用於防治心血管疾病的含有三椏烏藥提取物的組合物的製作方法

2023-08-13 00:06:46 1

專利名稱：用於防治心血管疾病的含有三椏烏藥提取物的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於防治心血管病的含有三椏烏藥(Lindera obtusiloba)的提 取物的組合物，以及功能保健食品。更具體地，本發明的特點是含有三椏烏藥的提取物作為 活性成分，所述提取物通過直接抑制NAD(P)H氧化酶抑制氧化應激，同時激活內皮型一氧 化氮合酶，從而調節血管平滑肌細胞的收縮和舒張，具有防治心血管疾病的作用。
背景技術：
根據世界衛生衛生組織的統計信息(WHO)的報告，1999年，世界範圍內心血管疾 病的死亡率為30%或更高，到2010年，在發達國家心血管疾病將成為致死率排名第一的疾 病，而在亞洲國家包括日本、韓國等，心血管疾病的增長率尤其高。人們推測這是由於冠狀 動脈疾病的危險因素增加所致，是正在到來的老齡化社會、飲食習慣的改變等因素導致的結果。內皮功能障礙是誘導範圍廣泛的心血管疾病，包括高血壓、動脈硬化、高血脂、 糖尿病、肥胖等的主要機制(Brunner H.等，J. Hypertens.，2005，23 :233_246)，在 1990 年，人們就已經發現高血壓患者的血管異常舒張(Panza JA等，New England Journal of Medicine, 323 :22_27，1990)。內皮細胞為沿著血管和淋巴管腔排列的上皮細胞，其主要功 能為生成血管舒張物質和血管舒張介質以調節血管張力和結構。心血管疾病開始時表現為內皮功能障礙並最終導致心臟和血管系統異常。心血管 疾病是心臟和血管中的一組異常的泛稱，包括但不限於，動脈硬化、高血壓、高脂血症、冠狀 動脈疾病(心臟病)、腦血管疾病(中風、老年痴呆症)，周圍性血管疾病、心律失常、心力衰 竭、充血性心臟病、心肌疾病，等等。對於導致心血管疾病的主要因素，已知的多種因素為例如遺傳因素、生活方式、以 及糖尿病併發症。從現代醫學的角度看，已知還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH) 氧化酶活性增加導致活性氧(ROS)和血管的氧化應激增加，以及內皮型一氧化氮合酶 (eNOS)減少導致一氧化氮減少為主要因素。由內皮型一氧化氮合酶生成的一氧化氮是一 種強力血管舒張因子，通過抑制血小板聚集、血管平滑肌細胞增殖、單核細胞的血管粘附， 以及動脈粥樣硬化相關蛋白的表達而在心血管系統的整體穩態調節中起到決定性作用 (Forstermann 等，Circulation, 113 1708-1714，2006)。然而，多種因子導致的負責生成 血管中活性氧的NADPH氧化酶的增加導致一氧化氮生成的減少[Gryglewski等.，Nature， 320 :454-456，1986 ；Paravicini 等，Circulation Research, 91 :54_61，2002 ；Dusting 等， Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,25 :S34-41,1998], Μ Ι3 此生成的活性氧調節粘附分子的表達[Lo等，Am. J. Physiol.，264 :L406_412，1993]，刺 激血管平滑肌細胞(VSMC)的增殖和遷移[Griendling and Ushio-Fukai, J. Lab. Clin. Med. , 132 :9-15，1998]，調節具有氧化能力的脂蛋白等等，從而導致心血管疾病[Lynch and Frei, J. Lipid Res. ,34 :1745_1753，1993]。此外，NAD (P) H氧化酶引起的血管中活性氧生 成增加，與具有動脈粥樣硬化和冠狀動脈疾病的臨床風險因素的患者的內皮一氧化氮(NO)的功能削弱有關。基本上，活性氧的產生導致血管收縮[Guzik等，Cir. Res. ,86 :E85_90， 2000]。