405 1GTA GCA ACC ACA AAG CAG GCG CTT ATC GAC GCC CTC CTC CAC CAC AAA1219Val Ala Thr Thr Lys Gln Ala Leu Ile Asp Ala Leu Leu His His Lys5 10 15TCC GTC GGG CTC GTC CCC ACC ATG GGT GCG CTA CAC AGC GGA CAC GCC1267Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly His Ala20 25 30TCG TTG GTT AAA GCA GCA CGC GCT GAA AAC GAC ACT GTT GTA GCC AGT1315Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val Ala Ser35 40 45 50ATT TTT GTC AAT CCC CTG CAG TTT GAA GCA CTC GGT GAT TGC GAT GAT1363Ile Phe Val Asn Pro Leu Gln Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys Asp Asp55 60 65TAC CGC AAC TAT CCC CGC CAA CTC GAC GCC GAT TTA GCA CTG CTT GAA1411Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gln Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu Leu Glu70 75 80GAG GCA GGT GTG GAT ATT GTG TTC GCA CCC GAT GTG GAG GAA ATG TAC1459Glu Ala Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu Met Tyr85 90 95CCC GGT GGC TTG CCA CTA GTG TGG GCG CGC ACC GGT TCC ATC GGA ACA1507Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser Ile Gly Thr100 105 110AAA TTG GAG GGT GCC AGC AGG CCT GGC CAT TTC GAT GGT GTG GCT ACC1555Lys Leu Glu Gly Ala Ser Arg Pro Gly His Phe Asp Gly Val Ala Thr115 120 125 130GTG GTG GCG AAG CTG TTC AAT TTG GTG CGC CCT GAT CGT GCA TAT TTT1603Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala Tyr Phe135 140 145GGA CAA AAA GAT GCT CAG CAG GTT GCG GTG ATT CGG CGA TTG GTT GCC1651Gly Gln Lys Asp Ala Gln Gln Val Ala Val Ile Arg Arg Leu Val Ala150 155 160GAT CTA GAC ATT CCC GTG GAG ATT CGT CCC GTT CCG ATT ATT CGT GGC1699Asp Leu Asp Ile Pro Val Glu Ile Arg Pro Val Pro Ile Ile Arg Gly165 170 175GCC GAT GGC TTA GCC GAA TCC AGC CGC AAT CAA CGT CTT TCT GCG GAT1747Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gln Arg Leu Ser Ala Asp180 185 190CAG CGA GCG CAA GCT CTG GTG CTG CCG CAG GTG TTG AGT GGG TTG CAG1795Gln Arg Ala Gln Ala Leu Val Leu Pro Gln Val Leu Ser Gly Leu Gln195 200 205 210CGT CGA AAA GCA GCT GGT GAA GCG CTA GAT ATC CAA GGT GCG CGC GAC1843Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp Ile Gln Gly Ala Arg Asp215 220 225ACC TTG GCC AGC GCC GAC GGC GTG CGC TTG GAT CAC CTG GAA ATT GTC1891Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu Ile Val230 235 240GAT CCA GCC ACC CTC GAA CCA TTA GAA ATC GAC GGC CTG CTC ACC CAA1939Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu Ile Asp Gly Leu Leu Thr Gln245 250 255CCA GCG TTG GTG GTC GGC GCG ATT TTC GTG GGG CCG GTG CGG TTG ATC 1987Pro Ala Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Val Gly Pro Val Arg Leu Ile260 265 270GAC AAT ATC GAG CTC TAGTACCAAC CCTGCGTTGC AGCACGCAGC TTCGCATAAC 2042Asp Asn Ile Glu Leu275GCGTGCTCAG CTCAGTGTTT TTAGGTGCGC GGTGCGGATC GGAACCGGGA GTTGGCCACT2102GCGGTGGCGT GGCCTCACCC GACAGCGCCC ATGCCGCCTG ACGAGCTGCA CCCAACGCCA2162CA 2164(2)關於SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度271個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線型(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Pro Met Ser Gly Ile Asp Ala Lys Lys Ile Arg Thr Arg His Phe1 5 10 15Arg Glu Ala Lys Val Asn Gly Gln Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr20 25 30Asp Ala Leu Ser Ala Arg Ile Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu35 40 45Leu Val Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr50 55 60Leu Ser Ile Thr Leu Asp Glu Met Ile Val Leu Ala Lys Ala Val Thr65 70 75 80Ile Ala Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr85 90 95Tyr Glu Val Ser Pro Asn Gln Ala Val Glu Ser Ala Ile Arg Val Met100 105 110Arg Glu Thr Gly Ala Ala Ala Val Lys Ile Glu Gly Gly Val Glu Ile115 120 125Ala Gln Thr Ile Arg Arg Ile Val Asp Ala Gly Ile Pro Val Val Gly130 135 140His Ile Gly Tyr Thr Pro Gln Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val145 150 155 160Val Gln Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ala Arg165 170 175Ala Leu Glu Gln Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro180 185 190Ala Glu Ala Ala Arg Glu Val Thr Glu Asp Leu Ser Ile Thr Thr Ile195 200 205Gly