多核苷酸引物的製作方法
2023-08-12 23:19:41 1
多核苷酸引物的製作方法
【專利摘要】含有以下引物序列之一或其互補序列的至少最後6個核苷酸的多核苷酸：SEQ.ID?NO：3-16,18,20-33,35或37-39。
【專利說明】多核苷酸引物
[0001 ] 本申請是國際申請PCT/GB2008/003306，國際申請日2008年9月29日，中國國家階段申請號200880110038.7的發明專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及多核苷酸、含有多核苷酸的試劑盒，以及在基因中檢測突變存在與否的方法。
【背景技術】
[0003]磷酯醯肌醇3-激酶(PI3K)是參與細胞信號傳遞的一大類脂質激酶。PI3K-AKT途徑在許多類腫瘤中被激活，導致細胞生長、增殖和存活異常(補充的I篇近期綜述)。近來，在人癌症中鑑定出了 IA型PI3K(PI3KCA)催化亞基中的突變[I]。這些突變在致癌作用中的確切作用仍然並沒有被明確確定，但隨著許多靶向PI3K抑制劑的開發，突變檢測對於患者篩選來說變得日益重要。這些突變的檢測中的技術難題來自於可能只包含少量突變序列的腫瘤活組織切片的限制。另外，從石蠟包埋組織提取的DNA常常已被降解且質量很差。測序檢測所需要的突變DNA的最低水平是15-25%，因此對於開發能在異源樣品中檢測少量突變的等位基因的靈敏的檢測法以及進行所述檢測法所需的產品具有迫切的需求。
[0004]本發明試圖滿足該需求。
【發明內容】
[0005]本發明提供了 對腫瘤引起的PIK3CA突變的靈敏耐用的檢測法。
[0006]根據本發明的一個方面，提供了一種多核苷酸，其含有下列引物序列之一的至少最後6個核苷酸:SEQ.1D N0.3-16，18，20-33，35或37-39，或其互補序列。也就是說，所述多核苷酸含有下列引物序列之一 3』末端的至少6個核苷酸:SEQ.1D N0.3-16, 18，20-33，35或37-39，或其互補序列。
[0007]優選地，所述多核苷酸包含下列引物序列之一、或其互補序列、或與其具有80%、90%, 95%或99%序列一致性的序列3』末端8、10、12、14、17、18或20個核苷酸或整個序列的至少 75% 的核苷酸:SEQ ID N0.3-16、18、20-33、35 或 37-39。
[0008]在本發明的一些實施方式中，提供了一種多核苷酸，其包含以下引物序列之一 3』末端10個核苷酸的至少75%的核苷酸:SEQ.1D N0.3-16、18、20_33、35或37-39，或其互補序列。
[0009]通常，所述多核苷酸短於100個核苷酸，優選短於80個核苷酸，更優選短於60個核苷酸，更優選短於40個核苷酸，更優選短於30個核苷酸。
[0010]優選地，所述多核苷酸還含有淬滅基團和螢光團。
[0011]通常，所述淬滅基團和螢光團由含有第一和第二區域的核苷酸尾序列隔開，其中所述第一區域的核苷酸與第二區域的核苷酸互補但呈反向，從而所述第一區域與第二區域的雜交導致所述淬滅基團與所述螢光團足夠靠近，以淬滅所述螢光團。[0012]優選地，所述尾序列還含有第三區域，其具有與PIK3CA基因的一個區域互補的序列。
[0013]優選地，所述多核苷酸含有SEQ ID NO: 18的3』末端的至少6個核苷酸，並且所述尾序列含有SEQ.1D N0.17。
[0014]或者，所述多核苷酸含有SEQ ID NO:35的3』末端至少最後的核苷酸，並且所述尾序列含有SEQ.1D N0.34。
[0015]或者，所述多核苷酸含有SEQ ID NO:39的3』末端至少最後的核苷酸，並且所述尾序列含有SEQ.1D N0.38。
[0016]通常,所述淬滅基團含有Dabcyl。