一般來說，通過直接抑制AD(P)H氧化酶造成的活性氧減少、下遊活性氧的產 生的抑制，以及內皮型一氧化氮合酶的活性誘導被認為是心血管防治中非常重要的靶 標[Forstermann 等，Circulation, 113 :1708_1714，2006 ;Doggrell SA, Drug News Perspect. ,17(9)615-632,2004 ；Inoguchi Τ. , Curr. Drug Targets,6(4) :495_501，2005 ； Muzaffar S.等，Trends Cardiovasc Med. , 15(8) :278_282]。迄今為止，已知二亞苯基碘鐺(DPI)和4-羥基-3-甲氧基苯乙酮(夾竹桃麻素) 為抑制NAD (P) H氧化酶的物質[Holland J，等，US5902831]。然而，因為毒性和專一性問題， 這些物質尚未投入商用或臨床應用。此外，作為一氧化氮調節劑，可用的有硝普鈉和硝酸甘 油。然而，因為臨床應用中出現的抵抗和毒性問題，這些物質也僅在緊急情況下，例如心臟 病發作時使用。同時，三椏烏藥為樟科落葉灌木。它長到2_3m高，花期從3月至4月，而結實的季 節是9月。壓榨果實得到的油已被婦女們用作髮油。這種植物被稱為姜樹，因為當把葉子 或樹枝扯下來後，它聞起來有姜味，其還被稱為傻瓜山茶花(Fool' s Camellia)或矮腳楓 (Japanese spicebush)。已知三椏烏藥能有效地活化血液、肌肉的慢抽搐以及抗膿腫等， 並能治療血液外滲造成的瘀傷、腫脹和疼痛。它主要用來抵抗胃疼，也用作解熱或咳嗽藥。 私下裡，三椏烏藥的葉子和芽象茶一樣被用來衝泡並拿來用作解熱或咳嗽藥[Illustrated book of Korean Plants, by Chang-Bok Lee,1980 ；Illustrated book of Korean Folk Medicine, by Jong-Hee Park,2005, Encyclopedia of Local Medicines].在對三椏烏藥成分的研究方面，Park, Jong-Chul，等(J. Korean Soc. Food Nutr. 1996. 25(1)，p. 76-79)從葉子中分離出槲皮素，從樹枝中分離出金絲桃苷，而Kwon， Hak-Cheol，等(Archives of Pharmacal Research, 22, ρ· 417-422，1999)分離出抗葉酸 (actifolin)、pluviatiolol,5,6- 二羥基羅漢松樹脂酚、(+)_ 丁香樹脂酚，9_0_反式-阿 魏醯基-5，5- 二甲氧基落葉松樹脂醇等等。據報導，分離的各成分的功效包括抗癌作用、 消炎作用等等(Planta Medica，69，610-616，2003 ；Archives of Pharmacal Research, 22, p.417-422，1999)。然而，上述文獻未曾披露或教導三椏烏藥提取物通過抑制NADPH氧化酶而具有抑 制血管氧化應激、舒張血管以及調節血壓的作用。

發明內容
技術問題因此，本發明人使用了大量植物提取物對抑制NAD(P)H氧化酶的活性和舒張作用 進行研究，並最終確證了強烈抑制NAD(P)H氧化酶活性、減少血管的氧化應激、直接增強內 皮型一氧化氮合酶的活性、舒張血管和調節血壓的效果，從而完成了本發明。本發明的設計是為了解決例如上述的問題，本發明的目的是提供一種防治心血管 疾病的組合物，其包括三椏烏藥提取物作為活性成分。本發明的另一個目的是提供一種防治心血管疾病的功能保健食品，其包括三椏烏 藥提取物作為活性成分。
技術方案為了實現上述目的，用於防治心血管疾病的組合物具有下述特點含有三椏烏藥 的提取物作為活性成分。所述三椏烏藥的提取物優選取自樹枝、樹葉及其混合物。所述三椏烏藥的提取物優選由選自水、C1-C5低級醇及其混合物的溶劑提取得到。所述三椏烏藥的提取物優選由30_95wt%的乙醇水溶液提取得到。優選所述三椏烏藥的提取物由選自水、C1-CJS級醇及其混合物的溶劑提取，並用 丁醇再提取得到。所述三椏烏藥的提取物的特點是具有NAD (P) H氧化酶抑制活性。所述三椏烏藥的提取物的特點是具有血管舒張效用。所述三椏烏藥的提取物的特點是具有增強內皮型一氧化氮合酶活性的效用。所述三椏烏藥的提取物的特點是具有降低血壓和減少血管氧化應激的作用。所述心血管疾病可選自下組充血性心臟病、冠狀動脈疾病(心臟病)、缺血性心 髒疾病(心肌缺血)、高脂血症、動脈硬化、高血壓、低血壓、心律失常、心力衰竭、血管再狹 窄、腦血管疾病(中風、老年痴呆症)、周圍性血管疾病和代謝性疾病。同時，防治心血管疾病的功能保健食品的特點是含有三椏烏藥提取物作為活性成 分。有益效果如上所述，本發明的三椏烏藥提取物能強烈抑制作為血管病主要病因的NAD(P)H 氧化酶，同時顯示出強效的舒張血管效應，因此可用於防治心血管疾病的藥物組合物或功 能性保健食品。


