使用熱休克蛋白抑制劑來減少毛髮生長的製作方法
2023-08-13 05:58:51
專利名稱：使用熱休克蛋白抑制劑來減少毛髮生長的製作方法
技術領域：
本發明涉及減少哺乳動物的毛髮生長，尤其可用於美容目的。
哺乳動物毛髮的一項主要功能是提供環境保護。然而對於人，該項功能已經基本上喪失，人的毛髮被保留或者從身體不同部位去除從根本上講是出於美容目的。例如，通常優選保留頭皮上的毛髮而不是臉上的毛髮。
已使用各種方法來除掉不需要的毛髮，包括剃鬚、電解、脫毛膏或脫毛劑、上蠟、拔毛和抗雄激素治療劑。這些常規的方法通常伴隨著許多缺點。例如，剃鬚可導致刮痕和傷口並且可能產生毛髮再生速度增加的感覺。刮臉也可能遺留令人不悅的硬茬。另一方面，電解可保持處理過的地方較長時間沒有毛髮，但是花費昂貴、過程痛苦並且有時會留下疤痕。脫毛膏雖然非常有效，但是由於它們潛在的高刺激性，典型不推薦頻繁使用。上蠟和拔毛可導致疼痛、不適並且很難除掉短的毛髮。最後，用來治療女性多毛症的抗雄激素物質可能產生有害的副作用。
據先前已公開的，將某些酶的抑制劑塗敷到所述皮膚上可改變毛髮生長的速度和特徵。這些抑制劑包括5-α還原酶、鳥氨酸脫羧酶、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶、γ-穀氨醯轉肽酶和轉穀氨醯胺酶。例如，參見Breuer等人的美國專利4,885,289；Shander的美國專利4,720,489；Ahluwalia的美國專利5,095,007；Ahluwalia等人的美國專利5,096,911；和Shander等人的美國專利5,132,293。
已知熱休克蛋白(HSP)是進化保留蛋白的總科，它們由不同分子量的亞科組成。HSP的實施例包括HSP-27、HSP-70和HSP-90。HSP履行多種細胞內功能。它們也被稱為「應力蛋白」，因為它們是在各種應力的刺激下合成的，所述刺激包括毒害細胞藥物、受熱和放射線照射。HSP也可以在生理條件下起到維護細胞動態平衡的作用。通過熱休克特殊的轉錄因子，HSP在響應元素的轉錄活化作用下合成產生，抑制熱休克特殊的轉錄因子導致HSP含量的降低。HSP作為與當事蛋白質相結合的伴護分子來促進它們進行適當的摺疊，協助蛋白質運輸和在細胞內隔間中的排列，並且控制它們的活性構象/天然構象之間的轉化。HSP中的底物是許多酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸和細胞周期蛋白依賴性激酶。除此之外，HSP-90通過激素受體包含在調製信號中。細胞增殖和細胞分化的調節需要HSP與它們所依賴的蛋白質之間的交互作用。除了細胞周期調節以外，HSP還可保護細胞以防被稱為細胞凋亡的細胞程序性死亡，這是由各種刺激引起的。HSP擁有基本的抑制細胞凋亡的性能。它們可在不同細胞內含量的情況下控制細胞程序性死亡。HSP的過度表達可以保護細胞以防由Fas、TNF、神經醯氨和細胞毒害藥物引起的細胞凋亡。據說，HSP涉及依靠線粒體的細胞凋亡通道，防止胱冬肽酶的活化。HSP70和HSP-90與突變體p53相互作用，導致野生型p53的減少，其是細胞周期中止/細胞凋亡的重要調節者。
發明概述一方面，本發明提供了一種減少哺乳動物(優選人類)不需要毛髮生長的方法(典型為一種美容方法)，該方法通過把有效量的熱休克蛋白(HSP)抑制劑塗敷到所述皮膚上以減少毛髮的生長。從美容的觀點來看，不需要的毛髮生長可能是令人不悅的，或者可能由於例如一種疾病或者反常現象(如多毛症)而產生的。
HSP抑制劑包括通過與所述HSP強烈的相互作用能特定抑制一種或多種毛囊中HSP活性的化合物；可減少毛囊中一種或多種HSP含量和/或表達的化合物；和/或可減少毛囊中一種或多種HSP mRNA表達的化合物。「強烈的相互作用」是指所述化合物結合或者優選結合在所述HSP上。
典型地，在實踐前述方法時，所述抑制劑將和一種皮膚病學或美容上可接受的載體一起被包含在一個局部組合物中。因此，本發明也涉及包含一種皮膚病學或美容上可接受的載體和一種HSP的局部組合物。
除此以外，本發明還涉及使用一種HSP抑制劑來製備一種治療性局部組合物以減少毛髮生長。
具體的化合物包括化合物本身和所述化合物在藥理學上可接受的鹽。