[0017]優選地,所述突光團含有Hex, Fam或Rox。
[0018]根據本發明的另一個方面，提供了一種含有本發明的至少兩種多核苷酸的試劑
盒。
[0019]優選地，所述試劑盒含有包含SEQ ID N0.18的多核苷酸和包含SEQ ID N0.3-16之一的多核苷酸；或含有包含SEQ ID N0.35的多核苷酸和包含SEQ ID N0.20-33之一的多核苷酸；或含有包含SEQ ID N0.39的多核苷酸和包含SEQ ID N0.37的多核苷酸。
[0020]通常，所述試劑盒還含有核苷三磷酸，聚合酶和/或緩衝液。
[0021]根據本發明的另一個方面，提供了將本發明所述的多核苷酸或試劑盒，或含有SEQ.1D N0.3-16，18，20-33或35或其互補序列3』末端6個核苷酸中的4或5個的多核苷酸用於檢測含有PIK3CA基因的至少一個片段的核酸樣品中的突變的用途。
[0022]優選地，所述核酸樣品中的PIK3CA基因所述片段長至少10個核苷酸，優選長20個核苷酸，更優選長30個核苷酸，和更優選長40個核苷酸。
[0023]根據本發明的另一個方面，提供了一種檢測PIK3CA基因中突變存在與否的方法，該方法包括以下步驟:
[0024]a)混合含有PIK3CA基因的至少一個片段的核酸樣品和一條多核苷酸，其含有下列引物序列之一或其互補序列3』末端至少6個核苷酸:SEQ ID N0.3-16或20-33 ;和
[0025]b)檢測所述多核苷酸與所述核酸樣品的雜交，其中雜交表示突變的存在。
[0026]通常，所述多核苷酸含有下列引物序列之一:SEQ ID NO:3_16或20-33。
[0027]優選地，該方法還在步驟a)前包括以下步驟:用熱循環核酸擴增，優選PCR擴增PIK3CA基因所述片段的拷貝數。
[0028]優選地，步驟b)包括用所述多核苷酸作為第一引物進行DNA聚合，並檢測聚合的延伸產物。
[0029]通常，步驟b)包括以下步驟:將所述核酸樣品和多核苷酸與對應於所述多核苷酸互補區域下遊的PIK3CA序列所述片段的一個區域的第二引物混合，並對該混合物進行PCR。
[0030]優選地，所述第二引物包含:SEQ.1D N0.18，並且所述多核苷酸包含SEQ.1DN0S.3-16的3』末端6個核苷酸中的至少4或5個核苷酸；或所述第二引物包含SEQ.1DN0.35，並且所述多核苷酸含有SEQ.1D N0S.20-33的3』末端6個核苷酸中的至少4或5個
核苷酸。
[0031]另外，該方法還包含以下步驟:用對照引物對所述樣品進行PCR，並比較PIK3CA基因的擴增和用所述多核苷酸和第二引物的擴增。
[0032]優選地，所述對照引物含有SEQ ID N0.37和39。
[0033]通常，所述多核苷酸含有淬滅基團和螢光團，並且其中步驟b)包括使所述混合物暴露於在不存在淬滅基團時螢光團對其響應的波長的光下，並檢測在不存在淬滅基團的情況下突光團發射波長處的光。
[0034]優選PIK3CA 基因是 GenBank 登錄號 NM_006218 版本號 NM_006218.2G1: 54792081
可獲得的序列，該序列通過參考整合在本發明中。
[0035]當說明書中提到一個參照序列「3』末端6個核苷酸中至少4或5個」時，指所述參照序列的所述6個核苷酸中的任意一個或兩個核苷酸可能缺失或被不同的核苷酸取代。當然，在一些實施方式中，該序列含有參照序列的全部6個核苷酸。
[0036]在本說明書中，「ARMS」是例如EP-A-0332435中所公開的的擴增阻滯突變系統。
[0037]當在本說明書中提到一種多核苷酸相對於參照多核苷酸的百分比時，這可以通過本領域已知的算法確定。