圖1示出了三椏烏藥提取物對豬冠狀動脈的血管舒張作用的測定圖譜；圖2示出了三椏烏藥提取物對白色大鼠主動脈的血管舒張作用的測定圖譜；圖3示出了在三椏烏藥提取物作用下，內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和Akt蛋白的 活性水平的測定圖譜；圖4示出了三椏烏藥提取物對心率的影響水平的測定圖譜；圖5示出了在三椏烏藥提取物作用下，血管氧化應激減少水平的測定圖譜；圖6示出了三椏烏藥提取物的細胞毒水平的測定圖譜。
具體實施例方式以下將具體描述本發明的優選實施方案。下面對各種特徵術語例如具體的組成要 素進行了詳細說明，但這些只是為了更全面的理解本發明，本領域技術人員容易知道沒有 這些特徵術語也可以實施本發明。此外，在本發明的描述中，如果任何相關的已知功能或組 成的具體解釋被認為是不必要地使本發明不清楚，則這個具體的解釋應予以刪除。本發明的三椏烏藥提取物可由如下方式獲得。可使用三椏烏藥的地上部分，更具體地，是葉子和樹枝，來源形式不限，可以是從 自然界收集的植物、培育的植物、市售獲得的植物等等。提取用的溶劑選自水^1-C5低級醇及其混合物。本發明的發明人對三椏烏藥的葉子和樹枝進行了清洗以去除雜質和鹽並對其 進行乾燥。隨後，用極性溶劑例如水或C1-C5低級醇例如甲醇、乙醇或丁醇或其混合物進行 提取，混合溶劑的混合比例為約1 0.1-1 10，優選使用30-95wt%的乙醇水溶液，溶劑 的體積約為三椏烏藥樣品的5-50倍，優選10-30倍，在50-95°C下提取1小時_7天。重複 上述的提取步驟2-5次，優選3次，然後將所得產物減壓濃縮和/或凍幹，得到三椏烏藥粗 提物。在本發明的提取物中，通過下述步驟可獲得非極性溶劑可溶的提取物將前述粗 提物懸浮於蒸餾水中，隨後加入相當於懸浮液體積0. 1-100倍，優選1-5倍的非極性溶劑 例如己烷、乙酸乙酯或氯仿，提取分離1-10次，優選2-5次。此外，可再進行常規的分餾步 驟(Harborne, J. B. , Phytochemical methods :A guide to modern techniques of plant analysis,3rd Ed.，pp.6-7,1998)。更優選地，將前述步驟獲得的三椏烏藥粗提物，優選地，三椏烏藥的乙醇水溶液提 取物用有機溶劑，例如正丁醇、己烷和乙酸乙酯進行順序溶劑分提，溶劑的使用順序為溶劑 極性由低至高，優選的順序為己烷、乙酸乙酯和正丁醇，然後減壓濃縮，從而獲得己烷、乙酸 乙酯和正丁醇餾分。本發明提供防治心血管疾病的組合物，其含有由上述方法獲得的三椏烏藥粗提物 或非極性溶劑可溶的提取物作為活性成分。本發明的防治心血管疾病的組合物按重量計含有0. 1-99%上述提取物，基於該組 合物的總重量。含有本發明三椏烏藥提取物的組合物還可含有組合物製備中常用的合適的載體、 賦形劑和稀釋劑。本發明的提取物的藥物劑型可以藥用鹽的形式使用，也可單獨使用，或與其它藥 物活性化合物適當組配以複合物的形式使用。含有本發明提取物的藥物組合物可根據常規方法分別製備成口服製劑例如粉末、 顆粒劑、片劑、膠囊劑、懸浮液、乳液、糖漿和氣霧劑，也可製成局部製劑、栓劑和無菌注射液 後使用。至於可包含於含提取物的組合物的載體、賦形劑和稀釋劑，可提及的有乳糖、右旋 糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、海藻酸鹽、明膠、磷 酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、非結晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、 羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂，及礦物油。