通過閱讀發明詳述和所述的權利要求，本發明其它的特點和優點是顯而易見的。
發明詳述優選的組合物包括位於美容上和/或皮膚病學上可接受載體中的HSP抑制劑。所述組合物可以是固體、半固體、或液體。例如，所述組合物可以是一種美容或治療皮膚病的產品，所述產品可以為例如油膏、洗劑、泡沫、霜膏、凝膠或者溶液形式。所述組合物也可以為剃鬚製劑形式或須後水形式。所述載體本身可以是惰性的，或者它本身能擁有美容的、生理的和/或藥物的有益效果。
已知HSP抑制劑的實施例提供在表1中。
表1
所述組合物可包括不止一種HSP抑制劑。除此以外，所述組合物還可包括一種或多種其它類型的毛髮生長減少劑，例如在美國專利4,885,289、美國專利4,720,489、美國專利5,132,293、美國專利5,096,911、美國專利5,095,007、美國專利5,143,925、美國專利5,328,686、美國專利5,440,090、美國專利5,364,885、美國專利5,411,991、美國專利5,648,394、美國專利5,468,476、美國專利5,475,763、美國專利5,554,608、美國專利5,674,477、美國專利5,728,736、美國專利5,652,273、WO 94/27586、WO 94/27563和WO98/03149中所描述的那些，這些專利都引入本文以供參考。
所述HSP抑制劑在所述組合物中的濃度可以在一個很寬的範圍內變動，最大為飽和溶液，按重量計優選為0.1％至30％或者甚至更多；當每單位面積皮膚所用的抑制劑量增加時，毛髮生長的減少量也增加。所述最大有效施用量只為所述抑制劑滲透皮膚的速度所限制。有效量範圍為例如每平方釐米皮膚10微克至3000微克或者更多。
所述載體可以是惰性的，或者本身具有美容的、生理的和/或藥物有益效果。載體可以與液體或者固體潤膚劑、溶劑、增稠劑、溼潤劑和/或粉劑配製在一起。潤膚劑包括硬脂醇、貂油、鯨蠟醇、油醇、月桂酸異丙酯、聚乙二醇、石油凝膠、棕櫚酸、油酸和肉豆蔻酸十四烷基酯。溶劑包括乙醇、異丙醇、丙酮、二甘醇、乙二醇、二甲基亞碸和二甲基甲醯胺。
所述組合物可任選地包括能增強抑制劑對皮膚滲透性和/或對作用位點滲透性的組分。滲透增強劑的實施例包括，尿素、聚氧乙烯醚(例如，Brij-30和月桂基聚氧乙烯醚-4)、3-羥基-3，7，11-三甲基-1，6，10-十二碳三烯、萜烯、順式脂肪酸(例如，油酸、棕櫚油酸)、丙酮、月桂氮酮、二甲基亞碸、2-吡咯烷酮、油醇、甘油基-3-硬脂酸酯、丙-2-醇、肉豆蔻酸異丙酯、膽固醇和丙二醇。滲透增強劑添加的濃度為例如按重量計0.1％至20％或0.5％至5％。
也可配製所述組合物以提供在皮膚內部或者表面的儲集層，其可提供抑制劑持續緩慢地釋放。也可配製所述組合物以使之從皮膚緩慢蒸發，使抑制劑有更多時間滲透入皮膚中。
通過在一個混合容器A中與水以及所有水溶性組分混合在一起，可製得包含HSP抑制劑的霜膏基局部組合物。在所需範圍內調節pH值，從約3.5至8.0。為了實現成分的完全溶解，可將容器的溫度升至最高45℃。PH值和溫度的選擇將依賴於HSP抑制劑的穩定性。在另一個容器(B)中，將除防腐劑和芳香劑組分以外的油溶組分混合在一起，並且加熱到最高70℃，以熔融和混合所述組分。在激烈攪拌下，將B容器中的熱內容物倒入到水相中(容器A)。持續攪拌約20分鐘。在約40℃的溫度下加入所述防腐劑組分。持續攪拌直到溫度達到約25℃，並形成一種柔軟的霜膏，其具有的粘度為8至12Pa/s(8,000至12,000cps)或者為所需粘度。在約25℃至30℃下加入芳香劑組分，同時依舊攪拌所述內容物，並且粘度還沒有達到所需範圍。如果需要增加所得乳液的粘度，可以使用一種常規的勻化器進行剪切，例如使用具有方孔高陡屏的Silverson L4R勻化器。可以通過在上述製劑製備過程中或在製劑(載體)製備結束後將活性劑加入到水相中，來製備局部組合物。所述活性的試劑也可以在載體製備的任何步驟中添加。所述霜膏製劑的組分在下面的實施例描述。
實施例#1(霜膏)
a例如，HSP抑制劑可從表1提供的目錄中選擇。
bPolyquartinium-51(Collaborative Labs，NY)。
c甘油、水、PCA鈉、尿素、海藻糖、polyqauternium-51和透明質酸鈉(Collaborative Labs，NY)。