[0038]例如，兩條序列之間的相同性百分數可以採用默認參數用BLASTP算法2.2.2版(Altschul, Stephen F., Thomas L.Madden, Alejandro A.Schaffer, Jinghui Zhang, ZhengZhang, Webb Miller,和 David J.Lipman (1997), 「缺口 BLAST 和 PS1-BLAST:新一代蛋白質資料庫檢索程序」，核酸研究.25:3389-3402)加以確定。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039]圖1顯不了對含有突變PIK3CA基因的樣品進彳丁 Scorpions檢測和測序的結果。
[0040]發明詳述
[0041]本發明的實施方式提供了可用於在含有核酸的樣品中檢測PIK3CA基因突變的檢測法的多核苷酸引物。
[0042]在【具體實施方式】中，所述多核苷酸引物是正向和反向引物，它們與PIK3CA基因雜交，從而發生PCR擴增。因此，所述正向引物與所述反向引物相反鏈的上遊雜交，並且正向和反向引物共同確定了在PCR中擴增出的擴增子序列。選擇正向引物序列，使其不和野生型序列互補，但能與突變PIK3CA序列雜交。
[0043]為了檢測樣品中突變PIK3CA基因的存在，將引物與樣品混合。然後在樣品中加入PCR必需的試劑(合適的核苷酸三磷酸、DNA聚合酶和緩衝液)，進行PCR。如果樣品含有正向引物能與之雜交的突變序列，那麼在PCR過程中擴增出擴增子，從而表明樣品中突變序列的存在。如果樣品不含突變序列，那么正向引物與PIK3CA序列結合的效率低，因此幾乎沒有，或不存在擴增子序列的擴增。
[0044]為了檢測突變E542K，所述正向引物序列可以是SEQ ID N0.3_9之一，優選為SEQID N0.5。為了檢測突變E545K，所述正向引物序列可以是SEQ ID N0.10-16之一，優選為SEQ ID N0.14。為了檢測突變H1047R，所述正向引物序列可以是SEQ ID N0.20-26之一，優選為SEQ ID N0.21。為了檢測突變H1047L，所述正向引物序列可以是SEQ ID N0.27-33之一，優選為SEQ ID N0.28。然而，應理解正向引物的精確序列不需要與這些序列相同，只要正向引物與突變序列比與野生序列的雜交更容易。在上述序列中，引物的最後6個核苷酸(即3』末端的核苷酸)提供了結合特異性，因此這些核苷酸必需與給定序列相同。[0045]為了檢測樣品中形成的擴增子的存在，反向引物在本發明實施方式中被稱作「Scorpions」引物。Scorpions引物在W0-A-99/066071中被詳細描述，在此通過參考整合在本發明中。Scorpions引物含有與一個基因(在本發明中為PIK3CA)的第一靶序列互補的引物序列和一個尾序列，其包含與兩個互補序列側接的探針序列。在引物序列和尾序列之間提供了 DNA聚合酶封閉部分(例如六甘醇(HEG)單體)。在尾序列的一端提供了螢光團，在尾序列的另一端提供了淬滅基團。使用時，Scorpions引物的引物序列在正常方式的PCR中作為反向引物，並且因此整個Scorpions引物(包括尾序列)被摻入各擴增子。DNA聚合酶封閉部分防止尾序列複製。因此，尾序列中互相互補的序列傾向互相雜交，使螢光團和淬滅基團靠近並防止螢光團發光。然而，如果擴增子含有與所述探針序列互補的第二靶序列，所述探針序列優先與第二靶序列結合，使互補序列分開。這導致螢光團和淬滅基團在空間上分開，從而使螢光團響應不同波長的入射光而發出一定波長的光。因此，Scorpions引物能夠輕易檢測擴增子，並且避免假陽性結果(例如由引物二聚體引起的)，因為只有擴增子含有第二靶序列時才會產生信號。