就製劑的配製而言，可使用常規使用的稀釋劑或賦形劑，例如填充劑、膨脹劑、粘 合劑、潤溼劑、崩解劑和表面活性劑。口服固體製劑的示例包括片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊等，這些固體製劑通過混 合至少一種賦形劑例如，澱粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等前述提取物中製得。此外，除了簡 單的賦形劑之外，也可使用乳化劑例如硬脂酸鎂和滑石粉。口服液體製劑的示例包括懸浮液、內用液體、乳液、糖漿等。這些液體製劑可包括 各種賦形劑，例如，潤溼劑、甜味劑、香精、防腐劑等，此外，水和液體石蠟是常規使用的簡單 稀釋劑。胃腸外給藥的製劑的示例包括菌水溶液、非水溶液、懸浮液、乳液、凍幹製劑和栓劑。作為非水溶劑或懸浮劑，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、注射酯如油酸乙酯 等。作為栓劑的底料，半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐溫、可可黃油、月桂精脂肪 (laurin fat)、甘油明膠等均可使用。本發明提取物優選的給藥劑量可根據患者體重、疾病的嚴重程度、藥物劑型、給藥 途經和周期變化有所不同，但可由本領域技術人員對此進行適當的選擇。然而，為了得到更 好的效果，施予本發明提取物的理想的劑量為每天0. 0001-100mg/kg，優選0. OOl-IOOmg/ kg。可一天給藥一次或一天給藥七次。給藥劑量絕不限於本發明的範圍。本發明提供一種功能保健食品，其含有具有預防心血管疾病作用的前述提取物， 和可食用的食品添加劑。對於可添加三椏烏藥提取物的功能保健食品。例如，可提及各種普通食品、飲料、 口香糖、茶葉、維生素複合物等。為了獲得預防心血管疾病的效果，也可將三椏烏藥提取物添加到食品或飲料中。 在這種情況下，食品或飲料中的提取物含量基於食品的總重量為0. 01-15 %。保健飲料中的 提取物含量相對於飲料的總重量IOOg可為0. 02-5g，優選0. 3-lg。本發明的功能保健飲料組合物除了含有指定比例的提取物作為必需成分外，對含 有的其它組分並不特別限定，其可含有其它成分，例如傳統飲料常用的各種芳香劑或天然 碳水化合物。上述天然碳水化合物的示例包括常見的糖，例如單糖，例如葡萄糖，果糖等，雙 糖，例如麥芽糖，蔗糖等，以及多糖，如糊精，環糊精等，和糖醇例如木糖醇、山梨醇和赤蘚糖 醇。除了前述的試劑之外，可作為芳香劑善加使用的還有奇異果甜蛋白、甜葉菊提取物，例 如萊鮑迪甙Adevaudioside A)、甘草酸等；以及合成的芳香劑，如，糖精、阿斯巴甜等。碳 水化合物的比例通常為每100克本發明的組合物，約1至20克，優選約5至12克。除了這些，本發明的提取物可含有各種營養素、維生素、礦物質(電解質)、合成和 天然芳香劑、著色劑和加重劑(奶酪、巧克力等)、果膠酸及其鹽、藻朊酸及其鹽、有機酸，保 護性膠體增稠劑、PH值調節劑、穩定劑、防腐劑、甘油、醇，用於碳酸飲料的碳酸化劑等等。除 了這些之外，本發明的提取物可含有天然果汁、以及製備果汁飲料和蔬菜飲料用的果肉。這 些成分可以單獨或組合使用。在這種情況下，添加劑的比例並不重要，但通常選擇每100重 量份本發明的提取物，含0. 01至約20份添加劑。以下，將參照下述實施例和實驗例對本發明作更具體地描述。實施例1 三椏烏藥 耜提物的製備將從江原道(Kangwon-do)省採集的三椏烏藥的樹枝和葉子用水衝洗去除雜質和 鹽。然後乾燥粉碎。在提取容器中，加入每份25g粉碎的三椏烏藥的樹枝或粉碎的樹葉，和 總量500mi 70wt%的乙醇水溶液，在回流冷卻下於70°C進行熱提取，重複三次，每次三小 時。所得產物用濾紙過濾，並將濾液在40°C水浴中減壓濃縮並凍幹。結果，得到了 6. 4g三 椏烏藥樹枝粗提物和7. Og三椏烏藥樹葉粗提物。實施例2 三椏烏藥粗提物的餾分的製備將實施例1獲得的三椏烏藥的葉和枝的粗提物，每份5g，分別懸浮於50ml純淨水 中，按己烷、乙酸乙酯和正丁醇的順序，每種溶劑50ml，對所得產物分別進行順序溶劑分提， 提取三次，分別得到各溶劑的餾分，將這些餾分減壓濃縮。結果得到了三椏烏藥的己烷餾 分、乙酸乙酯餾分和正丁醇餾分。