實施例#2(霜膏)
a例如，HSP抑制劑可從表1提供的目錄中選擇。
實施例#3(霜膏)
a例如，HSP抑制劑可從表1提供的目錄中選擇。
實施例#4(霜膏)
將HSP抑制劑加入到實施例4的製劑中，並且混合直至溶解。HSP抑制劑可以從例如表1提供的目錄中選擇。
實施例#5(霜膏)
將HSP抑制劑加入到實施例4的製劑中，並且混合直至溶解。HSP抑制劑可以從例如表1提供的目錄中選擇。
實施例#6(霜膏)
將HSP抑制劑加入到實施例4的製劑中，並且混合直至溶解。HSP抑制劑可以從例如表1提供的目錄中選擇。
實施例#7(霜膏)
將HSP抑制劑加入到實施例4的製劑中，並且混合直至溶解。HSP抑制劑可以從例如表1提供的目錄中選擇。
實施例#8(霜膏)
將HSP抑制劑加入到實施例4的製劑中，並且混合直至溶解。HSP抑制劑可以從例如表-1提供的目錄中選擇。
通過在一個混合容器中混合製劑組分，製備包含HSP抑制劑的水醇製劑。調節所述製劑的pH值至3.5至8.0範圍內的所需值。所述pH值也可調節到使製劑組分完全溶解。除此以外，根據活性物質的穩定性，可以加熱到最高45℃，或甚至最高70℃，以實現所述製劑成分的溶解。一些水醇製劑列於下文中。
實施例#9(水醇製劑)
aHSP抑制劑可以從例如表1提供的目錄中選擇。
b辛酸/癸酸甘油三酯(Abitec Corp.，OH)。
實施例#10(水醇製劑)
aHSP抑制劑可以從例如表1提供的目錄中選擇。
實施例#11(水醇製劑)
將HSP抑制劑加入到製劑中，並且混合直至溶解。HSP抑制劑可以從例如表1提供的目錄中選擇。
所述組合物應局部施用於身體上需要減少毛髮生長的所選區域。例如，所述組合物可被施用於面部，尤其是面部長鬍子的區域，即面頰、頸部、上唇緣和下巴。所述組合物也可用作其它毛髮除去方法的助劑，包括刮臉、上蠟、機械脫毛、化學脫毛、電解和雷射輔助脫毛。
所述組合物也可以施用在腿、臂、軀幹或者腋窩處。所述組合物尤其適用於減少患多毛症的女子身上不需要的毛髮生長，或者其它情況。對人而言，所述組合物應該一天施用一次或兩次，或甚至更加頻繁，從而獲得可察覺的毛髮生長減少。最初在使用24小時或48小時後(例如，在正常的剃毛間隔之內)，就可感覺到毛髮生長減少，或者可持續至例如三個月。例如，如果毛髮生長速度減慢，除毛需求減少，所述受試者在處理過的位置能感覺到毛髮減少，或者定量地來說，如果除去毛髮的重量減少了(即，毛髮質量)，則可證明毛髮生長的減少。
人類毛囊生長檢測分析法可從整形外科醫生那裡獲得作為整容術過程副產物的人類皮膚。所述皮膚樣本通常由取自面部的有毛髮區域和無毛髮區域構成。毛髮除去以後，所述皮膚立刻被放在包含抗生素的Williams E介質中並且保持冷凍。所述Williams E介質可以商購獲得(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)，並且配以必需營養素，以保持毛囊在體外環境中的生命活性。
使用解剖刀和鐘錶匠用的鑷子，在解剖顯微鏡下使生長相中(乙氧基苯醯胺基喹啉)的人類毛囊與整容組織分離。所述皮膚被切成薄薄的幾條，暴露出2至3排易於切割的毛囊。將毛囊放入0.5ml的Williams E介質中，向所述介質中補充加2mM L-穀氨醯胺、10μg/ml胰島素、10ng/ml氫化可的松、100單位青黴素、0.1mg/ml鏈黴素和0.25μg/ml兩性黴素B。在37℃、含有5％CO2和95％空氣的氣氛下，在24孔培養板(1個毛囊/孔)上培養毛囊。在20倍放大率的解剖顯微鏡下，拍攝24孔培養板中的毛囊圖像。在第0天(即毛囊被培養的那天)測量毛囊長度，並且在6至7天時再次測量。在該體系中，毛囊似乎完全分化成毛髮纖維，並且以與人身上毛髮生長相同的速度增加長度，大約0.3mm/天。為了測試熱休克蛋白抑制劑，所述抑制劑或者抗HSP抗體從第0天開始就加入到培養介質中，並且在整個實驗過程中都保留在該介質中。