[0046]所述螢光團可以是Hex(4，7，2』，4』，5』，7』 -六氯_(3』，6』 - 二特戊醯基螢光素基)-6_羧醯胺基己基]-1-0-(2_氰基乙基)_(N，N- 二異丙基)-亞磷醯胺)，Fam([(3』，6』 - 二特戊醯基螢光素基)-6-羧醯氨基己基]-1_0-(2-氰基乙基)-(N，N- 二異丙基)-亞磷醯胺)或Rox (5，6，-羧基-X-羅丹明)。所述淬滅基團可以是Dabcyl (5，- 二甲氧基三苯甲氧_5_[ (N_4』 -羧基_4_( 二甲基氨基)_偶氮苯)_氨基己基-3-丙烯亞醯胺]-2』 -脫氧尿苷-3』 - [ (2-氰基乙基)-(N, N- 二異丙基)]-亞磷醯胺)。
[0047]在本發明的實施方式中，提供了用於檢測E542K和E545K突變的Scorpions引物，其中引物序列是SEQ ID N0.18，探針序列是SEQ ID N0.17。提供了用於檢測H1047R和H1047L突變的Scorpions引物，其中引物序列是SEQ ID N0.35，探針序列是SEQ ID N0.34。
[0048]然而應理解,使 用Scorpions引物不是本發明必需的，也可使用其它檢測擴增子合成的方法，例如TaqMan?產物檢測，如專利號US-A-5487972和US-A-5210015中所述。
[0049]在一些實施方式中，還進行對照試驗，以檢測PIK3CA基因在樣品中的總濃度。這是通過用確定PIK3CA基因中另一個區域內的擴增子的對照正向和反向引物進行單獨PCR反應實現的。優選正向引物是SEQ ID N0.37，反向引物是Scorpions引物，其中引物序列是SEQ ID N0.39，探針序列是SEQ ID N0.38。然後將產生閾值數量的對照擴增子所需的PCR循環數與產生含有突變序列的擴增子閾值數的PCR循環數比較，以評估樣品中PIK3CA基因的突變拷貝的比例。該對照試驗通常與所述檢測法分開進行。
[0050]所述PCR檢測優選以多重實時PCR檢測的方式進行。
[0051]核酸測試樣品通常是血液、糞便、痰、結腸洗出液、支氣管洗出液或其它體液樣品，或從個體獲得的組織。所述個體通常是人，優選智人(Homo sapiens)。應理解,測試樣品同樣可以是對應於所述測試樣品中的序列的一個核酸序列。即，首先可以用任何常規技術，例如熱循環核酸擴增，尤其是PCR，或全基因組擴增(WGA)擴增樣品核酸中的全部或部分區域，然後用於本發明的方法。
[0052]可使用任何常用的用於聚合的酶,只要它不在任何顯著的程度上影響DNA聚合酶區分正常和突變模板序列的能力。常用的酶的例子包括沒有顯著3』 -5』外切核酸酶活性的熱穩定酶，例如Taq DNA聚合酶，尤其是「Ampli Taq Gold」?DNA聚合酶(PE AppliedBiosystems), Stoffel 片段,或其它合適的 Taq 或Tth (嗜熱棲熱菌Thermus thermophilus)DNA聚合酶的N-末端缺失修飾形式。
[0053]在本發明的其它實施方式中，提供了試劑盒，其含有本發明的一種或多種多核苷酸和進行PCR反應所需的核苷酸三磷酸、DNA聚合酶和緩衝液。優選試劑盒含有用於檢測特定突變的正向和反向引物，以及正向和反向對照引物。
實施例
[0054]材料和方法
[0055]根據PIK3CA基因(登錄號:NM_006218)中4種最常見的突變設計引物。設計ARMS引物以檢測外顯子20中的兩個突變:H1047R和H1047L;以及外顯子9中的兩個突變:E452K和E454K。對PIK3CA基因中的cDNA2450位設計對照引物。
[0056]還設計了 Scorpions。為了實現在每個反應中進行多重試驗，用不同螢光團標記三個Scorpion引物。
[0057]引物設計