1 三tf烏藥ffl提物對NAD(P)H氧北_舌{牛的抑制效果的測涼對上述實施例1和實施例2得到的三椏烏藥粗提物和餾分抑制NAD(P) H氧化酶活性的效果進行測定，NAD(P)H氧化 酶為心血管疾病發 展的指標酶。為此目的，採用大白鼠的動脈平滑肌細胞(大鼠動脈平滑肌細胞 ；RASMC)和牛血管內皮細胞(牛主動脈內皮細胞 ；BAECs)比較NAD(P)H氧 化酶活性的變化。結果參見表1。首先，將動脈平滑肌細胞和血管內皮細胞分別與MEM(最基 本培養基)、DMEM ( Dulbecco's最基本培養基)和10% FBS (胎牛血清)溶液混 合，並將這些細胞在5% C02/37°C條件下分別置於96孔板中培養24小時。然後在不含FBS 的培養液中再培養24小時。穩定細胞後，將其用HBSS (Hank' s平衡鹽溶液)衝洗。將這些 細胞與實施例1獲得的三椏烏藥的樹葉提取物或樹枝提取物一起振蕩，然後使所得混合物 反應15分鐘，再用HBSS衝洗。隨後，向反應液中加入IOOmMNAD(P)H和5μ M光澤精 (Lucigenin)，使用螢光讀數器(Victor Light, PerkinElmer)測量NAD (P) H氧化酶的活性 1小時。本實驗重複3次，而每次操作重複2-7次。隨後比較對照組 和 樣品處理組的活性，計算IC50值。IC50值為實驗材料的濃度，以yg/ml表示，在此濃度下， 50% NAD (P) H氧化酶活性受到抑制。表1三椏烏藥提取物對NAD (P) H氧化酶活性的抑制效果(單位μ g/ml)
權利要求
一種用於防治心血管疾病的組合物，其含有三椏烏藥(Lindera obtusiloba)的提取物作為活性成分。
2.根據權利要求1所述的防治心血管疾病的組合物，其中所述三椏烏藥選自樹枝、樹 葉及其混合物。
3.根據權利要求1所述的防治心血管疾病的組合物，其中，所述三椏烏藥的提取物由 選自水、C1-C5低級醇及其混合物的溶劑提取得到。
4.根據權利要求3所述的防治心血管疾病的組合物，其中，所述三椏烏藥的提取物由 30-95wt %的乙醇水溶液提取得到。
5.根據權利要求3所述的防治心血管疾病的組合物，其中，所述三椏烏藥的提取物由 選自水、C1-C3低級醇及其混合物的溶劑提取，並用丁醇再提取得到。
6.根據權利要求1所述的防治心血管疾病的組合物，其中，所述三椏烏藥的提取物具 有NAD (P) H氧化酶抑制活性。
7.根據權利要求1所述的防治心血管疾病的組合物，其中，所述三椏烏藥的提取物具 有血管舒張作用。
8.根據權利要求1所述的防治心血管疾病的組合物，其中，所述三椏烏藥的提取物具 有增強內皮型一氧化氮合酶活性的作用。
9.根據權利要求1-8任一項所述的防治心血管疾病的組合物，其中，所述心血管疾病 選自下組充血性心臟病、冠狀動脈疾病(心臟病)、缺血性心臟疾病(心肌缺血)、高脂血 症、動脈硬化、高血壓、低血壓、心律失常、心力衰竭、血管再狹窄、腦血管疾病(中風、老年 痴呆症)、周圍性血管疾病和代謝性疾病。
10.一種用於預防心血管疾病的功能保健食品，其含有活性成分三椏烏藥提取物。
全文摘要
本發明涉及用於防治心血管疾病的組合物，所述組合物含有三椏烏藥(lindera obtusiloba)的提取物。更具體地，所述三椏烏藥提取物能強烈抑制作為血管病主要誘因的NAD(P)H氧化酶，並同時調節血管平滑肌的收縮和舒張，表現出強力的舒張血管效應，從而能改善血壓調節以及血管內皮功能障礙。因此，含有三椏烏藥提取物作為活性成分的組合物可有效地用於防治心血管疾病。
文檔編號A61K36/9068GK101951934SQ200880125071
公開日2011年1月19日 申請日期2008年12月17日 優先權日2008年1月18日
發明者孫正德, 崔雲善, 李廷鈺, 李正根, 林智雄, 玉珉鎬, 金鐘勳 申請人:楊智化學(株);韓和製藥(株)