Ile Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gln Val Leu Val Trp Gln210 215 220Asp Ala Phe Gly Leu Asn Arg Gly Lys Lys Pro Arg Phe Val Arg Glu225 230 235 240Tyr Ala Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gln Ala Tyr Ile245 250 255Ala Asp Ile His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser Phe260 265 270(2)關於SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度279個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線型(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Gln Val Ala Thr Thr Lys Gln Ala Leu Ile Asp Ala Leu Leu His1 5 10 15His Lys Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly20 25 30His Ala Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val35 40 45Ala Ser Ile Phe Val Asn Pro Leu Gln Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys50 55 60Asp Asp Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gln Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu65 70 75 80Leu Glu Glu Ala Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu85 90 95Met Tyr Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser Ile100 105 110Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ala Ser Arg Pro Gly His Phe Asp Gly Val115 120 125Ala Thr Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala130 135 140Tyr Phe Gly Gln Lys Asp Ala Gln Gln Val Ala Val Ile Arg Arg Leu145 150 155 160Val Ala Asp Leu Asp Ile Pro Val Glu Ile Arg Pro Val Pro Ile Ile165 170 175Arg Gly Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gln Arg Leu Ser180 185 190Ala Asp Gln Arg Ala Gln Ala Leu Val Leu Pro Gln Val Leu Ser Gly195 200 205Leu Gln Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp Ile Gln Gly Ala210 215 220Arg Asp Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu225 230 235 240Ile Val Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu Ile Asp Gly Leu Leu245 250 255Thr Gln Pro Ala Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Val Gly Pro Val Arg260 265 270Leu Ile Asp Asn Ile Glu Leu27權利要求
1.一種重組DNA，能在棒桿菌和埃希氏菌屬微生物中複製並含有編碼天冬氨酸-1-脫羧酶的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的可複製DNA，其核苷酸序列編碼來自棒桿菌的panD並且其位置在圖1中表示。
3.根據權利要求2所述的可複製DNA，包括(i)SEQ ID No.1中所示的編碼panD的核苷酸序列，或者(ii)在遺傳密碼簡併性區域內對應於序列(i)的序列，或者(iii)與互補於序列(i)或(ii)的序列雜交的序列，以及選擇性地(iv)(i)中的中性意義突變。
4.通過導入根據權利要求1-3中的任意一項所述的可複製DNA轉化的微生物，尤其棒桿菌或埃希氏菌屬微生物。
5.質粒載體pND-D2，以圖2中所示的限制性圖譜為特徵並作為穀氨酸棒桿菌ATCC13032/pND-D2以保藏號DSM12438保藏。
6.質粒載體pND-DBC2，以圖4中所示的限制性圖譜為特徵並作為穀氨酸棒桿菌ATCC13032/pND-DBC2以保藏號DSM12437保藏。
7.製備D-泛酸的方法，其中panD基因和選擇性地其它編碼天冬氨酸-L-脫羧酶的核苷酸序列在微生物中擴增(過量表達)，並且將這些微生物用於發酵。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於通過用帶有這些基因或核苷酸序列的質粒載體轉化微生物來增加基因或核苷酸序列的拷貝數從而實現擴增或通過染色體擴增來實現擴增。
9.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於通過突變位於結構基因上遊的啟動子和調控區域來實現過量表達。
10.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於通過在結構基因上遊摻入表達盒來實現過量表達。
11.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於通過延長相應mRNA的壽命和/或防止相應酶蛋白的降解來增強panD基因在微生物中的表達。
12.根據權利要求8-11所述的方法，其特徵在於panD基因在帶有其它代謝物或抗代謝物抗性基因突變的微生物中過量表達。
13.根據權利要求8-12所述的方法，其特徵在於通過在改良的適當培養基中發酵微生物或改變發酵技術來實現過量表達。
14.根據權利要求8-13所述的方法，其特徵在於使用其中減弱泛酸鹽(泛酸)形成的代謝途徑至少部分被關閉的微生物。
15.根據權利要求8-14所述的方法，其特徵在於使用微生物，其中除了panD基因，泛酸合成代謝途徑的其它基因也單獨或全部地得到擴增(過量表達)。
16.根據權利要求15所述的方法，其特徵在於使用微生物，其中除了panD基因，編碼酮泛解酸羥甲基轉移酶(E.C.4.1.2.12)和泛酸合成酶(E.C.6.3.2.1)的一種或多種基因、尤其是源於棒桿菌的那些基因得到擴增(過量表達)。
17.根據權利要求15和16所述的方法，其特徵在於使用以單獨含有上述基因的各種相容性質粒載體轉化的微生物。
18.根據權利要求15和16所述的方法，其特徵在於使用以質粒載體轉化的菌株，而且質粒載體含有一種或多種上述基因包括panD基因，其中基因連續排列並在共同啟動子的控制之下或彼此分開在不同啟動子的控制之下。
19.根據權利要求17所述的方法，其特徵在於使用以質粒載體pND-D2轉化的微生物。
20.根據權利要求17所述的方法，其特徵在於使用以質粒載體pND-DBC2轉化的微生物。
21.製備泛酸的方法，其特徵在於進行下列步驟a)根據一個或多個前述權利要求所述的微生物的發酵，其中至少panD基因得到擴增(過量表達)，選擇性地與panB和/或panC基因結合。b)泛酸在培養基或微生物細胞中的富集，和c)泛酸的分離
22.根據權利要求21所述的方法，其特徵在於過量表達的基因來自棒桿菌屬微生物。
23.根據權利要求21或22所述的方法，其特徵在於在步驟a)中加入從包括天冬氨酸、β-丙氨酸、酮泛解酸、酮異戊酸和泛解酸的群體中選出的泛酸前體。
24.根據一個或多個前述權利要求所述的方法，其特徵在於使用埃希氏菌或棒桿菌屬微生物。
全文摘要
本發明涉及通過微生物的發酵製備D－泛酸的方法,其中至少panD得到擴增(過量表達),選擇性地與panB和panC基因結合;並且泛酸在培養基或微生物細胞中富集。
文檔編號C12N1/21GK1256314SQ99120980
公開日2000年6月14日 申請日期1999年12月1日 優先權日1998年12月1日
發明者N·杜施, J·卡林諾夫斯基, A·普勒 申請人:底古薩－胡爾斯股份公司