[0058]針對每個靶區域設計多個特異性的ARMS引物。E542K和E545K突變的靶區域分別如下如SEQ ID N0.1和2所示(突變鹼基在括弧中顯示，其中正常形式在前)。針對所述突變的正向引物也如下所示(SEQ ID N0.3-16)。為了增強對這些反應的特異性，在接近3』_末端使用了 額外的引物錯配(在引物序列中用下劃線表示)。針對所述實驗使用了優化引物(E542K-2和E545K-4)。可與所述引物序列使用的Scorpions引物如SEQ ID N0.17和18所示。Scorpions引物和祀區域之間的對應區域用一致的高亮或下劃線標出。
[0059]外顯子9區域
[0060]AACAGAGAATCTCCATTTTAGCACTTACCTGTGACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGCTCAGTGAT TTTC/Tl AGAGAGAGGAT CTCGTGTAGAAATTGCTTTGAGC' TGTTCTTTGTCATTTTCCCTTAATTCATTGTCTCTAGCTAGTCTGTTACTCTGTAAAATAAAATAATATCTTATATA(SEQ ID N0.1)
[0061]AACAGAGAATCTCCATTTTAGCACTTACCTGTGACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTG CT(C/T).AGTGATTTCAGAGAGAGGAT CTCGTGTAGAAATTGCTTTGAGC TGTTCTTTGTCATTTTCCCTTAATTCA
TTGTCTCTAGCTAGTCTGTTACTCTGTAAAATAAAATAATATCTTATATA(SEQ ID N0.2)
[0062]
【權利要求】
1.一種檢測PIK3CA基因中突變存在與否的方法，所述方法包括以下步驟: a)混合含有PIK3CA基因的至少一個片段的核酸樣品和第一引物與第二引物，並對該混合物進行PCR ;和 b)檢測所述第一引物與所述核酸樣品的雜交，其中雜交表示突變的存在； 所述第一引物能夠與PIK3CA基因的H1047R突變序列雜交，但與野生型序列不互補，所述第一引物的3』末端最後6個核苷酸與SEQ ID N0.21的3』末端最後6個核苷酸相同； 所述第二引物在PIK3CA序列片段內的對應區域位於第一序列互補區的下遊。
2.如權利要求1所述的方法，第二引物的序列如SEQID N0.35所示。
3.一種正向引物，能夠與PIK3CA基因的H1047R突變序列雜交，但與野生型序列不互補，所述第一引物的3』末端最後6個核苷酸與SEQ ID N0.21的3』末端最後6個核苷酸相同。
4.一種試劑盒，含有至少兩條引物，其中，第一引物是正向引物，第二引物是反向引物，所述第一引物能夠與PIK3CA基因的H1047R突變序列雜交，但與野生型序列不互補，所述第一引物的3』末端最後6個核苷酸與SEQ ID N0.21的3』末端最後6個核苷酸相同； 所述第二引物在PIK3CA序列片段內的對應區域位於第一序列互補區的下遊。
5.如權利要求4所述的試劑盒，所述第二引物的序列如SEQID N0.35所示。
6.權利要求3所述正向引物或權利要求4所述試劑盒用於檢測核酸樣品中突變的用途，所述核酸樣品至少含有PIK3CA基因的片段。
【文檔編號】C12Q1/68GK103952466SQ201310752245
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2008年9月29日 優先權日:2007年9月28日
【發明者】R·寶德, J·弗格遜, P·F·帕維託, N·J·德爾威爾, D·懷特科比 申請人:凱傑曼徹斯特有限公司