免疫組織化學檢測分析法經由毛囊或者快速冷凍皮膚活組織切片，製備八微米低溫組織切片，並且在-20℃的丙酮中放置10分鐘。採用酪醯胺放大法，進行HSP-27、HSP70或HSP-90免疫檢驗。簡而言之，在阻斷內源性過氧化物酶和非特異抗生物素蛋白/生物素結合之後(抗生物素蛋白/生物素阻斷套盒，Vector實驗室)，在TNB緩衝液(0.1M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液、pH 7.5、0.15M NaCl和0.5％阻斷試劑，Perkin Elmer，Boston，MA)中培養切片30分鐘。然後，整夜進行小鼠單克隆抗體拮抗人類HSP-27、HSP70(Calbiochem)或者兔子多克隆抗體拮抗人類HSP-90(Santa Cruz Biotechnology)的實驗，(分別為1∶500和1∶1000)，隨後施用生物素化羊抗小鼠抗血清或者羊抗兔抗血清，稀釋於TNB阻斷緩衝液中(Perkin Elmer，Boston，MA，1∶200，30分鐘)。然後，在鏈黴親和素-辣根過氧化物酶中培養切片(在TNB中，1∶100，30分鐘)。用TNT緩衝液(0.1M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液、pH 7.6、0.15M NaCl、0.05％吐溫)洗滌三次，然後施用TRITC-酪醯胺(在放大稀釋劑中，1∶50，PerkinElmer，Boston，MA)10分鐘。接下來，用Hoechst 33342進行切片復染色，以鑑定細胞核，並且使用VectaShield(VectorLaboratories)製作成標本。
所有切片均在Olympus BX 60螢光顯微鏡下觀察，並使用數字圖象分析系統(CoolSnapTM冷卻CD照相機，Alpha Innotech)提供文檔化照片。
結果使用免疫組織化學方法證明了HSP-27、HSP-70和HSP-90存在於體外人類毛囊中。HSP-27和HSP-70存在於毛囊上皮細胞以及隔室輪廓分明的間葉細胞中，例如外根鞘和毛囊的真皮乳頭細胞中。另一方面，HSP-90雖然更廣泛地出現在毛囊上皮細胞中，但卻不存在於源自間葉細胞的真皮乳頭細胞中。該免疫組織化學方法可以用來選擇一種可特別降低HSP-27、HSP-70和HSP-90含量和/或表達的試劑。
其它免疫組織化學檢測分析法可用來確定HSP表達的變化以及結合HSP的試劑的特異性。為了檢驗HSP在人類毛囊發展中所起的作用，通過向培養介質中添加抗HSP-27的抗體，來中和內源性HSP-27。在含有濃度為1mg/ml抗HSP-27抗體的補給性William介質中，培養分離的人類毛囊。四十九小時以後，進行HSP-27的免疫組織化學檢測分析，以確定HSP-27在毛囊中的表達。對照毛囊的分析顯示，HSP-27在毛囊上皮組織細胞和間葉細胞中有很強的表達。與此相反，用抗HSP-27抗體處理過的毛囊表現出對HSP-27在近基毛囊隔室中的表達的完全抑制。末端外根鞘中的分離細胞仍然保持HSP-27的活性。用單克隆抗HSP-27抗體處理人類毛囊的成效顯示(1)如用免疫組織化學檢測分析法所確定的，有一種有效的抗體與HSP-27蛋白相結合；(2)抗HSP-27抗體由於其與蛋白質強烈的結合作用抑制了內源性HSP-27的活性和表達；(3)毛髮生長中期發生率的增加(用抗HSP-27抗體處理過的毛囊為67％，相比之下對照物為16％，數據示於表2中)；
(4)毛髮纖維生長顯著減少(數據示於表2中)；和(5)選擇附加HSP抑制劑的方法。
表2人類毛髮生長的減少和通過用抗HSP-27抗體處理來誘導毛髮生長中期
a通過從第5天的總毛囊長度減去第0天總毛囊長度來確定毛髮生長。
抑制率％＝100-(抑制劑處理過的毛囊的毛髮生長/對照物的毛髮生長)×100。
毛髮生長中期％＝(毛髮生長中期毛囊數/總的毛囊數)×100。
由HSP 90特異抑制劑格爾德黴素，可以看出人類毛囊生長減少量與劑量的依賴關係(表3)。一種強效的、毛髮生長減少量超過50％的亞微摩爾劑量的抑制劑證明了毛髮生長對HSP最佳功能活性的依賴性。
表3由HSP-90抑制劑引起的人類毛髮生長的減少
a通過從第6天的總毛囊長度減去第0天總毛囊長度來確定毛髮生長。
抑制率％＝100-(抑制劑處理過的毛囊的毛髮生長/對照物的毛髮生長)×100。
表4顯示了由KNK 437(一種亞苄基內醯胺化合物)引起的人類毛囊生長減少量與劑量的依賴關係。已知，化合物KNK 437可以在mRNA合成水平下抑制HSP的誘導，並從而抑制表達。
表4由KNK 437引起的人類毛髮生長的減少
a通過從第6天的總毛囊長度減去第0天總毛囊長度來確定毛髮生長。
減少率％＝100-(抑制劑處理的毛囊的毛髮生長/對照物的毛髮生長)×100。
權利要求
1.一種減少哺乳動物毛髮生長的方法，所述方法包括選擇希望減少毛髮生長的皮膚區域；和向所述皮膚區域施用皮膚病學可接受的組合物，所述組合物包含有效量的熱休克蛋白抑制劑以減少毛髮生長。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑是格爾德黴素。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑是17-烯丙基氨基，17-脫甲氧基格爾德黴素。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑是KF25706。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑是KF58333。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑是KF58332。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑是O-氨基甲醯基甲基肟。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述HSP抑制劑是格爾德黴素苯並-1，3-間二氧雜環戊烯。
9.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑是KNF437。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑是KNK423。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑是能特定抑制一種或多種毛囊熱休克蛋白活性的化合物。
12.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑是能減少毛囊內一種或多種熱休克蛋白含量和/或表達的化合物。
13.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑是能減少毛囊內一種或多種熱休克蛋白mRNA表達的化合物。
14.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑在所述組合物中的濃度為0.1％至30％。
15.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑在所述皮膚上的塗敷量為每平方釐米皮膚10至3000微克所述抑制劑。
16.如權利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物是人類。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述皮膚區域是在人類的面部上。
18.如權利要求16所述的方法，其中在剃鬚的同時，將所述組合物施用於所述皮膚區域。
19.如權利要求16所述的方法，其中所述皮膚區域是在所述人類的腿上。
20.如權利要求16所述的方法，其中所述皮膚區域是在所述人類的手臂上。
21.如權利要求16所述的方法，其中所述皮膚區域是在所述人類的腋窩內。
22.如權利要求16所述的方法，其中所述皮膚區域是在所述人類的軀幹上。
23.如權利要求1所述的方法，其中所述組合物施用於患有多毛症的婦女的皮膚區域。
24.如權利要求1所述的方法，其中所述毛髮生長包括雄性激素刺激的毛髮生長。
25.如權利要求1所述的方法，其中所述組合物還包含造成毛髮生長減少的第二組分。
全文摘要
通過局部施用包含熱休克蛋白抑制劑的組合物，減少了哺乳動物的毛髮生長。
文檔編號A61K31/365GK1946372SQ200580013402
公開日2007年4月11日 申請日期2005年4月25日 優先權日2004年4月27日
發明者N·伯奇卡勒瓦, G·S·阿魯瓦利亞, D·山德 申請人:吉萊特公司